Oznaczenie aktywności aminotransferazy asparaginianowej
i alaninowej
Cel ćwiczenia
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się ze spektrofotometryczną metodą oznaczenia
aktywności aminotransferazy asparaginianowej i aminotransferazy alaninowej, dwóch
enzymów nale\
Ä…cych do klasy transferaz, majÄ…cych podstawowe znaczenie w przenoszeniu
grup aminowych aminokwasów.
Wprowadzenie
Aminotransferazy: asparaginianowa (L-asparaginian:2-oksoglutaran, EC 2.6.1.1)
i alaninowa (L-alanina:2-oksoglutaran , EC 2.6.1.2) nale\
Ä… do klasy transferaz. SÄ… to enzymy
przenoszące w sposób odwracalny grupę aminową wraz z protonem i parą elektronów
z aminokwasu na węgiel karbonylowy najczęściej 2-oksokwasu. W wyniku reakcji substrat
aminokwasowy staje siÄ™ oksokwasem, a wchodzÄ…cy w reakcjÄ™ oksokwas - aminokwasem.
Tego typu reakcje znane są pod nazwą transaminacji. Głównym związkiem biorącym udział
w procesach transaminacji jest 2-oksoglutaran, który jest akceptorem grup  NH2
pochodzących od większości aminokwasów, ulegając przekształceniu w kwas L-glutaminowy.
Aminotransferazy zazwyczaj katalizują reakcje transaminacji z udziałem kilku
ró\
nych par substratów aminokwas  2-oksokwas, a ta sama para substratów mo\
e
uczestniczyć w reakcjach katalizowanych przez ro\
ne aminotransferazy. Jednak\
e większość
z tych enzymów wykazuje wy\
szą specyficzność w stosunku do 2-oksokwasu jako akceptora
grupy aminowej, ni\
w stosunku do jej dawcy, jakim jest aminokwas. Transaminacje
przebiegające z udziałem aminotransferaz nie wymagają nakładu energii metabolicznej,
zwykle są całkowicie odwracalne, a ich kierunek zale\
y od względnego stę\
enia pary
aminokwas  2-oksokwas.
Wszystkie reakcje transaminacji przebiegają zgodnie ze wspólnym mechanizmem
nazywanym: Ping-Pong Bi Bi. Grupą czynną biorącą udział w tej przemianie jest często silnie
związany z białkiem kofaktor (grupa prostetyczna lub koenzym): 5`-fosforan pirydoksalu
(pochodna pirydoksyny czyli witaminy B6) (rys.1).
Rys.1. 5`-fosforan pirydoksalu
Aminotransferazy zwykle są białkami zbudowanymi z dwu rzadziej z jednej
podjednostki, o masie czÄ…steczki w granicach 60 000 - 100 000 Da. Optimum pH dla
większości poznanych aminotransferaz zawiera się w przedziale 7,0 - 9,0, w zale\
ności od
z
ródła enzymu.
 Aminotransferaza asparaginianowa. Najlepiej poznaną aminotransferazą roślin
wy\
szych jest aminotransferaza asparaginianowa, (nazwa systematyczna: aminotransferaza
L-asparaginian: 2-oksoglutaran). Niezale\
nie od pochodzenia, enzym ten przejawia najwy\
szÄ…
aktywność w stosunku do pary substratów L-asparaginian - 2-oksoglutaran. Przebieg reakcji
z ich udziałem przedstawiono poni\
ej:
Aminotransferaza asparaginianowa pełni wiele wa\
nych funkcji w metabolizmie
roślin. Uczestniczy w przemianach aminokwasów, w wewnątrzkomórkowym systemie
wahadłowym przenoszącym wodory między cytosolem a chloroplastami czy peroksysomami,
w międzykomórkowym transporcie metabolitów podczas tzw. fotosyntezy typu C4. Pełniąc
tak wiele funkcji, enzym ten występuje w ró\
nych frakcjach tkankowych i subkomórkowych
roślin w postaci kilku izoenzymów. Na przykład, w liściach szpinaku wykryto 4 izoenzymy
tej aminotransferazy, pochodzÄ…ce ka\
dy z innej frakcji komórkowej: cytosolu, chloroplastów,
mitochondriów i peroksysomów. W przeliczeniu na gram świe\
ej masy materiału roślinnego
np. z siewek pszenicy aktywność aminotransferazy asparaginianowej przewy\
sza zazwyczaj
tÄ™ oznaczanÄ… dla aminotransferazy alaninowej ok. 1,2  krotnie.
