2009-05-10
KOMÓRKI NOWOTWOROWE
KOMÓRKI NOWOTWOROWE
CHOROBY NOWOTWOROWE
CHOROBY NOWOTWOROWE
Komórki, które uległy transformacji nowotworowej.
" Nowotwór zaczyna się rozwijać, gdy:
" zmiany w błonie komórkowej:
 komórki zaczynają wymykać się spod kontroli  zwiększenie transportu metabolitów
mechanizmów decydujących o jej podziałach i  zwiększenie tworzenia pęcherzyków błonowych
 wzrost ruchliwości białek błonowych
lokalizacji
" zmiany adhezyjne:
 zmniejszenie adhezji powierzchniowej
" W normalnych warunkach
 zmian w organizacji włókien aktynowych
 równowaga p ę y p p
g pomiędzy tempem podziałów komórek
 zanik struktur fibronektynowych
zanik struktur fibronektynowych
a ubytkiem komórek
 nadprodukcja aktywatora plazminogenu
zmniejszenie zdolności do przylegania do siebie i do białek macierzy zewnątrzkomórkowej
" Nowotwory
" zmiany we wzroście i podziałach komórki:
 spadek zapotrzebowania na czynniki wzrostowe
 zachwianie równowagi
 nabycie zdolności do wzrostu w zawiesinie
(więcej komórek przybywa niż ginie)
 nabycie zdolności do nieograniczonej proliferacji (immortalizacja)
 powstają w wyniku neoplazji (rozrostu) komórek,
neoplazji
 utrata kontroli nad proliferacjÄ… (wynika z
Większość zmian ma charakter ilościowy.
niestabilności genetycznej komórki)
Dopiero nabycie zdolności do inwazji (naciekania) oraz kolonizacji tkanek
normalnie zajmowanych przez inne typy komorek ( przerzuty) powoduje,
że stają się one zagrożeniem dla całego organizmu.
CECHY KOMÓREK NOWOTWOROWYCH CECHY KOMÓREK NOWOTWOROWYCH
CECHY KOMÓREK NOWOTWOROWYCH CECHY KOMÓREK NOWOTWOROWYCH
1. Zdolność do nadmiernych, niekontrolowanych podziałów na
skutek: 4. Immortalizacja (nie we wszystkich przypadkach)
czyli uzyskanie zdolności do nieograniczonego przeżywania i
 autokrynnej regulacji wzrostu (produkcja własnych czynników
wzrostu, "nieśmiertelność" komórek (związana między innymi z
wzrostowych przez komórki nowotworowe)
brakiem reakcji na czynniki wywołujące apoptozę).
 ignorowaniu systemów kontrolujących namnażanie się komórkek
prawidłowych
5. Brak różnicowania się funkcjonalnego
 rozregulowaniu procesu proliferacji (między innymi
"prowokowanie" komórki przez zmutowane białka będące
prowokowanie komórki przez zmutowane białka będące
czyli komórka wskutek nadmiernej proliferacji oraz mutacji
czyli komórka wskutek nadmiernej proliferacji oraz mutacji,
produktami onkogenów do stałych podziałów)
które zaszły w DNA traci zdolność spełniania właściwych sobie
funkcji, zaczyna produkować białka nieprawidłowe lub też
prawidłowe, lecz w zdecydowanym nadmiarze.
2. Brak zahamowania kontaktowego
czyli charakterystycznego dla prawidłowych tkanek dystansu
6. Zdolność do tworzenia przerzutów (metastaz)
pomiędzy komórkami.
czyli odłączanie się od nowotworu, wchodzenie do naczyń
krwionośnych lub limfatycznych i krążenie w krwioobiegu, a
3. Inwazyjność
następnie atakowanie innych tkanek i zapoczątkowanie
nowych skupisk nowotworowych.
czyli zdolność do atakowania sąsiadujących komórek
prawidłowych oraz zajmowania i przerastania ich terytoriów.
ETAPY KANCEROGENEZY PREINICJACJA
ETAPY KANCEROGENEZY PREINICJACJA
" Ekspozycja na czynniki kancerogenne:
1. EKSPOZYCJA NA CZYNNIKI
 fizyczne: promieniowanie jonizujÄ…ce, UV
KANCEROGENNE PREINICJACJA
 chemiczne: konserwanty, barwniki
 biologiczne: wirusy, bakterie, pasożyty
2. NAGROMADZENIE MUTACJI I
" Predyspozycje genetyczne tj.
