Badanie szybkości hydrolizy lipidów mleka i oznaczanie aktywności lipazy
trzustkowej
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest poznanie alkacymetrycznej metody oznaczania aktywności lipazy
trzustkowej z u\
yciem śmietanki jako naturalnej emulsji lipidu oraz badanie szybkości
katalizowanej reakcji zale\
nie od czasu jej trwania.
Wprowadzenie
Lipazy (EC 3.1.) to enzymy klasy hydrolaz, podklasy esteraz katalizujące reakcję hydrolizy wiązań
estrowych triacylogliceroli (TAG) nierozpuszczalnych w wodzie. Reakcja ta zachodzi na styku
fazy wodnej ( lipazy) z fazą lipidową (substratu) prowadząc do powstania kwasów tłuszczowych,
diacylogliceroli (DAG), monoacylogliceroli (MAG) i glicerolu.
Enzymy te odznaczają się niską specyficznością substratową gdy\
odpowiadają za rozkład estrów
utworzonych przez kwasy tłuszczowe o krótkim lub długim łańcuchu zarówno nasycone i
nienasycone oraz alkohole jedno lub wielowodorotlenowe mające łańcuch krótki lub długi.
Lipazy występują w organizmach ludzi i zwierząt ( w trzustce, wątrobie, ścianie \
ołądka i jelit), w
nasionach i organach wegetatywnych wielu roślin oraz u niektórych mikroorganizmów.
Zale\
nie od pochodzenia enzymy te ró\
nią się optimum pH działania. Dla lipazy trzustkowej
wynosi ono około 7.0, dla lipazy wątrobowej około 8.0, a dla lipaz roślinnych 4.5 5.0.
Temperatura efektywnego dziaÅ‚ania lipaz mieÅ›ci siÄ™ miedzy 35°C a 37°C.
W trawieniu lipidów po\
ywienia ludzi i zwierząt, największe znaczenie ma lipaza trzustkowa,
wątrobowa i jelitowa. W jelicie cienkim człowieka, gdzie odbywa się właściwe trawienie
acylogliceroli i fosfolipidów pokarmowych, aktywność lipaz wzmagają składniki \
ółci wydzielanej
do światła dwunastnicy. Obecne w \
ółci sole kwasów \
ółciowych obni\
ają napięcie
powierzchniowe kuleczek tłuszczu, co przy równoczesnym mieszaniu treści dwunastniczej
prowadzi do emulsyfikacji tłuszczów (zwiększenia powierzchni granicznej między fazą wodną i
kuleczkami lipidu).
Lipaza trzustkowa działając na triacyloglicerole odłącza kwasy tłuszczowe przy skrajnych atomach
węgla C1 i C3. Produktem tej reakcji jest mieszanina 2-monoacyloglicerolu i wolnych kwasów
tłuszczowych (rys.1). Triacyloglicerole są nierozpuszczalne w wodzie stąd hydroliza z udziałem
tego enzymu odbywa siÄ™ powoli. W miarÄ™ wzrostu stÄ™\
enia diacylogliceroli, które są bardziej
polarne ni\
triacyloglicerole, rośnie szybkość działania lipazy trzustkowej.
Aktywność tego enzymu mo\
e być regulowana przez ró\
nego rodzaju aktywatory i inhibitory.
Aktywatorami sÄ… m.in. jony Ca2+, cyjanek, zwiÄ…zki zawierajÄ…ce grupÄ™  SH, inhibitorami zaÅ› sÄ…
ketony, aldehydy oraz zwiÄ…zki reagujÄ…ce z grupami  SH.
O
H2C OH
H2C O C R
1
1
O
O O
+ 2 H2O
HC O C R
+
HC O C R 2 HO C R
2
2
2
O
lipaza
kwas tluszczowy
H2C OH
H2C O C R
3
3
2-acyloglicerol
triacyloglicerol
Rys.1. Hydroliza triacyloglicerolu z udziałem lipazy trzustkowej: R  reszta alkilowa kwasu
tłuszczowego związanego estrowo z glicerolem
Badanie aktywności lipaz ma znaczenie diagnostyczne. Niska aktywność tych enzymów w osoczu
występuje przy schorzeniach wątroby, awitaminozie A, niektórych nowotworach złośliwych i
cukrzycy natomiast aktywność lipaz wzrasta przy ostrym zapaleniu trzustki i raku trzustki.
Metody oznaczania aktywności lipaz
Aktywność lipaz mo\
na badać określając ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych w czasie
działania enzymu w optymalnych warunkach doświadczalnych.
