Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt
Oznaczanie aktywności cytotoksycznej chemoterapeutyków
wobec komórek nowotworowych
Badania aktywności biologicznej chemoterapeutyków prowadzone są na
modelach komórkowych (aktywność cytotoksyczna) lub zwierzęcych (aktywność
przeciwnowotworowa). Do ilościowego określenia aktywności cytotoksycznej najczęściej
wykorzystuje się ró\
nego rodzaju testy komórkowe prowadzone w hodowli in vitro.
Pozwala to ograniczyć ilość badań na zwierzętach, co jest wa\
ne ze względów
humanitarnych. Ponadto mo\
liwości automatyzacji badań pozwala na testowanie wielu
związków, na wielu liniach komórkowych jednocześnie.
Ka\
dy test składa się z tych samych etapów:
1. inkubacji komórek danego typu z badanym związkiem przez określony czas i
przy wzrastających stę\
eniach (zwykle 3-4 cykle podwojenia komórek), w celu
wystąpienia efektu cytotoksycznego działania związku,
2. oznaczenia parametru związanego ze wzrostem (proliferacją) komórek.
Ten ostatni etap odró\
nia poszczególne testy od siebie, poniewa\
oznaczane są ró\
ne
parametry np.:
" ilość komórek,
" zdolność do podziałów komórkowych,
" funkcjonowanie błony komórkowej,
" aktywność mitochondriów,
" inkorporacja barwników do lizosomów,
" całkowita zawartość białka czy DNA w komórce,
" zahamowanie syntezy DNA itd.
Do oznaczania aktywności cytotoksycznej związków stosowanych jest szereg metod
wykorzystujących ró\
norodne barwniki np. MTT, SRB, DAPI, jodek propidyny, błękit
trypanu itd. (tab. 1).
MIERZONY PARAMETR ZASADA POMIARU
barwniki mają zdolność wiązania się z białkami
całkowita zawartość białka komórkowymi np. sulforodamina B,
Coommasie Brilliant Blue
fluorochromy mające zdolność do
całkowita zawartość DNA stechiometrycznego wiązania się z DNA np. DAPI,
Hoechst 33342,
mierzona jest zdolność do redukcji barwnika MTT
Aktywność oksydoredukcyjna mitochondriów
zachodząca w \
ywych komórkach
barwniki wnikają do komórek, których integralność
barwienie martwych komórek błony komórkowej jest naruszona;
np. jodek propidyny, błękit trypanu, erytrozyna B
Tabela 1. Zasady najczęściej stosowanych testów u\
ywanych do oznaczania
aktywności cytotoksycznej.
Ilościowo, aktywność biologiczną związku mo\
na wyrazić na dwa sposoby:
1. Dawka (stę\
enie) wywołujące standardową odpowiedz
biologiczną.
2. % odpowiedzi w stosunku do kontroli przy standardowej dawce (stę\
eniu).
Pierwszy sposób jest najczęściej stosowaną i uznawaną za najbardziej precyzyjną
metodę ilościowego wyra\
ania aktywności biologicznej, w której mo\
na wymienić takie
miary jak:
IC50  inhibitory concentration  stę\
enie hamujące wzrost komórek w 50%
EC50  efective concentration  efektywne stę\
enie związku
ED50  efective dose  dawka efektywna
LD50  lethal dose  dawka związku powodująca śmierć 50% komórek
MIC  minimum inhibitory concentration  minimalne stę\
enie hamujące wzrost
komórek
MTD  maximum tolerated dose  maksymalna tolerowana dawka
W celu wyznaczenia tego typu miar aktywności nale\
y wykonać wykres zale\
ności
zahamowania wzrostu komórek (wyra\
onej jako procent w stosunku do kontroli, którą
przyjmuje się za 100%) od stę\
enia badanego związku (rys.1). Na podstawie liniowego
fragmentu tej zale\
ności wyznacza się trzy wielkości, stanowiące podstawę do oceny
cytotoksyczności badanego związku. Są to:
EC10 - stę\
enie związku, przy którym proliferacja komórek w hodowli in vitro
zostaje zahamowana w 10% w stosunku do komórek kontrolnych
 tzw. pierwsza dawka toksyczna;
EC50 - stę\
enie związku, przy którym proliferacja komórek w hodowli in vitro
zostaje zahamowana w 50% w stosunku do komórek kontrolnych
 tzw. miara cytotoksyczności;
EC90 - stę\
enie związku, przy którym proliferacja komórek w hodowli in vitro
zostaje zahamowana w 90% w stosunku do komórek kontrolnych
 tzw. dawka letalna (śmiertelna);
100
80
60
40
20
EC10 EC50 EC90
0
0,00001 0,0001 0,001 0,01 0,1 1
stę\
enie związku [�M]
Rys.1 Zahamowanie wzrostu komórek w zale\
ności od stę\
enia badanego związku.