URUCHOMIENIE PROCESU
URUCHOMIENIE PROCESU
 sprawność metabolizowania kancerogenów, polimorfizm genów
sprawność metabolizowania kancerogenów polimorfizm genów
TRANSFORMACJI NOWOTWOROWEJ kodujÄ…cych mechanizmy naprawcze.
INICJACJA
uszkodzenie DNA
3. SELEKCJA KLONALNA  NABYCIE
aktywacja apoptoza
ZDOLNOÅšCI DO TWORZENIA
punktów
PRZERZUTÓW PROGRESJA
kontrolnych
aktywacja programów
aktywacja programów
naprawczych
transkrypcyjnych
1
2009-05-10
INICJACJA PROGRESJA
INICJACJA PROGRESJA
" Pojawienie siÄ™ mutacji spontanicznej lub odziedziczonej
" przekształcenie się komórki normalnej w
(gł. w jednym z mechanizmów naprawczych DNA):
nowotworowÄ…
" rozrost (tworzenie guza)
 uszkodzenie genów kontrolujących podziały komórkowe np.
gen p53 (białko p53 reguluje przebieg apoptozy i cyklu
" utworzenie dróg inwazji poprzez rozwój
komórkowego
naczyń krwionośnych (angiogeneza
 niesprawne mechanizmy naprawcze z
ródło składników odżywcze i wzrostowe)
 blokada procesu apoptozy
" rozluz
nienie struktury guza
 ucieczka przed mechanizmami układu immunologicznego
" selekcja klonów komórek, których produkty
umożliwiają szybki rozrost i tworzenie
nacieków utrata wł. adhezyjnych, wzrost
" Jedna mutacja nie jest wystarczajÄ…ca do transformacji
poziomu enzymów proteolitycznych
nowotworowej, potrzebny tzw. szlak mutacyjny.
lizujących błonę podstawną
" przełamanie bariery białek macierzy
zewnątrzkomórkowej, uwalnianie komórek
z guza i przemieszczanie do innych tkanek
ANGIOGENEZA
ANGIOGENEZA
Ag NOWOTWOROWE
Ag NOWOTWOROWE
U wielu osób z rozwijającym się nowotworem obserwuje się aktywność immunol.
przeciwko kom. nowotworowym
- Ab anty-komórki nowotworowe
- zdolność limfocytów chorego do odpowiedzi na Ag nowotworowe
1) IstniejÄ… Ag nowotworowe
2) Uzasadnione są próby immunoterapii nowotworów
PROBLEM:
większość Ag nowotworowych
nie ma charakteru Ag swoistych (powstajÄ… spontanicznie)
czasem występuje w niewielkich ilościach na niektórych komórkach prawidłowych
TAA (Tumor Associated Antigens)
TAA (Tumor Associated Antigens)
PODZIAA
Ag NOWOTWOROWYCH
PODZIAA
Ag NOWOTWOROWYCH
Ag NOWOTWOROWE
Ag NOWOTWOROWE
Cel badania Ag nowotworowych: a) Wykrywanie
b) Monitorowanie
" Brak lub niska swoistość Ag nowotworowych.
c) Leczenie
 nie wyklucza możliwości wykorzystania ich do wykrywania nowotworów
1) Ag powszechnie występujące
i monitorowania leczenia
-
- obecne na komórkach nowotworowych i różnych komórkach
prawidłowych
- fragmenty telomerazy
" Niekiedy Ab przeciw Ag nowotworowym mogą indukować
zniszczenie komórek nowotworowych (duże stężenie Ag) i
2) Ag różnicowania
2) Ag różnicowania
 oszczędzić komórki prawidłowe (mniejsze stężenie Ag).
d ić k óki idł ( i j t ż i A )
- obecne na komórkach nowotworowych i prawidłowych komórkach, z
których wywodzi się nowotwór
- CAE, PSA, Ag czerniaka (gp100, MART-1)
" TAA występuje poza nowotworem tylko na nielicznych komórkach
prawidłowych (ich uszkodzenie podczas terapii nie spowoduje
3) Ag rakowo-jÄ…drowe
poważnych efektów ubocznych) (komórki nowotworowe czerniaka a
- oprócz komórek nowotworowych występują na spermatocytach i
bielactwo  niszczenie melanocytów).
spermatogoniach
4) Ag swoiste dla nowotworu TSA (Tumor Specific Antiens)
)
" Niekiedy brak swoistych Ag może być atutem.
