Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza
Antygen (Ag) - makroczÄ…steczka obca w stosunku do organizmu, do
Przeciwciała (Ab) - białka należące do frakcji gammaglobulin
którego wnika, pobudzająca układ immunologiczny do odpowiedzi:
syntetyzowane przez komórki plazmatyczne (pobudzone limfocyty B)
" humoralnej - swoiste przeciwciała
w przebiegu odpowiedzi immunologicznej, swoiste dla
" komórkowej - swoiste komórki efektorowe
rozpoznawanego Ag.
Cechy Ag:
 immunogenność: zdolność do wzbudzania odpowiedzi organizmu Powinowactwo (ang. affinity)
cecha, która określa siłę
 antygenowość: zdolność do reagowania ze wzbudzonymi przez
Schemat przeciwciała:
siebie komórkami lub przeciwciałami wiązania pomiędzy
1. fragment wiążący antygen
pojedynczym epitopem a
2. region Fab
Podział Ag:
3. region Fc
pojedynczym miejscem
niebieskie - łańcuchy ciężkie
1.
wiązania przeciwciała.
żółte - łańcuchy lekkie
 grasicozależne - wymagają obecności limfocytów T dla aktywacji
ciemnoniebieskie/żółte - regiony
zmienne
limfocytów B do produkcji Ab. Powstają głównie Ab IgG (wysoka Zachłanność (ang. avidity )
jasnoniebieskie/żółte - regiony
swoistość), wzbudzają dobrą pamięć immunologiczną,
wiązanie się Ab z całą
stałe
szare - mostki dwusiarczkowe
 grasiconiezależne - bezpośrednio aktywują limfocyty B, powstają cząsteczką Ag
Ab IgM (niska swoistość), wzbudzają słabą pamięć
wielodeterminantowego.
immunologicznÄ…. Superantygeny.
2.
 cząstkowe (korpuskularne) - silnie immunogenne, całe komórki,
Przeciwciała monoklonalne (mAb) - skierowane przeciwko jednej
wirusy
determinancie antygenowej (determinanta=epitop, miejsce wiÄ…zania Ag
 rozpuszczalne - słabo immunogenne, toksyny, białka, LPS,
z Ab)
DNA/RNA
METODY OZNACZANIA PRZECIWCIAA

Testy immunoenzymatyczne
Testy aglutynacyjne
Testy precypitacyjne i immunodyfuzji
Metody immunoelektroforetyczne
TECHNIKI
Testy immunofluorescencyjne
IMMUNOENZYMATYCZNE
Ab Ag KI
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
ELISA Test ELISA należy do szerszej grupy tzw. testów fazy stałej, ale nie jest
testów fazy stałej
pierwszym, który został wynaleziony, chociaż jest jednym z najczęściej
stosowanych.
test immunoenzymatyczny lub immunoenzymosorbcyjny, jest
W metodzie ELISA stosuje się 96- dołkową płytkę płaskodenną
jednym z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach
biomedycznych, zarówno naukowych, jak i diagnostycznych wykonaną z syntetycznych polimerów. Czułość tej metody dorównuje
metodzie RIA, a jest znacznie tańsza, prostsza i nie naraża na kontakt
substancjami radioaktywnymi.
Służy do:
 wykrywania i określania stężeń leków, hormonów, enzymów, nawet
jeżeli występują one w bardzo małych ilościach w płynach
tkankowych
 do oceny odporności humoralnej (ocena stężenia immunoglobulin w
surowicy), układu dopełniacza (określenie stężenia poszczególnych
jego składników)
 rutynowo stosuje siÄ™ w diagnostyce wirusa CMV, HIV, rozpoznaniu
WZW A itp.
 może też być stosowany do wykrywania alergenów pokarmowych tj.
mleko, jajka, orzeszki ziemne, migdały, w przemyśle spożywczym
Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza
1. Opłaszczanie przeprowadza się
przez dodanie do studzienki
ETAPY TESTU ELISA
antygenu przeznaczonego do
umieszczenia na fazie stałej.