Aminotransferaza alaninowa. Drugim bardzo istotnym enzymem biorącym udział
w przemianach aminokwasów jest aminotransferaza L-alanina:2-oksoglutaran, nazywana
aminotransferazÄ… alaninowÄ…. Katalizuje ona reakcjÄ™ przeniesienia grupy aminowej z L-alaniny
na 2-oksoglutaran oraz odwrotnÄ… do niej, z L-glutaminianu na pirogronian. Reakcja przebiega
następująco:
Enzym ten, podobnie, jak aminotransferaza asparaginianowa, występuje w roślinach
w postaci kilku (od 2 do 6) izoenzymów zlokalizowanych w ró\
nych przedziałach
komórkowych: cytosolu, mitochondriach i peroksysomach. Jest to związane z faktem, \
e
bierze on udział w wielu procesach metabolicznych : poza uczestniczeniem w ogólnych
przemianach alaniny, niektóre jego izoenzymy odpowiadają za wzmo\
onÄ… produkcjÄ™ alaniny
w korzeniach roślin w warunkach niedoboru tlenu. Mogą te\
brać udział w odpowiedzi
rośliny na niedobór azotu, czy infekcję wirusową albo katalizować reakcje transaminacji
przebiegajÄ…ce podczas fotooddychania.
Analizy poziomu aktywności aminotransferazy alaninowej i asparaginianowej we krwi
są wykorzystywane w diagnostyce medycznej. Aktywność obu enzymów znacząco wzrasta
w przebiegu wirusowego zapalenia wątroby, w czasie ró\
nego typu uszkodzeń hepatocytów,
a tak\
e w przypadku zawału serca, z tym \
e w schorzeniach wÄ…troby obserwuje siÄ™ du\
o
większy wzrost aktywności aminotransferazy alaninowej, ni\
asparaginianowej, a przy
zawale mięśnia sercowego  odwrotnie.
Do oznaczania aktywności tych aminotransferaz najczęściej wykorzystuje się metody:
a. spektrofotometryczne oznaczanie szybkości powstawania produktu 2-oksokwasowego
w czasie transaminacji z zastosowaniem NADH + H+ i odpowiedniej dehydrogenazy
(jabłczanowej lub L-mleczanowej);
b. spektrofotometryczne oznaczenie ilości produktu 2-oksokwasowego po zatrzymaniu
reakcji transaminacji z zastosowaniem NADH + H+ i odpowiedniej dehydrogenazy;
c. pomiar absorbancji światła przez barwne produkty reakcji 2-oksokwasowych
produktów transaminacji: szczawiooctanu i pirogronianu
z 2,4-dinitrofenylohydrazynÄ….
Na ćwiczeniu stosowana będzie druga z wymienionych metod.
Spektrofotometryczna metoda oznaczania aktywności aminotransferaz
asparaginianowej i alaninowej
Zasada metody. Transaminację prowadzi się przy nadmiarze substratów
w temperaturze 30oC w pH 7,4 przez 30 minut.
Miarą aktywności aminotransferazy alaninowej jest utworzony pirogronian,
a w przypadku aminotransferazy asparaginianowej szczawiooctan i powstały na skutek
samorzutnej dekarboksylacji części szczawiooctanu pirogronian. Związki te oznacza się po
zatrzymaniu reakcji transaminacji, na podstawie reakcji z udziałem dehydrogenaz:
jabłczanowej i L-mleczanowej oraz NADH + H+:
 W warunkach ćwiczenia równowaga obu tych reakcji jest przesunięta w prawo i przy
nadmiarze NADH + H+ przebiegajÄ… one a\
do momentu zu\
ycia substratów
2-oksokwasowych. NADH + H+ wykazuje silną absorbancję przy 340 nm wskutek obecności
układu dihydropirydyny. Gdy układ ten ulegnie utlenieniu, absorbancja zanika. Wartość
ró\
nicy między średnią z absorbancji przy 340 nm prób pełnych, a średnią z absorbancji prób
materiałowych świadczy o ilości zu\
ytego NADH + H+ i jest proporcjonalna do stÄ™\
enia
oznaczanych 2-oksokwasów.
