Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
CYTOMETRIA PRZEPA
YWOWA
Przeciwciała (Ab) - białka należące do frakcji gammaglobulin
Odgrywa zasadniczą rolę w fenotypowaniu komórek
syntetyzowane przez komórki plazmatyczne (pobudzone limfocyty
B) w przebiegu odpowiedzi immunologicznej, swoiste dla immunokompetentnych człowieka.
rozpoznawanego Ag.
Przeciwciała monoklonalne (mAb) - skierowane przeciwko jednej
Jest to możliwe dzięki szerokiemu panelowi dostępnych
determinancie antygenowej (determinanta=epitop, miejsce
przeciwciał monoklonalnych (mAb) skierowanych
wiÄ…zania Ag z Ab)
przeciwko obecnym na komórkach Ag różnicowania, CD
(cluster of differentiation), którymi znakuje się
Schemat przeciwciała:
1. fragment wiążący antygen
struktury w zawiesinie komórek poddawanych analizie.
2. region Fab
3. region Fc
niebieskie - łańcuchy ciężkie
żółte - łańcuchy lekkie
Ocena subpopulacji komórek tą techniką jest obiektywną
ciemnoniebieskie/żółte - regiony zmienne
jasnoniebieskie/żółte - regiony stałe
szare - mostki dwusiarczkowe i powtarzalnÄ… metodÄ… diagnostycznÄ….
CYTOMETRIA PRZEPA
YWOWA
CYTOMETR PRZEPA
YWOWY
Analiza wieloparametrowa jednej
komórki w aparacie, w momencie
gdy ruch komórek w cieczy jest
uporzÄ…dkowany
´komórki siÄ™ nie zlepiÄ…, bÄ™dÄ…
oddzielne w słupie
´na pojedynczÄ… komórkÄ™ pada
laser w komorze pomiarowej
PRZEPA
YW KOMÓREK W APARACIE MIERZONE PARAMETRY
Podstawowym pomiarem jest rejestrowanie światła
tu nakładamy
rozproszonego na komórce oraz światła wysyłanego przez
próbkę
wzbudzony fluorochrom. Detektory mierzą światło rozproszone.
ciecz osłaniająca
FSC (forward scatter)- pomiar światła rozproszonego, mierzonego w
przedłużeniu promienia lasera, światło pada prawie pod katem 0p -
charakteryzuje wielkość komórki
fluorescencja
fluorescencja
SSC (side scatter)- pomiar światła rozproszonego, mierzone pod kątem
90p - pozwala na analizę ziarnistości komórki
promień lasera Oprócz parametrów opisujących rozproszenie światła, istotnym pomiarem
promień lasera
jest ocena intensywności fluorescencji FL (FL1, FL2& ). Pomiar
fluorescencji zależy od autofluorescencji komórek oraz użytych fluorochromów.
Purdue University Cytometry
Laboratories
1
Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
BUDOWA CYTOMETRU DETEKTORY FLUORESCENCJI
układ transportu cieczy powiązany z układem
powietrznym
detektor
układ optyczny: laser argonowy, filtry przepuszczające
przedni
promienie światła tylko o określonej długości
laser
układ elektroniki: fotopowielacze, wzmaczniacze,
przetwornik analogowo- cyfrowy
Fluorescence
detektory fluorescencji
(PMT3, PMT4 etc.)