ELISA to technika biochemiczna stosowana do wykrywania
Całość jest następnie inkubowana
obecności Ab lub Ag w badanych próbach. Możemy zastosować
przez określony czas, najpierw
metodę pośrednią (2) lub bezpośrednią (1). W metodzie
zwykle w temperaturze 37°C, a
bezpoÅ›redniej stosujemy tylko jeden rodzaj Ab, które sÄ… znakowane potem 4°C, cho ć możliwe sÄ… także
inne metody, co zależy od
natomiast w pośredniej pierwsze Ab swoiste do Ag nieznakowane i
przeprowadzanego badania.
drugie Ab znakowane enzymem swoiste do pierwszych przeciwciał.
Temperatura jest jednym z
najważniejszych czynników, nie
może jednak przekroczyć 56°C,
gdyż w przypadku białek dojdzie do
denaturacji.
2. Po przeprowadzeniu opłaszczenia
należy jeszcze zablokować miejsca
niezajęte przez antygen. Dokonuje
się tego za pomocą czynników
blokujÄ…cych, np. roztworu
owoalbuminy lub odtłuszczonego
mleka, co zapobiega
nieselektywnemu przyłączaniu się
białek do fazy stałej podczas
następnych etapów testu,
wymagających także inkubacji w
określonych temperaturach.
Kompetycyjny (rywalizacyjny) test ELISA
3. Następnie dodajemy
(c-ELISA, z ang. competitive ELISA)
do studzienek płytki
próby surowicy w której
będziemy wykrywać
obecność Ab swoistych
Stosuje się mieszankę znakowanego Ab, która jest dodawana do
do opłaszczonych Ag. badanego materiału.
4. Dodajemy Ab Podobnie jak w innych typach ELISA mierzących stężenie Ab, faza
stała jest opłaszczona odpowiednim Ag.
znakowane ezymem
skierowane przeciwko
Jeśli na fazę stałą podziałamy mieszanką badanej surowicy i
ludzkim przeciwciałom.
specyficznego względem danego antygenu mAb wyznakowanego
enzymem, to nastąpi współzawodnictwo pomiędzy przeciwciałami w
5. Nanosimy substrat
surowicy, a przeciwciałem znakowanym.
dla enzymu np..
chromogen.
W odróżnieniu od poprzedniej metody natężenie reakcji enzymatycznej
będzie odwrotnie proporcjonalne do stężenia przeciwciał w surowicy
im większe będzie ich stężenie, tym mniej znakowanego przeciwciała
6. Odczytujemy wyniki
przyłączy się do antygenu umieszczonego na fazie stałej.
na spektrofotometrze.
UniCAP
technologia ImmunoCAP została
przedstawiona przez Pharmacia w
1989r.
całkowicie zautomatyzowany
wysokie standardy prowadzenia badań
wynik uzyskuje siÄ™ zwykle w ciÄ…gu 2,5
godz.
urzÄ…dzenie przechowuje krzywÄ… METODY OPARTE NA
kalibracyjnÄ…
automatyczna kalkulacja wyników
REAKCJI AGLUTYNACJI
ImmunoCAP sIgE
test in-vitro mierzy poziom alergenowoswoistych IgE w plazmie lub
surowicy pacjentów, co umożliwia ocenę uwrażliwienia pacjenta na dany
alergen. ImmunoCAP pozwala na ilościową ocenę szerokiego rodzaju
alergenów  ponad 550, pozwala przewidzieć ryzyko rozwoju alergii w
przyszłości, swoistość testu 85-94%
Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza
Aglutynacja
 reakcja zachodząca pomiędzy swoistymi Ab a Ag cząstkowymi
(wchodzącymi w skład otoczek komórek bakteryjnych, grzybów,
erytrocytów, komórek ludzkich i zwierzęcych)
 może zachodzić między swoistymi Ab a Ag rozpuszczalnym
opłaszczonym na cząsteczkach lateksu
 komórki z przyłączonymi Ab tworzą przestrzenne agregaty
wypadajÄ…ce z roztworu w postaci aglutynatu
Aglutynacja jest odczynem stosowanym w chorobach zakaz
nych,
Hemaglutynacja
wywoływanych przez bakterie, nie ma natomiast zastosowania w
chorobach wirusowych.
