METODY OZNACZANIA 2008-12-02
PRZECIWCIAA

Antygen (Ag) - makrocząsteczka obca w stosunku do organizmu, Przeciwciała (Ab) - białka należące do frakcji gammaglobulin
do którego wnika, pobudzająca układ immunologiczny do syntetyzowane przez komórki plazmatyczne (pobudzone
odpowiedzi:
limfocyty B) w przebiegu odpowiedzi immunologicznej, swoiste
" humoralnej - swoiste przeciwciała dla rozpoznawanego Ag.
" komórkowej - swoiste komórki efektorowe
Cechy Ag:
Powinowactwo (ang. affinity)
 immunogenność: zdolność do wzbudzania odpowiedzi organizmu
cecha, która określa siłę
Schemat przeciwciała:
 antygenowość: zdolność do reagowania ze wzbudzonymi przez siebie 1. fragment wiążący antygen wiązania pomiędzy pojedynczym
2. region Fab
komórkami lub przeciwciałami
epitopem a pojedynczym
3. region Fc
niebieskie - łańcuchy ciężkie
y
miejscem wiązania przeciwciała.
miejscem wiązania przeciwciała.
Podział Ag:
Podział Ag:
żółte - łańcuchy lekkie
ciemnoniebieskie/żółte - regiony
1. Zachłanność (ang. avidity )
zmienne
jasnoniebieskie/żółte - regiony wiązanie się Ab z całą
 grasicozależne - wymagają obecności limfocytów T dla aktywacji
stałe
limfocytów B do produkcji Ab. Powstają głównie Ab IgG (wysoka cząsteczką Ag
szare - mostki dwusiarczkowe
swoistość), wzbudzają dobrą pamięć immunologiczną, wielodeterminantowego.
 grasiconiezależne - bezpośrednio aktywują limfocyty B, powstają Ab
IgM (niska swoistość), wzbudzają słabą pamięć immunologiczną.
Superantygeny.
2.
Przeciwciała monoklonalne (mAb) - skierowane przeciwko jednej
 cząstkowe (korpuskularne) - silnie immunogenne, całe komórki,
determinancie antygenowej (determinanta=epitop, miejsce
wirusy
wiÄ…zania Ag z Ab)
 rozpuszczalne - słabo immunogenne, toksyny, białka, LPS, DNA/RNA
METODY OZNACZANIA PRZECIWCIAA

Testy immunoenzymatyczne
Testy aglutynacyjne
Testy precypitacyjne i immunodyfuzji
Metody immunoelektroforetyczne
TECHNIKI
Testy immunofluorescencyjne
IMMUNOENZYMATYCZNE
IMMUNOENZYMATYCZNE
Ab Ag KI
ELISA testów fazy stałej
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Test ELISA należy do szerszej grupy tzw. testów fazy stałej, ale
nie jest pierwszym, który został wynaleziony, chociaż jest
jednym z najczęściej stosowanych.
test immunoenzymatyczny lub immunoenzymosorbcyjny, jest
jednym z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach
W metodzie ELISA stosuje się 96- dołkową płytkę płaskodenną
biomedycznych, zarówno naukowych, jak i diagnostycznych
wykonaną z syntetycznych polimerów. Czułość tej metody
dorównuje metodzie RIA, a jest znacznie tańsza, prostsza i nie
Służy do:
naraża na kontakt z substancjami radioaktywnymi.
 wykrywania i określania stężeń leków, hormonów, enzymów,
nawet jeżeli występują one w bardzo małych ilościach w
płynach tkankowych
 do oceny odporności humoralnej (ocena stężenia
immunoglobulin w surowicy), układu dopełniacza (określenie
stężenia poszczególnych jego składników)
 rutynowo stosuje siÄ™ w diagnostyce wirusa CMV, HIV,
rozpoznaniu WZW A itp.
 może też być stosowany do wykrywania alergenów
pokarmowych tj. mleko, jajka, orzeszki ziemne, migdały, w
przemyśle spożywczym
1
METODY OZNACZANIA 2008-12-02
PRZECIWCIAA

