REPLIKACJA DNA
Mechanizm Mechanizm
konserwatywny semikonserwatywny
nić rodzicielska
nić potomna
Polimerazy DNA
Polimeraza DNA I
(DNA)n resezt+ dNTP (DNA)n+1 + PPi
wymagania:
prekursory dATP, dGTP, dTTP, dCTP + jony Mg2+
matryca w postaci DNA (ssDNA)
starter z wolnÄ… grupÄ… 3 -OH º% krótki odcinek RNA
synteza łańcucha DNA zachodzi w kierunku 5 3
Reakcja wydłu\
ania łańcucha katalizowana przez
polimerazy DNA
 aktywność edytorska  aktywność 3 5 egzonukleazy
aktywność 5 3 egzonukleazy
egzonukleaza 3 5 egzonukleaza 5 3
PROCARYOTA
Polimerazy DNA
Polimeraza I Polimeraza III Polimeraza II
masa [kDa]
103 900 120
liczba czÄ…st. w kom.
400 10-20 ok. 40
akt. katalit.:
polimeraza 5  3
+ + +
egzonukleaza 3  5
+ + +
egzonukleaza 5  3
+ - -
procesywność
niska b. wysoka nie dotyczy
potencjał katalityczny
ok. 10/s >1000/s nie dotyczy
wierność
5x107 5x109 nie dotyczy
funkcja biologiczna
synteza naprawa
usuwanie primerów,
synt. i napr. DNA
DNA
DNA
PROCARYOTA
Proces replikacji
pojedyncze miejsce inicjacji  miejsce ori
synteza DNA zachodzi dwukierunkowo
5 3
replikacja semikonserwatywna
oczko replikacyjne widełki replikacyjne
PROCARYOTA
Schemat widełek replikacyjnych
3
nić
rodzicielski
prowadzÄ…ca
DNA
fragmenty Okazaki
nić opóz
niona
5
PROCARYOTA
Miejsce OriC
tandemowo powtórzone
miejsca wiÄ…zania dla
13-nukleotydowe sekwencje
białka dnaA
(bogate w AT)
sekwencja zgodna
PROCARYOTA
białka SSb
proces ten wymaga aby
DNA był ujemnie
superhelikalny
PROCARYOTA
matryca DNA
prymaza
starter RNA
polimeraza DNA III
nowy zsyntetyzowany DNA
PROCARYOTA
Holoenzym polimerazy DNA III
PROCARYOTA
helikaza
białka wią\
Ä…ce
prymosom
jednoniciowy DNA
prymaza
holoenzym
polimerazy DNA III
polimeraza
DNA I
ligaza DNA
nić
nić
prowadzÄ…ca
opóz
niona
PROCARYOTA
Nić opóz
niona  tworzenie fragmentów Okazaki
DNA matrycowy
nowo zsyntetyzowana
primer
nić DNA
RNA
fragmenty Okazaki
Eucaryota º% 100-250 nukleotydów
Procaryota º% 1000-2000 nukleotydów
PROCARYOTA
Zapętlenie w widełkach
replikacyjnych
polimeraza DNA III
Białka biorące udział w replikacji DNA u E. Coli
Białko Gen Funkcja
tworzÄ… kompleks i owijajÄ…c DNA wprowadzajÄ…
dnaA
dnaA
naprÄ™\
enia
helikaza
rozplata podwójną helisę
dnaB
prymaza
syntetyzuje starterowy odcinek RNA
dnaG
SSB
stabilizuje regiony jednoniciowe
gyraza DNA
wprowadza ujemne skręty superhelikalne
polimeraza DNA III dnaE
syntetyzuje DNA
dnaQ
usuwa startery i wypełnia brakujące fragmenty
polimeraza DNA I
nici DNA
ligaza DNA
łączy końce DNA
topoizomeraza
wprowadza dodatnie superskręty
EUCARYOTA
Proces replikacji
replikacja chromosomowego DNA  faza S
synteza DNA zachodzi dwukierunkowo
replikacja semikonserwatywna
start
mitoza
EUCARYOTA
wiele miejsc poczÄ…tku replikacji
oczko replikacyjne
replikon
DROśDśE
ARS = sekwencja warunkujÄ…ce autonomicznÄ… replikacjÄ™
ORE = element replikacyjny miejsca inicjacji
kompleks ORC = kompleks rozpoznajÄ…cy miejsce inicjacji replikacji
czynniki upowa\
niajÄ…ce
DUE = element rozplatający DNA = miejsce rozpoczęcia repliakcji
EUCARYOTA
Polimerazy DNA
polim.Ä… polim.´ polim.µ polim.² polim.Å‚
masa [kDa]
160-
>250 170 256 40
300
miejsce
jÄ…dro jÄ…dro jÄ…dro JÄ…dro mitoch.
akt. katalit.:
" polimeraza
"
"
"
+ + + + +
" egzonukleaza 3 -5
"
"
"
- + + - +
" prymaza
"
"
"
+ - - - -
potencjał katalit.