WYKONANIE ĆWICZENIA
1. pomiar zahamowania wzrostu komórek, metodą liczenia komórek
Oznaczanie aktywności cytotoksycznej związków metodą liczenia komórek,
polega na wykorzystaniu elektronicznego urządzenia Coulter Counter (rys.2).
Urządzenie to zlicza komórki w zawiesinie, które przechodzą przez specjalny otwór,
zmieniając opór przepływającego prądu. Zmiana tego oporu jest proporcjonalna do
objętości komórki. Powstają w ten sposób pulsy które są wzmacniane i zliczane.
% kontroli
Rys.2 Licznik Coulter Counter [1].
Zawiesinę komórek nale\
y dobrze rozpipetować, pobrać 1 ml do naczynka (do
liczenia komórek) i dodać dwie porcje buforu izotonicznego (2 x 9,5 ml = 19 ml)
(rozcieńczenie próbki komórek wynosi 1:19). Coulter pobiera do liczenia 0,5 ml
roztworu, dlatego te\
wynik z wyświetlacza na Coulterze nale\
y pomno\
yć przez 40, aby
otrzymać ilość komórek w tysiącach/ml.
2. pomiar zahamowania wzrostu liczby komórek z wykorzystaniem aktywności
oksydoredukcyjnej mitochondriów  metoda MTT
Oznaczanie aktywności biologicznej metodą MTT opiera się na zało\
eniu, \
e
tylko w \
ywych komórkach dochodzi do redukcji tego barwnika. W wyniku działania
mitochondrialnej dehydrogenazy \
ółta, rozpuszczalna w wodzie, sol tetrazolowa
(formazan błękitu triazolowego  MTT) przekształcana jest do purpurowych,
nierozpuszczalnych w wodzie kryształów formazanu (rys.3). Ilość wytworzonych
kryształów formazanu jest proporcjonalna do ilości komórek.
Rys. 3 Konwersja MTT do formazanu [2].
MATERIAA
Y I SPRZ
T
1. wybrana linia komórek nowotworowych
2. wyjściowy roztwór badanego związku
3. etanol: 50 % (V/V) roztwór w wodzie
4. MTT: roztwór barwnika w wodzie o stę\
eniu 4 mg/ml
5. DMSO
6. probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml
7. pipety automatyczne
8. rękawiczki
Przygotowanie komórek do doświadczenia:
Komórki w fazie logarytmicznego wzrostu wysiewa się na płytkę 24-studzienkową w
ilości 20 tys.komórek/2 ml po\
ywki na studzienkę, a następnie inkubuje w temperaturze
37�C, 5% CO przez 24 godziny.
2
Przygotowanie roztworów badanego związku:
Roztwory badanego związku przygotowuje się w 50% etanolu w zakresie stę\
eń: 0,05;
0,1; 0,5; 1; 5; 10; 50; 100; 500 �M. Wyjściowe roztwory związku są stukrotnie
stę\
one w stosunku do zało\
onych stę\
eń, gdy\
dodawane są one w objętości 20
�l do 2ml po\
ywki w studzience z komórkami.
Traktowanie komórek badanym związkiem:
Pracując w komorze laminarnej, zapewniającej sterylne warunki pracy, komórki
traktuje się roztworami badanego związku w następujący sposób:
" dwie pierwsze studzienki to komórki słu\
ące jako kontrola i do nich dodaje się 20
�l 50% etanol,
" do następnych studzienek dodaje się kolejne roztwory badanego związku,
począwszy od najni\
szego stę\
enia,
Płytkę umieszcza się w inkubatorze na 72 godziny.
Określenie stopnia zahamowania wzrostu komórek przez badaną substancję:
1. Po 72 godzinach inkubacji komórek ze związkiem, do ka\
dej studzienki dodaje się po
200 �l roztworu barwnika MTT i pozostawia w inkubatorze na 4 godziny.
2. Pod pró\
nią odsysa się delikatnie płyn znad kryształów formazanu i dodaje się po 2
ml DMSO do ka\
dej studzienki.
3. Płytki umieszcza się na orbitalnej wytrząsarce i łagodnie miesza przez 30 minut, aby
kryształy formazanu uległy rozpuszczeniu.
4. Z ka\
dej studzienki z płytki 24-studzienkowej przenosi się po 200 �l roztworu do
dwóch studzienek na płytce 96-studzienkowej.
5. Absorpcję roztworów oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali 540 nm za
pomocą czytnika płytek.
2. pomiar zahamowania wzrostu liczby komórek z wykorzystaniem barwnika
sulforodaminy B (SRB)
Sulforodamina B (SRB) (rys.4) jest anionowym barwnikiem, który wią\
e się z
podstawowymi aminokwasami białek komórkowych. Oznaczanie aktywności
cytotoksycznej w tym teście prowadzi się na podstawie pomiaru ilości białka
komórkowego.