1. Opłaszczanie przeprowadza się
przez dodanie do studzienki
ETAPY TESTU ELISA
antygenu przeznaczonego do
ELISA to technika biochemiczna stosowana do wykrywania
umieszczenia na fazie stałej.
obecności Ab lub Ag w badanych próbach.
Całość jest następnie inkubowana
przez określony czas, najpierw
zwykle w temperaturze 37°C, a
Możemy zastosować metodę pośrednią (2) lub bezpośrednią
potem 4°C, choć możliwe sÄ… także
inne metody, co zależy od
(1).
przeprowadzanego badania.
Temperatura jest jednym z
najważniejszych czynników, nie
W metodzie bezpośredniej stosujemy tylko jeden rodzaj Ab,
może jednak przekroczyć 56°C,
które są znakowane, natomiast w pośredniej pierwsze Ab
gdyż w przypadku białek dojdzie do
g y p yp j
swoiste do Ag nieznakowane i drugie Ab znakowane enzymem denaturacji.
swoiste do pierwszych przeciwciał.
2. Po przeprowadzeniu opłaszczenia
należy jeszcze zablokować miejsca
niezajęte przez antygen. Dokonuje
się tego za pomocą czynników
blokujÄ…cych, np. roztworu
owoalbuminy lub odtłuszczonego
mleka, co zapobiega
nieselektywnemu przyłączaniu się
białek do fazy stałej podczas
następnych etapów testu,
wymagających także inkubacji w
określonych temperaturach.
Kompetycyjny (rywalizacyjny) test ELISA
3. Następnie dodajemy
(c-ELISA, z ang. competitive ELISA)
do studzienek płytki
próby surowicy w której
będziemy wykrywać
Stosuje się mieszankę znakowanego Ab, która jest dodawana
obecność Ab swoistych
do badanego materiału
do opłaszczonych Ag.
Podobnie jak w innych typach ELISA mierzących stężenie Ab,
4. Dodajemy Ab
faza stała jest opłaszczona odpowiednim Ag.
znakowane ezymem
znakowane ezymem
skierowane przeciwko
Jeśli na fazę stałą podziałamy mieszanką badanej surowicy i
ludzkim przeciwciałom.
specyficznego względem danego antygenu mAb
wyznakowanego enzymem, to nastąpi współzawodnictwo
5. Nanosimy substrat
pomiędzy przeciwciałami w surowicy, a przeciwciałem
dla enzymu np..
znakowanym.
chromogen.
W odróżnieniu od poprzedniej metody natężenie reakcji
6. Odczytujemy wyniki
enzymatycznej będzie odwrotnie proporcjonalne do stężenia
na spektrofotometrze.
przeciwciał w surowicy, gdyż im większe będzie ich stężenie,
tym mniej znakowanego przeciwciała przyłączy się do antygenu
umieszczonego na fazie stałej.
UniCAP
technologia ImmunoCAP została
przedstawiona przez Pharmacia w
1989r.
całkowicie zautomatyzowany
wysokie standardy prowadzenia badań
wynik uzyskuje siÄ™ zwykle w ciÄ…gu 2,5
godz.
urzÄ…dzenie przechowuje krzywÄ…
kalibracyjnÄ…
automatyczna kalkulacja wyników
ImmunoCAP sIgE
test in-vitro mierzy poziom alergenowoswoistych IgE w plazmie lub
surowicy pacjentów, co umożliwia ocenę uwrażliwienia pacjenta na dany
alergen. ImmunoCAP pozwala na ilościową ocenę szerokiego rodzaju
alergenów  ponad 550, pozwala przewidzieć ryzyko rozwoju alergii w
przyszłości, swoistość testu 85-94%
2
METODY OZNACZANIA 2008-12-02
PRZECIWCIAA

