2009-12-01
METODY OZNACZANIA BIAA
EK
Metoda biuretowa
Metoda biuretowa
Metoda Lowrego (Folin-Ciocalteu)
Metoda z użyciem kwasu bis-cynchoninowego (BCA)
Metoda Bradforda
Absorpcja w nadfiolecie
Metoda turbidymetryczna
Metoda nefelometryczna
METODA BIURETOWA
WiÄ…zanie peptydowe
A
ańcuch peptydowy
Barwny kompleks (kolor fioletowy)
1
2009-12-01
METODA BIURETOWA
Skład odczynnika :
CuSO4, winian sodowo  potasowy, NaOH, KJ (winian sodowo-potasowy - stabilizator,
KJ zapobiega autoredukcji alkalicznego kompleksu miedzi)
KJ zapobiega autoredukcji alkalicznego kompleksu miedzi)
Pomiar absorbancji  540 nm
_________________________________________
Czułość metody: 2 - 15 g/L
Stosunkowo mało substancji interferujących
(sole amonowe, jony magnezu, biuret)
Intensywność barwy powstałego kompleksu nie zależy od składu
Intensywność barwy powstałego kompleksu nie zależy od składu
aminokwasowego oznaczanego białka
Metoda tania, nieskomplikowana, niewątpliwą jej zaletą jest również
możliwość przystosowania do suchej chemii
Metoda użyteczna również do oznaczania peptydów
METODA BIURETOWA
Zastosowanie:
oznaczanie białka całkowitego w surowicy
(wartość referencyjna: 60-80 g/L)
HITACHI-902
2
2009-12-01
METODA BIURETOWA
Oznaczanie białka:
PMR  wartość referencyjna: 0,15 - 0,45 g/l
PMR wartość referencyjna: 015- 045g/l
VITROS 5,1 FS Chemistry System
METODA LOWRY EGO (FOLIN-CIOCALTEU)
1.
+
2. jony Cu redukujÄ… kwas fosforowolframowy i fosforomolibdenowy do
barwnych (niebieskich) tlenków  reakcja katalizowana przez tyrozynę,
tryptofan, cysteinÄ™ i prawdopodobnie histydynÄ™ zawarte w oznaczanym
białku
3
2009-12-01
METODA LOWRY EGO (FOLIN-CIOCALTEU)
Skład odczynników:
CuSO4 ,winian sodowo  potasowy, NaOH, Na2CO3
odczynnik Folin-Ciocalteu (mieszanina kwasu fosfowolframowego i kwasu
fosfomolibdenowego)
fosfomolibdenowego)
Ponieważ odczynnik Folin-Ciocalteu nie jest stabilny w środowisku alkaicznym, musi
być prowadzona jako reakcja dwuetapowa
Stężenie barwnego produktu mierzy się spektrofotometrycznie przy długości fali
750 nm
_______________________________________________
Metoda bardziej czuła niż metoda biuretowa: 10mg/L  1 g/L
Znacznie więcej substancji interferujących ( p Tris, HEPES, EDTA, SDS i inne
Ä™ jjjÄ… y (np. , , ,
detergenty, mocznik, DTT, merkaptoetanol, zwiÄ…zki tiolowe, redukujÄ…ce cukry),
reakcja wymaga ścisłej kontroli pH
Proces dwuetapowy  więc bardziej czasochłonny
Trudna do automatyzacji
Natężenie powstałej barwy różna dla różnych białek (zależy od zawartości
aminokwasów: tyrozyny, tryptofanu, cysteiny  problemy z otrzymaniem
uniwersalnej krzywej kalibracyjnej)
METODA Z UŻYCIEM KWASU BIS-CYNCHONINOWEGO
(BCA)
Fioletowo niebieski barwny kompleks
Fioletowo  niebieski barwny kompleks
4
2009-12-01
METODA Z UŻYCIEM KWASU BIS-CYNCHONINOWEGO
(BCA)
Skład odczynnika:
Na2CO3, NaOH , Na2C4H4O6 , CuSO4, BCA
Na2CO3 NaOH Na C H O CuSO4 BCA
Pomiar absorbancji  562 nm
___________________________________________________
Czułość metody 0,1 1 g/L lub 0,5  10 mg/L
Niewielkie różnice współczynnika absorpcji dla różnych białek
Reakcja jednoetapowa - kompleks jest stabilny w środowisku alkaicznym
Znacznie większa tolerancja metody na większość czynników
interferujÄ…cych z metoda Lowry ego (przede wszystkim detergenty)