OCENIANE PARAMETRY OCENIANE PARAMETRY
STRUKTURALNE
STRUKTURALNE
FUNKCJONALNE
rozmiar
rozmiar
Å‚adunek powierzchniowy
Å‚adunek powierzchniowy
kształt
kształt
ekspresja receptorów powierzchniowych
ekspresja receptorów powierzchniowych
cytoplazmatyczna ziarnistość
cytoplazmatyczna ziarnistość
integralność błony (żywotność)
integralność błony (żywotność)
zawartość barwnika np.: hemoglobina, barwniki
zawartość barwnika np.: hemoglobina, barwniki
aktywność endocytarna
aktywność endocytarna
fotosyntetyczne, porfiryny
fotosyntetyczne, porfiryny
organizacja cytoszkieletu
organizacja cytoszkieletu
aminokwasy fluoryzujące w białkach np.:tryptofan,
aminokwasy fluoryzujące w białkach np.:tryptofan,
tyrozyna
aktywność enzymów
tyrozyna
aktywność enzymów
zawartość DNA, RNA, wszystkich białek, lipidów,
zawartość DNA, RNA, wszystkich białek, lipidów,
cukrów powierzchniowych, antygenów
cukrów powierzchniowych, antygenów
CYTOMETRIA PRZEPA
YWOWA
Zalety cytometrii:
- szybki, obiektywny i zautomatyzowany pomiar pojedynczych
komórek w dużych populacjach komórkowych, z dużą
powtarzalnością
Schematyczny rozkład leukocytów
- wykrywanie śladowych subpopulacji
na cytogramie FFC/SSC
- równoległa ocena kilku parametrów
- ilościowa i jakościowa ocena stanu układu immunologicznego,
poszczególnych populacji
Wady:
FL1 (izotiocyjanian
- niemożność korelacji wyników pomiarów fluorescencji z morfologią
fluoresceiny FITC)
komórek
- technika przygotowania materiału do badań, wymagająca izolacji
z tkanki pojedynczych komórek
- wysoki koszt badań
2
Freq
FL2 (fikoerytryna PE)
Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
Antygeny różnicowania CD
CD Występowanie Funkcja
CD2 Limfocyty T, tymocyty, komórki Adhezja T do APC,
NK kostymulacja
CD2R Aktywowane limfocyty, NK Aktywacja limfocytów T
CD3 Limfocyty T Przekazywanie sygnału do
limfocytów T
CD4 Limfocyty T pomocniczne (Th), Koaktywacja limfocytów
monocyty (Mo), makrofagi (MØ), Th
tymocyty
CD8 Limfocyty T cytotoksyczne (CTL), Koaktywacja limfocytów
tymocyty CTL
CD14 Monocyty (Mo), granulocyty, Białko wią\
Ä…ce LPS
komórki Langerhansa, makrofagi
(MØ)
CD19 Limocyty B, komórki pre-B Aktywacja i proliferacja
limofocytów B
CD20 Limocyty B, komórki pre-B Kanał Ca2+, regulacja,
aktywacja i proliferacja
limfocytów B
CD45 Leukocyty Fosfataza tyrozynowa
biorąca udział w
przekazywaniu sygnałów
CD45RO Aktywowane limfocyty T, Markery limfocytów T
monocyty, makrofagi, granulocyty, pamięci immunologicznej
tymocyty
SUBPOPULACJE KOMÓREK SUBPOPULACJE KOMÓREK
JEDNOJ
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ JEDNOJ
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ
MONOCYTY
Podstawowe markery i cechy fenotypowe linii komórkowych
´mAb: CD45-FITC/CD14-PE
CD45 - marker wszystkich leukocytów
´stanowiÄ… 2-4% wszystkich leukocytów
CD19, CD20 - markery limfocytów B
CD3, CD7 - markery limfocytów T ´majÄ… zdolność do ruchu peÅ‚zakowatego i mogÄ… wydostawać siÄ™
CD4 - marker limfocytów T pomocniczych ze światła naczyń krwionośnych
CD8 - marker limfocytów T supresorowych
´po przejÅ›ciu do tkanek dojrzewajÄ… i przeksztaÅ‚cajÄ… siÄ™ w MØ
CD56 - marker komórek NK
´komórki żerne żyjÄ…ce okoÅ‚o 4 dni
CD25, CD71, CD69 - markery aktywacji limfocytów
CD13, CD33 - markery różnicowania mieloidalnego
CD15 - marker granulocytów
CD14 - marker monocytów