Teoretycznie można go stosować wszędzie tam, gdzie wyhoduje się  aglutynacja czerwonych krwinek
drobnoustrój, z którego można sporządzić antygen.
 hemaglutynacja bezpośrednia, czyli czynna, w której zlepianie
erytrocytów wywoływane jest przez różne drobnoustroje. To zjawisko
Zaletą odczynu jest prostota jego wykonania, szybkość wystąpienia
reakcji, łatwość odczytania wyników i stosunkowo wysoka czułość.
może zostać zahamowane działaniem surowicy zawierającej swoiste
przeciwciała skierowane przeciwko drobnoustrojom zlepiającym
krwinki
Zastosowanie metody aglutynacji
 hemaglutynacja pośrednia, czyli bierna, zachodzi wówczas, gdy na
erytrocyty opłaszczone jakimś antygenem zadziałamy surowicą
w identyfikacji Ag powierzchniowych komórek
odpornościową, zawierającą przeciwciała swoiste dla antygenu
do wykrywania Ag w badanych surowicach
do oznaczania poziomu Ab w surowicy przez
zaadsorbowanego na powierzchni krwinki.
wyznaczenie miana aglutynacyjnego
Miano aglutynacyjne jest to największe rozcieńczenie surowicy
badanej (lub najmniejsze stężenie Ag), przy którym widoczne
sÄ… jeszcze aglutynaty.
Oznaczanie grup krwi z
zastosowaniem krwinek
wzorcowych  materiałem
od pacjenta jest surowica
( szukamy Ab)
A 0 B
Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza
Precypitacja
 reakcja między cząsteczką Ab swoistego a Ag rozpuszczalnym (o
masie cząsteczkowej 40-160kDa) zachodząca w środowisku
płynnym
 1 faza: Ag reaguje z Ab i powstajÄ… kompleksy immunologiczne (KI)
 2 faza: powstałe KI w środowisku elektrolitów wypadają w postaci
METODY OPARTE NA
precypitatów widocznych gołym okiem
 Ag i Ab łączą się ze sobą w różnych stosunkach ilościowych, do
REAKCJI PRECYPITACJI
powstania kompleksów widocznych gołym okiem dochodzi w strefie
ekwiwalencji, czyli strefie równowagi stężeń obu reagentów
 przed nastawieniem reakcji precypitacji należy pamiętać o
inaktywacji surowicy, ze względu na obecność dopełniacza, który
może rozpuszczać KI. Inaktywacja zachodzi w temp. 56°C przez 30
min.
Immunodyfuzja
 reakcja precypitacji zachodząca w środowisku żelowym
 oparta jest na zjawisku dyfuzji cząsteczki Ag i Ab w żelu
 precypitat powstaje w strefie ekwiwalencji w miejscu zetknięcia się
obu reagentów, widoczny w postaci linii, łuków lub pierścienia
precypitacyjnego
 szybkość dyfuzji reagentów w żelu jest odwrotnie proporcjonalna
do wielkości cząsteczki i wprostproporcjonalna do stężenia
reagentów
 stosuje się zwykle 1-2% żel agarowy lub agarozowy jako środ.
reakcji, który pozwala na swobodną dyfuzję
 zależy od takich samych czynników co precypitacja probówkowa
 dwa typy immunodyfuzji:
" pojedyńcza  dyfunduje tylko jeden z reagentów (zwykle Ag),
a drugi z nich (Ab) występują w żelu w jednakowym stężęniu
" podwójna  zarówno Ag i Ab dyfundują w żelu
 można wykonywać w probówkach i na płytkach
IMMUNOELEKTROFOREZA
Elektroforeza białek jest metodą rozdziału białek występujących we
krwi (w surowicy) lub w moczu.
Podczas badania prąd elektryczny użyty jest do poruszania się białek w
METODY
cienkiej warstwie agaru o konsystencji żelu.
IMMUNOELEKTROFORETYCZNE
Odległości jakie pokonują białka zależą od ich wielkości, kształtu i
Å‚adunku elektrycznego.
Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza
Immunoelektroforeza jest używana do jakościowych analiz mieszanin
antygenów, może jednak stanowić również pewien wskaz
nik ilościowy
(grubość łuków i linii precypitacyjnych).
Test ten jest powszechnie używany do analizy składowych surowicy
pacjenta surowica jest umieszczana w wyciętym dołku, a
przeciwciało do całej surowicy w korytku. Poprzez porównanie z
 normalną surowicą można ocenić czy widoczne są różnice  brak
białka, jego niedobór lub nadmiar.
Test może być również wykorzystany do oceny czystości
wyizolowanych białek surowicy.
IMMUNOFLUORESCENCJA
Stosuje siÄ™ dwa warianty metody immunofluorescencji (IF):
Testy immunofluorescencyjne
 Testy immunofluorescencyjne bezpośrednie wykrywają przy
pomocy znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał określony
 sÄ… standardowÄ… technikÄ… immunologicznÄ… (gold standard) w
antygen.
diagnostyce przeciwciał przeciwbakteryjnych,
przeciwwirusowych a także skierowanych przeciw tkankom
organizmu, komórkom i ich częściom
 Testy immunofluorescencyjne pośrednie wykrywają przy
pomocy znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał
 charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością
immunoglobuliny, które uprzednio związały się ze swoistym
 wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami
antygenem.
fluorescencyjnymi
 do najczęściej stosowanych
barwników należy izotiocyjanian
fluoresceiny (FITC), który po
wzbudzeniu emituje kolor zielony oraz
izotiocyjanian tetrametylorodaminy
(TRITC), który po wzbudzeniu emituje
kolor czerwony
 z
ródłem antygenów są substraty
tkankowe pozwalajÄ…ce na wykrywanie
szerokiego spektrum przeciwciał
Diagnostyka kiły - Test immunofluorescencji pośredniej Diagnostyka kiły - Test immunofluorescencji pośredniej c.d.
Po przepłukaniu, dodaje się przeciwciała swoiste wobec ludzkich
Na szkiełko podstawowe nanosi się krętki kiły Treponema
immunoglobulin. Przeciwciała te znakowane są barwnikiem
pallidum (krętki pochodzą z laboratorium)
fluorescencyjnym.
Dodaje siÄ™ surowicÄ™ pacjenta
Jeśli surowica badanej osoby zawiera przeciwciała swoiste wobec
Wynik pozytywny osoba zarażona pod mikroskopem
krętków (tj. zaraziła się kiłą), to zwiążą się one z krętkami na szkiełku
fluoresencyjnym obserwuje się fluoryzujące krętki
Wynik negatywny osoba  niezarażona brak "świecenia"
Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza
Układ dopełniacza
METODY OZNACZANIA SKA
ADOWYCH
(complement system)
DOPEA
NIACZA
 mechanizm odporności nieswoistej
Ocena dopełniacza ma na celu:
 składa się z ok. 30 białek
występujących w surowicy i tkankach  wykrywanie wrodzonych niedoborów składowych dopełniacza
 ulega pobudzeniu poprzez seriÄ™ reakcji
 ocenę aktywności chorób, w których dochodzi do jego pobudzenia
pomiędzy składnikami
 2 gł. drogi aktywacji: klasyczna (przez
Do oceny dopełniacza mierzymy stężenie jego składników lub
kompleks Ag-Ab) i alterntywna (przez
jego funkcje.
czynniki nieswoiste)
 bierze udział w uszkadzaniu kom.
bakteryjnych ILOÅšCIOWE OKREÅšLENIE SKA
ADNIKÓW DOPEA
NIACZA
 ważny czynnik odp. zapalnej
 jego aktywacja prowadzi do powstania
w surowicy mierzone jest stężenie poszczególnych składników lub
anafilatoksyn (C3a i C5a), które
produktów ich aktywacji, które są białkami np. metoda pojedynczej
powodujÄ… degranulacjÄ™ kom. tucznych i
bazofili, kurczą mięśnie gładkie i
immunodyfuzji radialnej, ELISA, nefelometria
zwiększają przepuszczalność naczyń.