- występują tylko na komórkach zmienionych nowotworowo
Ag obecny na komórkach czerniaka i limfocytach B.
Nowotwory człowieka w większości nie zawierają TSA !!! wyjątki
2
2009-05-10
PODZIAA
Ag NOWOTWOROWYCH
PODZIAA
Ag NOWOTWOROWYCH
Ag NOWOTWOROWE
Ag NOWOTWOROWE
W rozpoznawaniu Ag nowotworowych uczestniczÄ…:
" Ag indukowane przez onkogeny
" Ag indukowane przez onkogeny - onkogenne DNA i RNA wirusów
kodują powierzchniowe i jądrowe Ag wirusowe, które ulegają
1) limfocyty T CD4+ (Ag złuszczane z kom.) i CD8+ (im bardziej
złośliwy nowotwór, tym mniejsza ekspresja MHC kl. I na pow. ekspresji w komórce lub na jej powierzchni zmieniając ją
kom. nowotworowej)\ nowotworowo. Ag takie występują we wszystkich komórkach
zakażonych przez te same wirusy. Np. wykazano zależność
2) Ab
)
pomiędzy zakażeniem wirusem Hepatitis B a nowotworami wątroby
pomiędzy zakażeniem wirusem Hepatitis B a nowotworami wątroby.
CD19-CD22 wyst. na pow. chłoniaków z limfocytów B,
alfafetoproteina (AFP)  rak wątroby i jądra (prawidłowa
wątroba, pęcherzyk żółciowy, przewód pokarmowy)
PSA (Prostate Specific Antigen)  Ag swoisty dla
" Ag indukowane przez substancje chemiczne
" Ag indukowane przez substancje chemiczne - zwiÄ…zki chemiczne
gruczołu krokowego
indukują przypadkowe mutacje DNA, co może prowadzić do indukcji
3) limfocyty T i Ab np. zespół Ag karcynoembrionalnych CEA ekspresji Ag nowotworowych.
rak jelita grubego, trzustki, żołądka
rzadziej płuc, sutka, trzonu macicy
ODPOWIEDy
PRZECIWNOWOTWOROWA TERAPIA NOWOTWORÓW
ODPOWIEDy
PRZECIWNOWOTWOROWA TERAPIA NOWOTWORÓW
" Leczenie chirurgiczne
Mechanizmy efektorowe odpowiedzi
" Chemioterapia
immunologicznej:
" Radioteprapia
" aktywność komórek NK
" Immunoterapia - uzupełnia ww. metody leczenia:
" cytotoksyczność komórek zależna od
 czynna
 czynna - efekt leczniczy uzyskuje się poprzez wzmożenie reaktywności układu
Ab (ADCC)
immunologicznego pacjenta. Obejmuje:
" podanie kom. nowotworowych lub ich Ag w postaci szczepionki
d i k t h l b i h A t i i ki
" cytotoksyczność Ab zależna od
czynna terapia swoista
dopełniacza (kompleks Ag-Ab
" aktywację mechanizmów immunologicznych za pomocą preparatów
aktywacja dopełniacza liza komórki)
immunostymulujÄ…cych
czynna terapia nieswoista.
" cytotoksyczność limfocytów CTL
(Efekt jest wynikiem bezpośredniego działania cytokin na kom. nowotworowe)
 bierna
 bierna - podawanie mAb przeciwko Ag nowotworowym, stosuje siÄ™ Ab
" cytotoksyczość pobudzonych makrofagów i neutrofilów
zmodyfikowane np. enzymami w celu zwiększenia ich skuteczności.
" aktywność cytokin wydzielanych przez makrofagi i limfocyty T
 adoptywna
 adoptywna - podanie dożylne lub miejscowe kom. immunologicznych pacjenta
helper
aktywowanych Ag nowotworowymi poza organizmem gospodarza.
 pośrednia
 pośrednia - blokowanie czynników wzrostu lub angiogenezy.
SZCZEPIONKI SZCZEPIONKI
SZCZEPIONKI SZCZEPIONKI
PRZECIWNOWOTWOROWE PRZECIWNOWOTWOROWE
PRZECIWNOWOTWOROWE PRZECIWNOWOTWOROWE
" Powinny wykazywać działanie lecznicze, nie profilaktyczne.