Aglutynacja
 reakcja zachodząca pomiędzy swoistymi Ab a Ag cząstkowymi
(wchodzącymi w skład otoczek komórek bakteryjnych, grzybów,
erytrocytów, komórek ludzkich i zwierzęcych)
 może zachodzić między swoistymi Ab a Ag rozpuszczalnym
opłaszczonym na cząsteczkach lateksu
 komórki z przyłączonymi Ab tworzą przestrzenne agregaty
METODY OPARTE NA
wypadajÄ…ce z roztworu w postaci aglutynatu
REAKCJI AGLUTYNACJI
REAKCJI AGLUTYNACJI
Aglutynacja jest odczynem stosowanym w chorobach zakaz
nych,
wywoływanych przez bakterie, nie ma natomiast zastosowania w
chorobach wirusowych.
Teoretycznie można go stosować wszędzie tam, gdzie wyhoduje się
drobnoustrój, z którego można sporządzić antygen.
Zaletą odczynu jest prostota jego wykonania, szybkość wystąpienia
reakcji, łatwość odczytania wyników i stosunkowo wysoka czułość.
Zastosowanie metody aglutynacji
w identyfikacji Ag powierzchniowych komórek
do wykrywania Ag w badanych surowicach
do oznaczania poziomu Ab w surowicy przez
wyznaczenie miana aglutynacyjnego
Miano aglutynacyjne jest to największe rozcieńczenie surowicy
badanej (lub najmniejsze stężenie Ag), przy którym widoczne są
jeszcze aglutynaty.
Hemaglutynacja
 aglutynacja czerwonych krwinek
 hemaglutynacja bezpośrednia, czyli czynna, w której zlepianie
erytrocytów wywoływane jest przez różne drobnoustroje. To zjawisko
może zostać zahamowane działaniem surowicy zawierającej swoiste
przeciwciała skierowane przeciwko drobnoustrojom zlepiającym
krwinki
 hemaglutynacja pośrednia, czyli bierna, zachodzi wówczas, gdy na
erytrocyty opłaszczone jakimś antygenem zadziałamy surowicą
odpornościową, zawierającą przeciwciała swoiste dla antygenu
zaadsorbowanego na powierzchni krwinki.
3
METODY OZNACZANIA 2008-12-02
PRZECIWCIAA

KONFLIKT SEROLOGICZNY
Oznaczanie grup krwi z
zastosowaniem krwinek
Konflikt serologiczny jest to niezgodność krwi między matką a płodem w
wzorcowych 
zakresie czynnika Rh.
materiałem od pacjenta
jest surowica (
matka ma czynnik Rh 
A 0 B
szukamy Ab)
płód dziedziczy po ojcu Rh+
Najczęstszą przyczyną konfliktu serologicznego jest płodowo-matczyny
przeciek krwi (0,1-0,2ml) podczas porodu i poronienia, gdy do krążenia
matki dostają się erytrocyty płodu z Ag grupowymi różniącymi się od Ag
matki.
Kontakt z takimi krwinkami indukuje odpowiedz
immunologiczną ciężarnej
do produkcji Ab anty-D, głównie IgG kl.2, mających zdolność przenikania
przez łożysko choroba hemolityczna.
W zależności od nasilenia procesu objawy mogą występować w postaci
łagodnej niedokrwistości noworodków, ale także w postaci już poważnie
rokującej dla noworodka żółtaczki czy uogólnionego obrzęku.
METODY OPARTE NA
REAKCJI PRECYPITACJI
REAKCJI PRECYPITACJI
Precypitacja
 reakcja między cząsteczką Ab swoistego a Ag rozpuszczalnym (o
masie cząsteczkowej 40-160kDa) zachodząca w środowisku
płynnym
 1 faza: Ag reaguje z Ab i powstajÄ… kompleksy immunologiczne (KI)
 2 faza: powstałe KI w środowisku elektrolitów wypadają w postaci
precypitatów widocznych gołym okiem
 Ag i Ab łączą się ze sobą w różnych stosunkach ilościowych, do
powstania kompleksów widocznych gołym okiem dochodzi w strefie
ekwiwalencji, czyli strefie równowagi stężeń obu reagentów
 przed nastawieniem reakcji precypitacji należy pamiętać o
inaktywacji surowicy, ze względu na obecność dopełniacza, który
może rozpuszczać KI. Inaktywacja zachodzi w temp. 56°C przez 30
min.
4
METODY OZNACZANIA 2008-12-02
PRZECIWCIAA