Odczynniki
1. Zbuforowany roztwór asparaginianu i 2-oksoglutaranu: 6,4 g kwasu L-asparaginowego
i 0,351 g kwasu 2-oksoglutarowego rozpuścić w około 30 ml wody, dodać 3,75 ml 5-
molowego wodorotlenku potasowego i doprowadzić do pH 7,4 1-molowym
wodorotlenkiem potasowym, dopełnić wodą do 50 ml i dodać 50 ml 0,2 molowego
buforu fosforanowego (K) pH 7,4.
2. Zbuforowany roztwór alaniny i 2-oksoglutaranu: 0,438 g kwasu 2-oksoglutarowego
rozpuścić w około 30 ml wody, doprowadzić 1-molowym wodorotlenkiem
potasowym do pH 7,4, dodać 4,46 g L-alaniny, po rozpuszczeniu dopełnić wodą do
50 ml i dodać 50 ml 0,2 molowego buforu fosforanowego (K) pH 7,4.
3. 4% Kwas trójchlorooctowy
4. 0,1 milimolowy Roztwór NADH + H+ (95 mg w 100ml) w 0,4- molowym buforze
Tris-HCl, pH 8,0 (48,6 g Trisu rozpuścić w około 500 ml wody, dodać 234 ml
1-molowego kwasu solnego i dopełnić wodą do objętości 1000ml).
5. Mieszanina dehydrogenaz w 2-molowym siarczanie amonowym, pH 7,0:
dehydrogenaza jabÅ‚czanowa 2 U/10 µl, dehydrogenaza L-mleczanowa 3 U/10 µl.
6. Dehydrogenaza L-mleczanowa w 2-molowym siarczanie amonowym, pH 7,0,
3 U/10 µl.
7. 0,2-molowy Bufor fosforanowy (K) pH 7,4 (do 1000ml 0,2-molowego fosforanu
dwupotasowego dodać 166 ml 0,2 molowego fosforanu jednopotasowego).
Wykonanie
Ćwiczenie wykonywane jest indywidualnie.
1. Sporządzanie wyciągu enzymu (wykonuje osoba przygotowująca ćwiczenie). Do1,5 g
drobno pokrojonych siewek pszenicy dodać 100ml 0,1 molowego buforu fosforanowego
(K) pH 7,4 (dwukrotnie rozcieńczony bufor 7). Całość homogenizować (około 3 min)
i przesączyć przez podwójną warstwę gazy. Stę\
enie enzymu w mieszaninie inkubacyjnej
powinno być tak dobrane, aby wartość "A340 zawierała się w przedziale od 0,05 do 0,250.
2. Oznaczanie aktywności aminotransferazy asparaginianowej. Wyciąg enzymu
otrzymany w kolbce na 10 ml uzupełnić wodą do kreski i dokładnie wymieszać. Do
czterech 1,5 ml probówek Eppendorfa (2 próby pełne i 2 materiałowe) dodać 0,5 ml
zbuforowanego roztworu L-asparaginianu i 2-oksoglutaranu (1), probówki wstawić do
Å‚az
ni wodnej o temp. 30oC i po 5 min. do prób pełnych odmierzyć 0,5 ml wyciągu
enzymu z kolbki miarowej. Zawartość szybko wymieszać i wstawić do łaz
ni wodnej na 30
min. Po tym czasie do wszystkich probówek dodać po 0,5 ml 4% kwasu
trójchlorooctowego (3), a następnie do prób materiałowych po 0,5 ml wyciągu
enzymowego. Zawartość ka\
dej probówki dokładnie wymieszać i odwirować w wirówce
przez 5 minut. Następnie z ka\
dej probówki przenieść po 0,5 ml klarownego płynu z nad
osadu do kolejnych czterech. 1,5 ml próbówek Eppendorfa i dodać do ka\
dej 1 ml
roztworu NADH + H+ (4) oraz 10 µl mieszaniny dehydrogenaz: jabÅ‚czanowej
i L-mleczanowej (5). Po upływie 10 minut od momentu dodania enzymu odczytać
absorbancję dla prób (2 pełnych i 2 materiałowych) przy długości fali 340nm
w fotometrze ustawionym na zero wobec wody.