interferujÄ…cych z metoda Lowry ego (przede wszystkim detergenty)
Możliwość automatyzacji metody
Niemożność przeprowadzenia reakcji w temperaturze pokojowej (37 °C,
wyższa temperatura przyspiesza reakcję  możliwość modyfikacji)
METODA BRADFORDA
5
2009-12-01
METODA BRADFORDA
odczynnik Bradforda +BSA (12źg/ml)
1.2
odczynnik Bradforda
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
400 450 500 550 600 650 700
nm
METODA BRADFORDA
Skład odczynnika:
Coommassie Brillant Bl G- 250, 95% etanol, 85% k
Ci B ill t Blue G 250 95% t l 85% kwas
fosforowy
Pomiar absorbancji  595 nm
_________________________________________________________
_______
Szeroko stosowana  Å‚atwa w przygotowaniu, wysoce specyficzna
dla białek
Duża czuÅ‚ość metody: 1-10 µg ( ) µg
y µg (micrometoda) 10-100 µg
(macrometoda)
Test kompatybilny z większością substancji interferujących w
metodach Lowrego i BCA
6
A
2009-12-01
METODA BRADFORDA
Nieliniowa krzywa kalibracyjna
Współczynnik absorpcji ściśle zależy
od rodzaju mierzonego białka (przede
wszystkim od zawartości takich
aminokwasów jak lizyna i arginina w
białku), bardzo ważny dobór
odpowiedniej krzywej kalibracyjnej
d i d i j k j k lib j j
Ważny czas prowadzenia reakcji 
kompleks barwnik  białko jest
stabilny przez około 1 godzinę
7
2009-12-01
ABSORBANCJA W NADFIOLECIE
Pomiar absorbancji roztworu białka przy długości fali 280 nm
Używana do oszacowania stężenia białka, lub do detekcji np.
przez detektor HPLC
Światło absorbowane jest przede wszystkim przez
aromatyczne aminokwasy obecne w białku (tyrozyna,
tryptofan)
Metoda najmniej czuła ze wszystkich wcześniej
wymienionych
wymienionych
Znaczna ilość substancji interferujących (np. kwasy
nukleinowe)
METODA NEFELOMETRYCZNA
Zasada metody: wykorzystuje efekt Tyndalla  zjawisko
Zasada metody: wykorzystuje efekt Tyndalla zjawisko
rozpraszania się światła na cząstkach fazy rozproszonej.
Jest metodą analityczną polegającą na pomiarze natężenia
światła rozproszonego przez zawiesinę pod kątem różnym od
180 stopni w stosunku do warstwy padającej (najczęściej pod
kÄ…tem 90 lub 45 stopni).
Pomiar natężenia światła rozproszonego może być
Pomiar natężenia światła rozproszonego może być
wykorzystywany do oznaczania stężenia, a także do określania
stopnia rozdrobnienia koloidów, gdyż natężenie światła
rozproszonego zależy od wielkości cząstek substancji
rozpraszajÄ…cej.
8
2009-12-01
METODA NEFELOMETRYCZNA
Najpopularniejszy analizator  BEHRING Nephelometer II
(immunonefelometria)
Szeroki panel oznaczanych białek:
(albumina, prealbumina, CRP (hs CRP), transferyna, immunoglobuliny,
transferyna, ceruloplazmina, haptoglobina, składniki dopełniacza, SAA,
cystatyna C,beta2 mikroglobulina, alfa1 maktoglobulina, łańcuchy lekkie
immunoglobulin  kappa, lambda)
Wykorzystywany materiał  surowica/ osocze, mocz, PMR
Nie nadaje się do oznaczeń w roztworach wstępnie mętnych
(lipemia)
METODA NEFELOMETRYCZNA
Krzywa Heidelberga
9
2009-12-01
METODA TURBIDYMETRYCZNA
I0
Zasada metody:
I nefelometria I nefelometria
I turbidymetria
Metoda zmętnieniowa: z użyciem kwasu TCA (trichlorooctowego),
kwasu sulfosalicylowego, chlorku benzetonium (NaOH)
Zastosowanie: pomiar białka całkowitego w moczu, PMR
(analizator Hitachi  Roche Diagnostics)
Liniowość w zakresie 2  200 mg/dl
10