Reakcja dyfuzji radialnej wg Manciniego
 służy do ilościowej oceny Ag
Immunodyfuzja
 Ab unieruchomione są w żelu agarozowym, a Ag dyfunduje
 reakcja precypitacji zachodząca w środowisku żelowym
 oparta jest na zjawisku dyfuzji cząsteczki Ag i Ab w żelu
 precypitat powstaje w strefie ekwiwalencji w miejscu zetknięcia się
obu reagentów, widoczny w postaci linii, łuków lub pierścienia
precypitacyjnego
 szybkość dyfuzji reagentów w żelu jest odwrotnie proporcjonalna
do wielkości cząsteczki i wprostproporcjonalna do stężenia
reagentów
 stosuje się zwykle 1-2% żel agarowy lub agarozowy jako środ.
reakcji, który pozwala na swobodną dyfuzję
 zależy od takich samych czynników co precypitacja probówkowa
 dwa typy immunodyfuzji:
" pojedyńcza  dyfunduje tylko jeden z reagentów (zwykle Ag), a
drugi z nich (Ab) występują w żelu w jednakowym stężęniu
" podwójna  zarówno Ag i Ab dyfundują w żelu
 można wykonywać w probówkach i na płytkach
Podwójna reakcja dyfuzji wg Ouchterlony ego Podwójna reakcja dyfuzji wg Ouchterlony ego
 dyfundujÄ… czÄ…steczki Ab i Ag
 pozwala określić czy badane Ag zawierają identyczne, wspólne czy
też różne determinanty antygenowe
IMMUNOELEKTROFOREZA
Elektroforeza białek jest metodą rozdziału białek występujących
we krwi (w surowicy) lub w moczu.
Podczas badania prąd elektryczny użyty jest do poruszania się
METODY
białek w cienkiej warstwie agaru o konsystencji żelu.
IMMUNOELEKTROFORETYCZNE
IMMUNOELEKTROFORETYCZNE
Odległości jakie pokonują białka zależą od ich wielkości,
kształtu i ładunku elektrycznego.
5
METODY OZNACZANIA 2008-12-02
PRZECIWCIAA

Immunoelektroforeza jest używana do jakościowych analiz
mieszanin antygenów, może jednak stanowić również pewien
wskaz
nik ilościowy (grubość łuków i linii precypitacyjnych).
Test ten jest powszechnie używany do analizy składowych
surowicy pacjenta surowica jest umieszczana w wyciętym
dołku, a przeciwciało do całej surowicy w korytku. Poprzez
porównanie z  normalną surowicą można ocenić czy widoczne
są różnice  brak białka, jego niedobór lub nadmiar.
Test może być również wykorzystany do oceny czystości
IMMUNOFLUORESCENCJA
wyizolowanych białek surowicy.
Stosuje siÄ™ dwa warianty metody immunofluorescencji (IF):
Testy immunofluorescencyjne
 Testy immunofluorescencyjne bezpośrednie wykrywają przy
pomocy znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał określony
 sÄ… standardowÄ… technikÄ… immunologicznÄ… (gold standard) w
antygen.
diagnostyce przeciwciał przeciwbakteryjnych,
przeciwwirusowych a także skierowanych przeciw tkankom
 Testy immunofluorescencyjne pośrednie wykrywają przy
organizmu, komórkom i ich częściom
pomocy znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał
 charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością
immunoglobuliny, które uprzednio związały się ze swoistym
 wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami
antygenem.
fl j i
fluorescencyjnymi
 do najczęściej stosowanych
barwników należy izotiocyjanian
fluoresceiny (FITC), który po
wzbudzeniu emituje kolor zielony oraz
izotiocyjanian tetrametylorodaminy
(TRITC), który po wzbudzeniu emituje
kolor czerwony
 z
ródłem antygenów są substraty
tkankowe pozwalajÄ…ce na wykrywanie
szerokiego spektrum przeciwciał
Diagnostyka kiły - Test immunofluorescencji pośredniej Diagnostyka kiły - Test immunofluorescencji pośredniej c.d.
Po przepłukaniu, dodaje się przeciwciała swoiste wobec ludzkich
Na szkiełko podstawowe nanosi się krętki kiły Treponema
immunoglobulin. Przeciwciała te znakowane są barwnikiem
pallidum (krętki pochodzą z laboratorium)
fluorescencyjnym.
Dodaje siÄ™ surowicÄ™ pacjenta
Jeśli surowica badanej osoby zawiera przeciwciała swoiste wobec
Wynik pozytywny osoba zarażona pod mikroskopem
krętków (tj. zaraziła się kiłą), to zwiążą się one z krętkami na szkiełku
fluoresencyjnym obserwuje się fluoryzujące krętki
Wynik negatywny osoba  niezarażona brak "świecenia"
6