CD34 - podstawowy marker komórek progenitorowych
(macierzystych)
SUBPOPULACJE KOMÓREK SUBPOPULACJE KOMÓREK
JEDNOJ
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ JEDNOJ
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ
LIMFOCYTY B
LIMFOCYTY T
´mAb: CD2-FITC/CD19-PE
´T pomocnicze - T helper (Th):
´postajÄ… i dojrzewajÄ… w szpiku
ółmAb: CD3-FITC/CD4-PE
´bardzo dużo limfocytów B wystÄ™puje w czasie infekcji
ółwspomagają odpowiedz
immunologicznÄ… poprzez wydzielanie
bakteryjnych
mediatorów regulujących funkcje układu odpornościowego
´wiążą Ag za pomocÄ… receptora BCR, nastÄ™pnie przetwarzajÄ… go i (cytokin) lub poprzez bezpoÅ›redni kontakt z innymi
 wystawiają na powierzchnię komórki w postaci kompleksu z komórkami
białkami MHC. Kompleks ten jest rozpoznawany przez swoisty
ółtrzy subpopulacje komórek Th: Th0, Th1 i Th2
względem danego antygenu limfocyt T pomocniczy. Wtedy
dochodzi do transformacji blastycznej i powstaniu komórki
´T supresorowe (Ts):
plazmatycznej produkującej Ab. Ag, które powodują taki typ
ółmAb: CD3-FITC/CD8-PE
reakcji nazywamy antygenami grasicozależnymi. W odróżnieniu
od nich, antygeny grasiconiezależne nie wymagają obecności ółsą odpowiedzialne za hamowanie reakcji immunologicznej
limfocytów T pomocniczych i mogą bezpośrednio aktywować
limfocyty B.
3
Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
SUBPOPULACJE KOMÓREK
OCENA FENOTYPÓW KOMÓREK UKA
ADU
JEDNOJ
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ
ODPORNOÅšCIOWEGO
monitorowanie chorób autoimmunizacyjnych, leczenia
KOMÓRKI NATURAL KILLER (NK)
immunosupresyjnego, po przeszczepach, niedoborów odporności,
głównie przez ocenę struktur powierzchniowych komórek, rzadziej
´mAb: CD3-FITC/CD56-PE
antygenów wewnątrzkomórkowych
´posiadajÄ… wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci cytotoksyczne
´ważne w odpornoÅ›ci przeciw komórkom nowotworowym oraz
komórkom zarażonym przez wirusy
IMMUNOFENOTYPOWANIE LIMFOCYTÓW
´dziaÅ‚ajÄ… nieswoiÅ›cie (wykazujÄ… wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci cytotoksyczne bez
niezbędne w monitorowaniu:
wcześniejszej immunizacji)
- wrodzonych zaburzeń odpowiedzi humoralnej, związanych z
niedoborem limfocytów B: określa się liczbę komórek cechujących
się występowaniem markerów CD19/CD20, będących wykładnikiem
tej populacji
Zakres wartości prawidłowych markerów komórek
OCENA FENOTYPÓW KOMÓREK UKA
ADU
jednojądrowych krwi obwodowej człowieka
ODPORNOÅšCIOWEGO
IMMUNOFENOTYPOWANIE
LIMFOCYTÓW
Komórki-marker CD Wartość średnia Zakres wartości
niezbędne w monitorowaniu:
LIMFOCYTY
[%] [%]
CD4+CD8+
CD4+ 45 35-50
- kondycji immunologicznej chorych z
CD8+ 35 25-45
C
nabytym niedoborem odporności (HIV
CD3+ 50 35-65
D
pozytywnych): ocena subpopulacji
CD2 55 45-65
LIMFOCYTY CD4-
limfocytów CD4 i CD8 oraz 4
CD22 25 20-30
CD8+
współczynnika CD4/CD8 np.:
CD56 15 10-20
CD14 18 10-25
44%/27% - zdrowy (1,63)
Wskaz
nik CD4/CD8 1,4 1,1-1,7
7,7%/54% - pacjent z pełnoobjawowym
CD8
niedoborem odporności (0,14)
OCENA SUBPOPULACJI- pacjent1
ANALIZA
ANALIZA
Kontrola izotypowa
Limf.T CD8
CYTOMETRYCZNA
CYTOMETRYCZNA
Limfocyty B
Limf.T CD4 monocyty
4
Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
OCENA SUBPOPULACJI- pacjent2
Kontrola izotypowa LimfocytyT CD8
LimfocytyT CD4 monocyty
Limfocyty B Komórki NK
(Natural Killer)
5