" Najbardziej przydatne w leczeniu nowotworów zdolnych do indukcji
" Skuteczność szczepionek jest stosunkowo niska,
odp. immunologicznej o dobrze określonych i swoistych Ag np.
 ponieważ w czasie od momentu pobrania komórek nowotworowych od
pacjenta do momentu podania szczepionki, nowotwór rozwija się i ulega
czerniak.
zmianom, więc nie są to już te same komórki użyte do szczepionki.
" Mogą zawierać:
 odpowiednio przygotowane - zabite, napromieniowane - komórki
odpowiednio przygotowane zabite napromieniowane komórki
" Szczepionka profilaktyczna
" Szczepionka profilaktyczna
nowotworowe auto- i allogeniczne lub ich Ag podawane Å‚Ä…cznie z
 podawana osobom z grup ryzyka.
adiwantami (BCG, zw. glinu) lub cytokinami (IL-2, IL-12)
 z
ródłem komórek nowotworowych mogą być hodowle komórek o dobrze
 zmodyfikowane metodami inżynierii genetycznej kom. nowotworowe, do
sprecyzowanych Ag lub komórki nowotworowe rodziny.
których DNA wprowadzono określone geny: IL-2, IL-4, IL-7, TNF, IFN-ł
 wzbudzenie odpowiedzi immunologicznej skutkuje wytworzeniem
lub geny dla cząsteczki kostymulującej CD80 niezbędnej w procesie
limfocytów pamięci immunologicznej.
prezentacji Ag
 w chwili rozwoju nowotworu od razu są gotowe mechanizmy odporności
 drobnoustroje wewnątrzkomórkowe np. adenowirusy lub Listeria
przeciwnowotworowej, które nie doprowadzą do różnicowania komórek i
monocytogenes z wprowadzonymi genami dla Ag nowotworowych
zniszczÄ… je zanim ulegnÄ… modyfikacjom.
skuteczna prezentacja
 komórki dendrytyczne (KD), które jako cząsteczki APC są niezbędne do
inicjacji odp. Immunologicznej.
3
2009-05-10
Przeciwciała
Przeciwciała
poddaje siÄ™ je
otrzymuje siÄ™
guz usunięty
promieniowaniu X
pojedyńcze
monoklonalne mAb
monoklonalne mAb
chirurgicznie
(zahamowanie
komórki rakowe
proliferacji)
" poddane modyfikacjom:
wprowadzenie
 połączone z toksynami np. dyfterotoksyna
wprowadzenie komórek do rozpoznanie
 połączone z lekami cytotoksycznymi
genu dla
organizmu Ag przez KD
 p ą y przekształcającymi leki p-nowotworowe z formy
połączone z enzymami p ją y p y
cytokin p j
y pacjenta
nieaktywnej (prolek) w aktywnÄ… (lek)
(podskórne lub
dożylne)
 znakowane radioizotopami np. jod 131
 Ab o podwójnej swoistości 1 ramię jest skierowane do Ag
nowotworowego, a 2 ramię ma zdolność rozpoznawania CD3 limfocyta
aktywacja komórek efektorowych
swoiste
limfocyty,
aktywacja
eliminacja komórek
których
limfocytów T/B
nowotworowych
aktywność jest
skierowana
przeciwko
komórkom guza
DIAGNOSTYKA NOWOTWORÓW
DIAGNOSTYKA NOWOTWORÓW
DIAGNOSTYKA NOWOTWORÓW
DIAGNOSTYKA NOWOTWORÓW
Metody:
Ma na celu:
" mikroskopia świetlna, elektronowa
 określenie pochodzenia nowotworu
" immunofenotypowanie
 oznaczenie etapu różnicowania komórki zdrowej
 badanie antygenów przy zastosowaniu specyficznych przeciwciał
 określenie progresji nowotworu u chorego  metoda ELISA
 metoda cytometrii przepływowej
 poszukiwanie przerzutów i ich umiejscowienia
 poszukiwanie przerzutów i ich umiejscowienia
 metoda radioimmunologiczna
" cytogenetyka
" biologia molekularna
 PCR umożliwia in vitro amplifikację wybranych sekwencji DNA przy
użyciu polimerazy DNA i syntetycznych oligonukleotydów (tzw. starterów)
komplementarnych do końców wybranych sekwencji DNA
 RT - PCR (reverse transcription PCR) modyfikacja reakcji PCR do
wykrywania i analizy czÄ…steczek RNA
" analiza biochemiczna
Cancer-killing vaccinia virus (a smallpox relative, in green)
spreading through 3-D cultured tumor cells (red).