Większość metod opiera się na alkacymetrycznym oznaczeniu uwolnionych kwasów tłuszczowych
w wyniku działania lipazy na estry rozpuszczalne w wodzie np. tween lub nierozpuszczalne np.
substraty naturalne (lipidy). Substraty nierozpuszczalne w wodzie powinny znajdować się w postaci
zemulgowanej tj. silnie rozproszonej. Otrzymanie jednorodnej emulsji i zachowanie jej przez cały
czas działania enzymu ma podstawowe znaczenie przy oznaczaniu jego aktywności.
Zasada stosowanej metody
Metoda stosowana na ćwiczeniu opiera się na pomiarze ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych z
lipidów mleka pod dziaÅ‚aniem lipazy trzustkowej w temp. 37°C i poczÄ…tkowym pH 7.7, którego
wartość z upływem czasu ulega niewielkiemu obni\
eniu (do pH 7.0) w wyniku uwalniania kwasów
tłuszczowych. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych oznacza się przez miareczkowanie
mieszaniny inkubacyjnej mianowanym roztworem wodorotlenku potasowego wobec fenoloftaleiny.
W opisanej metodzie, dopiero po 60 minutach inkubacji uzyskuje się proporcjonalność między
ilością wyciągu trzustkowego a szybkością reakcji.
Odczynniki
1. 12 % słodka śmietanka homogenizowana zobojętniona 1-molowym wodorotlenkiem potasowym
z dodatkiem 1 ml toluenu na 100 ml śmietanki (śmietankę o wy\
szej zawartości tłuszczu
rozcieńczyć wodą).
2. 0,7-molowy bufor fosforanowy o pH 7,7.
3. 96 % etanol (mo\
e być ska\
ony, np. metanolem, acetonem) lub metanol.
4. 0,5 % fenoloftaleina w 70 % etanolu.
5. 0,05-molowy mianowany roztwór wodorotlenku potasowego.
6. Wyciąg z trzustki wieprzowej; 30 g odtłuszczonej trzustki homogenizować przez ok. 5 min
(z przerwami, aby uniknąć nagrzania się roztworu) ze 100 ml wody i uzupełnić wodą do 1 l;
homogenat przesączyć przez podwójną warstwę gazy, wirować przy 4000 obr./min przez 10 minut i
przesączyć przez sączek z waty.
Wykonanie
Otrzymany w kolbie miarowej ekstrakt enzymatyczny lipazy uzupełnić wodą do kreski i dobrze
wymieszać. Do 6 enzymatycznie czystych probówek (próby pełne) odmierzyć po 2,5 ml śmietanki
(1) i po 1 ml buforu (2). Wymieszać i umieścić w łaz
ni wodnej o temp. 37°C. Po okoÅ‚o 5 minutach
do wszystkich sześciu probówek dodać kolejno z otrzymanej kolby miarowej po 0,5 ml ekstraktu
lipazy, dobrze wymieszać i wstawić do łaz
ni wodnej.
Po 20 minutach od dodania enzymu wyjąć z łaz
ni dwie probówki, dodać po 5 ml etanolu (3), kilka
kropli fenoloftaleiny (4) i całość mieszaniny przenieść do kolby sto\
kowej na 100 ml. Zawarte w
próbie kwasy tłuszczowe miareczkować mianowanym roztworem wodorotlenku potasu (5) do
trwałego ró\
owego zabarwienia (wszystkie próby miareczkować do barwy o takiej samej
intensywności).
Kolejne dwie próby wyjąć po 40 minutach, a ostatnie dwie po 60 minutach
od dodania enzymu i postępować z nimi wg. procedury opisanej wy\
ej.
Chcąc określić kwasowość składników mieszaniny inkubacyjnej nale\
y wykonać tak\
e próbę
kontrolną (w dwóch powtórzeniach).
W tym celu nale\
y odmierzyć do dwóch kolb sto\
kowych na 100 ml po 2,5 ml śmietanki (1), 1 ml
buforu (2), 5 ml etanolu (3), kilka kropli fenoloftaleiny (4) oraz 0,5 ml ekstraktu lipazy a następnie
miareczkować (jak wy\
ej) mianowanym roztworem wodorotlenku potasowego (5).
Dla zbadania samej aktywności lipazy trzustkowej nale\
y wykonać oznaczenie po 60 minutach
(dwie próby pełne), jak to opisano wy\
ej.
Obliczenie aktywności lipazy trzustkowej
1. Od uśrednionej objętości mianowanego roztworu KOH zu\
ytego do miareczkowania prób
pełnych po 60 minutach inkubacji, odjąć średnią wartość próby kontrolnej. Aktywność lipazy
wyrazić w µmolach kwasów tÅ‚uszczowych uwolnionych w ciÄ…gu 1 minuty przez enzym z 1g
trzustki wiedzÄ…c, \
e 1ml 0,05-molowego wodorotlenku potasowego zobojÄ™tnia 50 µmoli kwasów
tłuszczowych oraz uwzględniając schemat rozcieńczeń podany przez prowadzącego.