- wysoki wysoki - wysoki
wierność
wysoka wysoka wysoka niska wysoka
" synteza DNA
"
"
"
funkcja biologiczna
synteza
synteza
(nić opóz
n.)
DNA
naprawa naprawa mitoch.
" synteza
"
"
"
(nić wiodąca)
DNA
starterów
Fazy replikacji DNA w komórkach eukariotycznych
1. Identyfikacja miejsc poczÄ…tku replikacji
2. Rozplecenie dsDNA w celu utworzenia matrycy ssDNA
3. Utworzenie widełek replikacyjnych
4. Inicjacja syntezy DNA i elongacja
5. Utworzenie  banieczek replikacyjnych i ligacja zsyntetyzowanych fragmentów
6. Odtworzenie struktury chromatynowej
Klasy białek biorących udział w replikacji
polimeryzacja deoksynukleotydów
Polimerazy DNA
rozplatanie DNA
Helikazy
usuwanie + superskrętów powstałych
Topoziomerazy
w trakcie rozplatania przez helikazÄ™
synteza starterów RNA
Prymaza DNA
zapobieganie przedwczesnej
Białka wią\
Ä…ce ssDNA
renaturacji dsDNA
uzupełnianie jednoniciowych ubytków
Ligaza DNA
pomiędzy powstającym łańcuchem
i fragmentami Okazaki
EUCARYOTA
Replikacja telomerów
telomeraza
matryca RNA
ELONGACJA
nukleotyd
telomeraza
matryca RNA
TRANSLOKACJA
nukleotyd
Inhibitory replikacji
Nazwa Mechanizm
Grupa związków Preparaty
miedzynarodowa działania
chinolony stos. w kwas nalidyksowy Nevigramon
zak. dróg mocz.
kwas oksolinowy Gramurin
wpływają na cięcie
kwas pipemidowy Palin, Pipram i Å‚Ä…czenie przez
gyrazÄ™
fluorochinolony ciprofloksacyna Ciprobay, Ciprinol
pefloksacyna Abaktal, Peflacine
antybiotyki mitomycyna działa alkilująco
cytostatyczne
antracykliny tworzy stabilne
kompleksy z DNA
aktynomycyna D (w wysokich
stÄ™\
eniach)
inne nowobiocyna zapobiega
wiÄ…zaniu ATP do
gyrazy
TRANSKRYPCJA
nić kodująca
gen
nić matrycowa
mRNA
nić matrycowa (-)
nić kodująca (+)
Polimerazy RNA
(RNA)n reszt+ NTP (RNA)n+1 + PPi
wymagania:
matryca w postaci DNA
prekursory ATP, GTP, UTP, CTP
dwuwartościowy jon metalu Mg2+ lub Mn2+
synteza łańcucha RNA zachodzi w kierunku 5 3
nie wymagajÄ… startera
nie mają aktywności nukleazowej
 pierwszym nukleotydem w transkrypcie jest pppG lub pppA
Etapy transkrypcji
1. INICJACJA - zwiÄ…zanie enzymu z miejscem promotorowym i utworzenie
kompleks inicjujÄ…cego
2. ELONGACJA  synteza czÄ…steczki RNA na matrycy DNA
(substraty: 5 -trifosforany rybonukleotydów
T U
matryca: nić matrycowa = nić antysensowna)
3. TERMINACJA  zatrzymanie syntezy (sygnały terminacji) i uwolnienie
zsyntetyzowanego RNA
PROCARYOTA
Zale\
na od DNA polimeraza RNA = RNAP
podjednostka gen liczba masa rola
wiÄ…\
e białka regulatorowe
37 kDa
rpoA 2
Ä…
tworzy wiÄ…zania fosfodiestrowe
151 kDa
rpoB 1
²
wiÄ…\
e matrycÄ™ DNA
155 kDa
rpoC 1
²
rozpoznaje promotor i inicjuje
Ã70
70 kDa
rpoD 1
syntezÄ™
większość genów E.coli
PROCARYOTA
Miejsce promotorowe
JEDNOSTKA
TRANSKRYPCYJNA
promotor region przepisywany
miejsce startu
transkrypcji
Nić kodująca
sygnały
terminacji
Nić matrycowa
sekwencje
sekwencje
flankujÄ…ce 5
flankujÄ…ce 3
PROCARYOTA
Inicjacja
PROCARYOTA
Inicjacja
dwuniciowa helisa
rozwinięty odcinek
DNA
DNA (17pz)
polimeraza RNA
PROCARYOTA
Elongacja  model bÄ…bla transkrypcyjnego
polimeraza RNA
nić matrycowa nić kodująca
rozwijanie
zwijanie
miejsce
tworzÄ…cy
hybrydowa helisa
elongacji
siÄ™ RNA
RNA_DNA
ruch polimerazy
PROCARYOTA
Terminacja
struktura spinki