Image: Courtesy of Stephen Thorne
" After washing to remove unbound serum constituents
ELISA Technique
" An enzyme-labelled 2sd Ab anti Ag (from patient serum) is added
" serum is incubated in wells which have been coated with purified Ab
Negative control Sample-low concentration Sample-high concentration Negative control Sample-low concentration Sample-high concentration
4
2009-05-10
" Enzyme-labelled Ab is visualised by addition on a chromogenic
Immunofluorescence
enzyme substrate
" colour development is proportial to the concentration of Ab in the
test serum  measured spectrophotometrically
Negative control Sample-low concentration Sample-high concentration
Fluorescence  emision of light of one
PCR, RT - PCR
color while a substance is irradiated PCR, RT - PCR
with light of different color.
" analiza DNA lub RNA tkanki guza
" diagnoza
UV light
" prognoza
" zapewnia wykrywanie:
" śladowych ilości materiału guza (1 komórki nowotworowej)
śladowych ilości materiału guza (1 komórki nowotworowej)
" ekspresji genów związanych z nowotworem
" rearanżacji genów immunoglobulin
" amplifikacji onkogenów, np. myc - N
" mutacji genu supresorowego p53
" wysoka czułość metody
" bardzo czuła i bardzo szybka diagnoza
" monitorowanie choroby
" wykrywanie choroby resztkowej przy remisji cytomorfologicznej
Zasada działania reakcji PCR
Zasada działania reakcji PCR
Krok 1 - Denaturacja (94°C)
Krok 2  PrzyÅ‚Ä…czanie starterów (60°C)
W wyniku ogrzewania dochodzi do rozplecenia podwójnej helisy DNA.
Dodanie jednoniciowych primerów które łączą się z DNA którego
poszukujemy (primery łączą się z jednoniciowym DNA ze względu na
komplementarność).
5
2009-05-10
Zasada działania reakcji PCR
Elektroforeza w żelu agarozowym
Krok 3  WydÅ‚użanie DNA (72°C )
Dodajemy pojedyncze nukleotydy i enzym (polimerazÄ™ Taq polymerase).
Stosujemy polimerazę bakteryjną, ponieważ temperatura reakcji jest
wysoka, a optymalna temperatura dla ludzkiej polimerazy to około
37°C.
Niektóre badane markery biologiczne:
Badane markery Badana tkanka lub płyn Co oznacza obecność
Elektroforeza w żelu agarozowym
markera?
PSA krew Rak prostaty
Addukt aflatoksyna B1- Mocz, wątroba Zwiększone ryzyko raka
DNA wÄ…troby
Addukt PHA-DNA Krew, płuca, łożysko Zwiększone ryzyko raka
płuc
Mutacje w genie p53 Pierś, wątroba, płuco Podwyższone ryzyko
zachorowania na różne
nowotwory
Brak genu S- transferazy Krew Podwyższone ryzyko
glutatnionowej raka płuc i pęcherza
Mutacja genu BRCA1 Krew Znacznie podwyższone
ryzyko rak piersi i jajnika
" BRCA 1, BRCA2
Diagnostyka mutacji genów BRCA1 i BRCA2 odpowiadających za podatność na dziedziczne
nowotwory piersi i jajników.
" HPV
 Diagnostyka wirusa powodującego zakażenie brodawczakiem ludzkim. Badamy obecność 9 typów wirusa.
 Jest to wirus onkogenny (wysokiego i średniego ryzyka) powodujący raka szyjki macicy lub zmiany
przednowotworowe, polipy, kłykciny.
" HTGR
Diagnostyka ryzyka nowotworowego :
 przy terapii hormonalnej oraz po stosowaniu hormonalnych środków antykoncepcyjnych
 badanie obejmuje mutacje genów kodujących białka odpowiedzialne za nadwrażliwość
na estrogeny określając tym samym ryzyko zapadnięcia na nowotwory wskutek działania hormonów
płciowych
 badanie to powinna przejść każda kobieta decydująca się na przyjmowanie hormonów
płciowych
 na niekorzystny efekt mutacji szczególnie wpływa zażywanie hormonów przez kobiety
przed 35 rokiem życia (antykoncepcja hormonalna), zwiększając 10-krotnie ryzyko
zapadnięcia na nowotwory do ok. 90%
 uszkodzenia (mutacje) tych genów mogą być przyczyną skłonności do tworzenia się wielu
nowotworów, takich jak np.: rak tarczycy, rak piersi, rak okrężnicy, czerniaki, rak jajników, rak jelita
grubego.
6