Rys.4 Sól sodowa sulforodaminy B.
MATERIAA
Y I SPRZ
T
1. wybrana linia komórek nowotworowych
2. wyjściowy roztwór badanego związku
3. etanol: 50% (V/V) roztwór w wodzie
4. 50% roztwór kwasu trichlorooctowego (TCA), zimny (4O C)
5. 0.4% (w/V) roztwór sulforodaminy B (SRB) w 1% kwasie octowym
6. 1% kwas octowy
7. 10 mM Tris-base (pH 10,5)
8. probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml
9. pipety automatyczne
10. płytki wielostudzienkowe (24 i 96)
11. lignina
12. rękawiczki
WYKONANIE
Przygotowanie komórek do doświadczenia:
Komórki w fazie logarytmicznego wzrostu wysiewa się na płytkę 24-studzienkową w
ilości 20 tys.komórek/2 ml po\
ywki na studzienkę, a następnie inkubuje w temperaturze
37�C, 5% CO przez 24 godziny.
2
Przygotowanie roztworów badanego związku:
Roztwory badanego związku przygotowuje się w 50% etanolu w zakresie stę\
eń: 0,05;
0,1; 0,5; 1; 5; 10; 50; 100; 500 �M. Wyjściowe roztwory związku są stukrotnie
stę\
one w stosunku do zało\
onych stę\
eń, gdy\
dodawane są one w objętości 20
�l do 2ml po\
ywki w studzience z komórkami.
Traktowanie komórek badanym związkiem:
Pracując w komorze laminarnej, zapewniającej sterylne warunki pracy, komórki
traktuje się roztworami badanego związku w następujący sposób:
" dwie pierwsze studzienki to komórki słu\
ące jako kontrola i do nich dodaje się 20
�l 50% etanol,
" do następnych studzienek dodaje się kolejne roztwory badanego związku,
począwszy od najni\
szego stę\
enia,
Płytkę umieszcza się w inkubatorze na 72 godziny.
Określenie stopnia zahamowania wzrostu komórek przez badaną substancję:
1. Po zakończonej inkubacji przyklejone komórki utrwala się 500 �l zimnego 50% TCA
(4oC) w 4�C przez 1 godzin ę.
2. Ka\
dą studzienkę płucze się wodą z kranu i suszy na powietrzu, powtarzając tą
czynność 5 razy.
3. Do ka\
dej studzienkę dodaje się po 500�l 0,4% roztworu SRB rozpuszczonego w
1% kwasie octowym i barwi się przez 30 minut.
4. Niezwiązany barwnik usuwa się zlewając go przez odwrócenie płytki do góry
nogami. Komórki płucze się 4 razy 1% kwasem octowym. Następnie płytkę suszy się
na powietrzu przez ok. 5 min;
5. Związany barwnik rozpuszcza się poprzez dodanie do ka\
dej studzienki 1500 �l 10
mM Tris-base i miesza się przy u\
yciu orbitalnej wytrząsarki przez 5 minut.
6. Przenosi się po 200 �l roztworu z ka\
dej studzienki z płytki 24-studzienkowej do
dwóch studzienek na płytce 96-studzienkowej;
7. Absorpcję roztworów oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali 490-530
nm za pomocą czytnika płytek.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
1. Obliczyć średnie wartości absorpcji dla ka\
dego stę\
enia badanego związku.
2. Wyznaczyć, jaki procent wartości uzyskanej dla komórek kontrolnych (100%)
stanowią wyliczone średnie wartości absorpcji dla poszczególnych stę\
eń
badanego związku.
% kontroli:
Aśrednia dla komórek kontrolnych  100 %
Aśrednia dla komórek traktowanych związkiem  x %
X = (Aśrednia dla komórek traktowanych związkiem * 100%) / Aśrednia dla komórek kontrolnych
Odchylenie standardowe z % wzrostu komórek: (Odchylenie standardowe * 100) / Aśrednią
Uzyskane wyniki zestawić w postaci tabeli:
Odchylenie
Odchylenie % standardowe
Stę\
enie [�M] A1 [nm] A2 [nm] Aśrednia [nm]
�
�
�
standardowe kontroli z % wzrostu
komórek
K 100
0,0005
...
50
3. Sporządzić wykres zale\
ności zahamowania wzrostu komórek (% kontroli) od
logarytmu stę\
enia badanej substancji. Z powy\
szego wykresu wyznaczyć
fragment prostoliniowy i podać jego równanie. Obliczyć wartości parametrów
EC10, EC50, EC90.
4. Skomentować uzyskany wynik.
Literatura:
1. http://www.gmi-inc.com/CliniLab/Coulter%20Z2%20Series.htm
2.http://www.dojindo.com/products/category/dsp_detail.cfm?requesttimeout=500&ProdN
ame=MTT