polimeraza RNA
białko
rho
jÄ…dro
cytozol
transport
rybosom
rybosom
nowo
nowo
syntetyzowane
syntetyzowane
białko
białko
komórka PROKARIOTYCZNA komórka EUKARIOTYCZNA
EUCARYOTA
Polimerazy RNA u Eucaryota
Amanita phalloides
Wpływ
Typ Umiejscowienie Transkrypty komórkowe
Ä…-ammanityny
jÄ…derko rRNA 18S, 5.8S i 28S niewra\
liwa
I
nukleoplazma prekursory mRNA i snRNA b. wra\
liwa
II
wra\
liwa na du\
e
nukleoplazma tRNA, 5S rRNA
III
stÄ™\
enia
EUCARYOTA
Miejsce promotorowe - polimeraza RNA II
matryca DNA
5
sekwencja CAAT sekwencja
miejsce startu
TATA
transkrypcji
EUCARYOTA
Miejsce promotorowe - polimeraza RNA II
ekspresja regulowana ekspresja podstawowa
sekwencje
sekwencje
proksymalne
regulatorowe
PROMOTOR
względem
dystalne
promotora
elementy
proksymalne
inne elementy
względem
wzmacniajÄ…ce
sekwencje
region kodujÄ…cy
TATA
promotora
i wyciszajÄ…ce
regulatorowe
GC/CAAT itp.
EUCARYOTA
Inicjacja - polimeraza RNA II
matryca DNA
podstawowe czynniki transkrypcyjne
TFII (transcription factor II) =GTF
TFIID  kluczowa podjednostka TBP
TFIIA
TFIIB
TFIIF
TFIIE, H, J
EUCARYOTA
sekwencje
wzmacniajÄ…ce
pętla DNA
EUCARYOTA
Synteza RNA
inicjacjÄ… syntezy RNA kieruje miejsce promotorowe
polimeraza RNA przepisuje na RNA tylko jedną nić dwuniciowej
matrycy DNA  nić antysensowną
synteza RNA nie wymaga startera
synteza RNA przebiega w kierunku 5 3
treminacja
EUCARYOTA
gen 5S rRNA
blok A blok C
Polimeraza RNA III
pol RNA III
transkrypcja
EUCARYOTA
Polimeraza RNA III
gen dla tRNA
blok A blok B
pol RNA III
transkrypcja
EUCARYOTA
Polimeraza RNA I
sekwencja nie ulegajÄ…ca transkrypcji
jednostka
transkrypcyjna rRNA
jednostka transkrypcyjna
18S 5,8S 28S
DNA
transkrypcja
pojedynczej
transkrypcja (pol RNA I)
jednostki
transkrypcyjnej
pre-rRNA
prowadzona przez
pol RNA I
dojrzewanie RNA
(RNazy)
oraz dojrzewanie
pre-rRNA
dojrzałe
czÄ…steczki rRNA
18S rRNA 5,8S rRNA 28S rRNA
Inhibitory transkrypcji
Związek Mechanizm działania
ryfampicyna blokuje podj. ² º% blokuje inicjacjÄ™, nie pozwala na utworzenie
pierwszego wiÄ…zania fosfodiestrowego
streptolidygina blokuje podj. ² º% blokuje elongacjÄ™
heparyna blokuje podj. ² º% blokuje wiÄ…zanie DNA
aktynomycyna D wiÄ…\
e się ściśle z ds DNA, uniemo\
liwia rozpoczęcie
transkrypcji
ą ammanityna hamuje polimerazę II na etapie elongacji, w większych
stÄ™\
eniach działa te\
na polimerazÄ™ III
LEKI
LEKI
działające przez
interkalatory
cięcie łańcucha
czynniki alkilujÄ…ce
INTERKALATORY DNA
hamujÄ… replikacjÄ™ i transkrypcjÄ™
cząsteczki leków są: płaskie, mają charakter
aromatyczny lub heteroaromatyczny
są zdolne do wniknięcia pomiędzy warstwy
par zasad kwasów nukleinowych
i rozerwania podwójnej helisy
proflawina
INTERKALATORY DNA
AKTYNOMYCYNA D
Sar  sarkozyna
MeVal  N-metylowalina Val
zawiera grupę barwnikową (kwas fenoksazonodikarboksylowy), która połączona
jest wiÄ…zaniami peptydowymi z dwoma pentapeptydami
jest specyficznym inhibitorem syntezy RNA zarówno w komórkach
prokariotycznych, jak i eukariotycznych
pierścień fenoksazonowy aktynomycyny interkaluje, czyli wślizguje się
pomiędzy
pary zasad GC w dwuniciowym DNA, natomiast cykliczne polipeptydy wystajÄ…
jeden ponad, a drugi pod pierścieniem fenoksazonowym.