Przykładowe obliczenia:
Uśredniona objętość roztworu Uśredniona objętość roztworu Ró\
nica między próbą po 60
KOH zu\
ytego do KOH zu\
ytego do minutach inkubacji a próbą
zmiareczkowania prób zmiareczkowania prób po 60 kontrolą (P2  P1)
kontrolnych (P1) minutach inkubacji (P2)
7,2 ml 30,2 ml 23 ml
Je\
eli 1 ml KOH zobojÄ™tnia 50 µmoli kwasów tÅ‚uszczowych to 23 ml KOH zobojÄ™tni 1150 µmoli
kwasów tłuszczowych.
Do reakcji pobrano 0,5 ml ekstraktu lipazy trzustkowej zatem ilość uwolnionych kwasów
tÅ‚uszczowych przez 0,5 ml lipazy wynosi 1150 µmoli.
Aktywność lipazy w 10 ml roztworu jest wiÄ™c równa 23000 µmolom uwolnionych kwasów
tłuszczowych.
WiedzÄ…c, \
e przed uzupełnieniem do objętości 10 ml kolba zawierała 5 ml roztworu lipazy
trzustkowej przygotowanego przez homogenizacjÄ™ 30g trzustki z 1000 ml wody mo\
emy obliczyć
aktywność lipazy w następujący sposób:
" aktywność 5 ml wyjÅ›ciowego roztworu lipazy wynosi 23000 µmoli kwasów tÅ‚uszczowych
" aktywność 1 g trzustki wynosi 153333,33 µmoli kwasów tÅ‚uszczowych, a po uwzglÄ™dnieniu
czasu reakcji enzymatycznej wynoszącego 60 minut, aktywność enzymu będzie równa
2555,55 µmoli kwasów tÅ‚uszczowych x min. -1 x g -1 trzustki.
2. Obliczyć liczbÄ™ µmoli uwolnionych kwasów tÅ‚uszczowych w 20 minutowych przedziaÅ‚ach czasu,
tj. 0 20, 20 40 i 40 60 minut wiedzÄ…c, \
e 1ml 0,05-molowego wodorotlenku potasowego
zobojÄ™tnia 50 µmoli kwasów tÅ‚uszczowych. Obliczenia nale\
y prowadzić jak opisano powy\
ej
uwzględniając jedynie ró\
nice czasu inkubacji tj. 20, 40, i 60 minut.
3. Sporządzić wykres przedstawiający zale\
ność szybkości reakcji hydrolizy tłuszczu od czasu,
odkÅ‚adajÄ…c na osi rzÄ™dnych µmole kwasów tÅ‚uszczowych, a na osi odciÄ™tych czas w minutach. Na
podstawie otrzymanych wyników wnioskować o szybkości hydrolizy lipidów w badanych
przedziałach czasu.
Pytania
1. Dlaczego lipazy charakteryzują się niską specyficznością substratową?
2. Jakie znaczenie diagnostyczne ma badanie aktywności lipaz?
3. Przedstaw sposób działania lipazy trzustkowej na TAG. Dlaczego szybkość uwalniania
kwasów tłuszczowych z tłuszczu mleka jest niska na początku reakcji i rośnie wraz ze
wzrostem stÄ™\
enia DAG ?
4. Podaj zasadę stosowanej na ćwiczeniach metody oznaczania lipazy. Wyjaśnij dlaczego do
mieszaniny inkubacyjnej dodaje siÄ™ bufor o wysokim stÄ™\
eniu?
5. 30 g trzustki wieprzowej po homogenizacji rozcieńczono do 1000 ml. Następnie pobrano 5
ml i rozcieńczono do 25 ml. Do oznaczenia aktywności lipazy pobrano 1ml wyciągu
enzymatycznego i przez 60 minut inkubowano z substratem. Uśredniona objętość roztworu
KOH zu\
ytego do zmiareczkowania próby pełnej wynosiła 21,5 ml, a próby kontrolnej 4,5
ml. Oblicz aktywność lipazy trzustkowej w mmolach kwasów tłuszczowych na 1 min. i 1g
trzustki.
Literatura
1. Thomas F., Whayne Jr., J. F. Morelli. (1977) Biochem. Med. 17: 248-257.
2. Walter G.L., McGraw P., Tvedten H.W. Vet Clin Pathol. (1992) 21:23-27.
3. Balcao V. M., Malcata F. X. Biotechnol. Adv. (1998) 16: 309-341.
4. Rotticci D., Norin T., Hult K., Martinelle M. Biochim Biophys Acta. (2000) 1483: 132-40.
5. Bańkowski E., Biochemia, MedPharm Polska, Wrocław 2006.