INTERKALATORY DNA
ADRIAMYCYNA
(Doksorubicyna)
lek tworzy tertacykliczny układ, w którym trzy pierścienie są płaskie
i mogą się dopasowywać do rowka większego podwójnej helisy.
grupa aminowa przyłączona do cukru odgrywa wa\
nÄ… rolÄ™ w czasie lokowania
siÄ™ antybiotyku w odpowiednim miejscu, poniewa\
po zjonizowaniu mo\
e
tworzyć się wiązanie jonowe z ujemnie naładowanymi resztami fosforanowymi
na szkielecie DNA
INTERKALATORY DNA
CHININA
CHLOROCHININA
chinina - alkaloid o gorzkim smaku, znajdujÄ…cy siÄ™ w korze drzewa chinowego
pierwszy skuteczny lek przeciw malarii
posiada równie\
własności przeciwgorączkowe, przeciwzapalne i przeciwbólowe
działa poprzez tworzenie kompleksów z DNA zarodz
ca malarycznego, co
uniemo\
liwia prawidłowe funkcjonowanie jego komórek - nie wykazuje działania
na wewnątrzkomórkowe postacie zarodz
ca.
obecnie została zastąpiona środkami o mniejszych działaniach ubocznych
CZYNNIKI ALKILUJ
CE
obecność grup metylowych, etylowych i innych w tych związkach, powoduje
alkilacjÄ™ zasad azotowych
reagujÄ… one z grupami nukleofilowymi DNA tworzÄ…c wiÄ…zania kowalencyjne
największą wra\
liwość na alkilację wykazuje atom azotu (N7) guaniny
pod wpływem tych związków obserwuje się liczne tranzycje i transwersje
typu: ATTA, ATGC, GCCG, GCAT, GCTA
CZYNNIKI ALKILUJ
CE
leki z dwiema grupami alkilującymi mogą reagować z grupami
guaniny na obu niciach helisy i wiązać je krzy\
owo w taki sposób,
\
e nie mogą się rozpleść w czasie replikacji lub transkrypcji
alternatywą jest wiązanie przez lek dwóch grup guaninowych na
tej samej helisie, co sprawia, \
e lek jest przyczepiony do jednej
strony helisy DNA jak rzep; przyłączenie tego typu mo\
e
maskować tę część DNA i blokować dostęp enzymów potrzebnych
do przeprowadzanie procesu transkrypcji i replikacji
mo\
liwe jest równie\
 odkodowanie guaniny, która występuje
zwykle w formie ketotautomeru i tworzy parÄ™ z cytozynÄ…; po
alkilacji guanina preferuje grupÄ™ enolowÄ… i mo\
e utworzyć parę z
tyminÄ…; takie  odkodowanie prowadzi ostatecznie do zmiany
sekwencji aminokwasów białka, czyli zaburza proces translacji
CZYNNIKI ALKILUJ
CE
czynniki alkilujące nie działają selektywnie
bardzo aktywne i mogą reagować z jakimkolwiek nukleofilem
alkilują białka i inne makrocząsteczki
są one stosowane w leczeniu nowotworów poniewa\
komórki
nowotworowe dzielÄ… siÄ™ szybciej ni\
zdrowe i zakłócenie funkcji
DNA w komórkach nowotworowych jest znacznie większe
CZYNNIKI ALKILUJ
CE
CISPLATYNA
cisplatyna silnie wiÄ…\
e DNA w rejonie
zawierajÄ…cym wiele jednostek guanidyny
w taki sposób, \
eby tworzyć wiązania
wewnątrz helisy - następuje odwijanie
helisy i transkrypcja zostaje zahamowana
skuteczny lek przy leczeniu nowotworów
jąder i jajników
chemioterapeutyk fazowo-
niespecyficzny, swoisty dla cyklu
komórkowego
CZYNNIKI ALKILUJ
CE
MITOMYCYNA C
lek przeciwnowotworowy, który dopiero
w organizmie zostaje przekształcony w czynnik alkilujący
alkiluje reszty guaniny helisy DNA, co hamuje replikacjÄ™ DNA
i podział komórek
Leki działające przez CI
CIE A
AC
CUCHA DNA
Bleomycyna
stosunkowa du\
a glikoproteina, która wydaje się być
zdolna do cięcia helisy DNA oraz uniemo\
liwiania ligazie
DNA naprawy wyrzÄ…dzonej szkody
jej działanie polega na odrywaniu atomów wodoru z
DNA; powstajÄ…ce rodniki reagujÄ… z tlenem, tworzÄ…c
cząsteczki nadtlenku, które powodują fragmentację
DNA
lek jest skuteczny w leczeniu niektórych nowotworów
skóry
tnie ssDNA i hamuje naprawÄ™ przez
hamowanie aktywności ligazy DNA
Leki przeciwwirusowe
antymetabolity puryn
i pirymidyn
aminy cykliczne
inhibitory polimerazy
i odwrotnej transkryptazy
Antymetabolity puryn i pirymidyn
ACYKLOWIR
analog nukleotydów purynowych posiadający
dodatkowy łańcuch boczny, hamuje
aktywność wirusowej polimerazy DNA
wirusowa kinaza tymidylanowa ma kilkaset
razy większe powinowactwo do acyklowiru
ni\
ludzka, stąd lek nie wpływa na syntezę
ludzkiego DNA
działa na wirusy HSV, VZV, CMV i EBV
GANCYKLOWIR
podobne działanie do acyklowiru, bardzo
skuteczny w stosunku do CMV
ACYKLOWIR
Antymetabolity puryn i pirymidyn
RYBAWIRYNA
analog puryn
po uprzedniej fosforylacji mo\
e zostać wbudowany do RNA
zarówno jako G lub A (zale\
y od ustawienia przestrzennego czÄ…steczki)
powoduje to powstawanie letalnych mutacji w trakcie RNA zale\
nej
replikacji RNA w wirusach
mechanizm działania w wirusach DNA jest mniej jasny, wydaje się
jednak, \
e 5 -monofosforan rybawiryny hamuje dehydrogenazÄ™
monofosforanu inozyny i w ten sposób zmniejsza komórkową pulę GTP
działa na wirusy grypy A i B, RSV, HAV, HBV i HCV
WIDARABINA
arabinozyd adeniny
hamuje aktywność wirusowej polimerazy DNA po uprzedniej
fosforylacji
Aminy cykliczne
AMANTYDYNA
hamuje wnikanie wirusa grypy A2 do komórek, kapsydację, uwalnianie
z komórek, jak równie\
replikacjÄ™ wirusowego DNA
RIMANTYDYNA
podobne działanie do amantydyny
Inhibitory polimerazy i RT
FOSKARNET SODOWY
inhibitor polimerazy wirusów HSV, VZV, CMV, EBV, HBV oraz
odwrotnej transkryptazy HIV
AZT (azydotymidyna)
analog T, po fosforylacji przez kinazÄ™ tymidylanowÄ… powstawanie
DNA wirusa przez przyłączenie się na końcu nowopowstającego
łańcucha, co hamuje hamuje odwrotną transkryptazę HIV
ZIDOWUDYNA
analog AZT, podobny mechanizm działania
ABAKAWIR
analog G, hamuje odwrotna transkryptazÄ™ wirusa HIV
AZT (Azydotymidyna)
lekie działający przewwirusowo
zawiera w swojej strukturze elementy podobne do
nukleozydów
AZT był pierwszym zatwierdzonym lekiem na AIDS
ten analog tymidyny ulega fosforylowaniu do
trifosforanu
hamuje on działanie odwrotnej transkryptazy,
potrzebnej do syntezy DNA wirusa
powstający trifosforan przyłącza się do rosnącego
łańcuch DNA, a poniewa\
jednostka cukrowa zawiera
podstawnik azydkowy zamiast wymaganej grupy
hydroksylowej, łańcuch nie mo\
e być przedłu\
ony
Chemioterapeutyki
AZATIOPRYNA
pochodna 6-merkaptopuryny
antymetabolit puryn
wbudowuje siÄ™ do DNA zamiast dGTP
hamuje replikacjÄ™
ARABINOZYD CYTOZYNY
hamuje kompetycyjnie polimerazÄ™ DNA
5-AZACYTYDYNA
po uprzedniej fosforylacji wbudowuje siÄ™ do RNA w trakcie
transkrypcji
analog nie mo\
e być odczytany w czasie translacji co powoduje
przedwczesną terminację syntezy białek