3. Oznaczanie aktywności aminotransferazy alaninowej. Do czterech 1,5 ml probówek
Eppendorfa (2 próby pełne i 2 materiałowe) dodać 0,5 ml zbuforowanego roztworu
L-alaniny i 2-oksoglutaranu (2), probówki wstawić do łaz
ni wodnej o temp. 30oC i po
5 min do prób pełnych odmierzyć 0,5 ml wyciągu enzymu z kolbki miarowej (jak wy\
ej).
Zawartość szybko wymieszać i wstawić do łaz
ni wodnej na 30 min. Po tym czasie do
wszystkich probówek dodać po 0,5 ml 4% kwasu trójchlorooctowego (3), a następnie do
prób materiałowych po 0,5 ml wyciągu enzymowego. Zawartość ka\
dej probówki
dokładnie wymieszać i odwirować w wirówce przez 5 minut. Następnie z ka\
dej
probówki przenieść po 0,5 ml klarownego płynu znad osadu do kolejnych czterech 1,5 ml
próbówek Eppendorfa i dodać do ka\
dej 1 ml roztworu NADH + H+ (4) oraz 10 µl
dehydrogenazy L-mleczanowej (5). Po upływie 10 minut od momentu dodania enzymu
odczytać absorbancję dla prób (2 pełnych i 2 materiałowych) przy długości fali 340nm
w fotometrze ustawionym na zero wobec wody.
Obliczenie aktywności
1. Obliczyć średnią wartość absorbancji dla prób materiałowych i pełnych
2. Od średniej wartości absorbancji prób materiałowych odjąć średnią wartość
absorbancji prób pełnych
3. Obliczyć caÅ‚kowitÄ… ilość µmoli produktów 2-oksokwasowych w mieszaninie
inkubacyjnej dzieląc uzyskane ró\
nice średnich absorbancji przez molowy
współczynnik absorpcji światła dla NADH + H+ przy długości fali 340 nm,
wynoszÄ…cy 6,22 × 103
4. Aktywność obu aminotransferaz wyrazić w µmolach produktu na 1 min 1 g siewek
pszenicy [µmole 2-oksokwasu× min.-1 × g siewek-1] uwzglÄ™dniajÄ…c:
a. schemat rozcieńczeń podany przez prowadzącego
b. czas trwania reakcji enzymatycznej
5. Obliczyć stosunek aktywności aminotransferazy asparaginianowej do alaninowej
dzielÄ…c przez siebie uzyskane wyniki.
Przykładowe obliczenia:
Aminotransferaza Aminotransferaza
alaninowa asparaginianowa
Próba 1 Próba 2 Średnia Próba 1 Próba 2 Średnia
Absorbancja prób
0,437 0,442 0,439 0,383 0,389 0,386
materiałowych
Próba pełna
0,292 0,288 0,290 0,210 0,202 0,206
Ró\
nica średnich
0,149 0,180
absorbancji
Ilość produktów
2-oksokwasowych 0,024 0,030
(µmole)
Poniewa\
do oznaczenia spektrofotometrycznego pobrano 0,5 ml z 1,5 ml mieszaniny
inkubacyjnej, więc aktywność aminotransferazy asparaginianowej zawartej w 0,5 ml wyciągu
jest równa 0,090 µmola szczawiooctanu, a aminotransferazy alaninowej 0,072 µmola
pirogronianu.
Zatem aktywność aminotransferazy asparaginianowej w 10 ml wyciÄ…gu wynosi 1,80 µmola
szczawiooctanu, a aminotransferazy alaninowej 1,44 µmola pirogronianu. WiedzÄ…c, \
e przed
uzupełnieniem do objętości 10 ml kolbka zawierała 1 ml wyciągu przygotowanego przez
homogenizacjÄ™ 1,5 g siewek pszenicy w 100 ml buforu mo\
emy obliczyć aktywność
aminotransferaz w następujący sposób:
" aktywność aminotransferazy asparaginianowej w 1 ml wyciÄ…gu wynosi 1,80 µmola
szczawiooctanu, a aminotransferazy alaninowej 1,44 µmola pirogronianu
" aktywność aminotransferazy asparaginianowej dla 1,5 g siewek jest równa 180 µmola
szczawiooctanu, a aminotransferazy alaninowej 144 µmola pirogronianu
" aktywność aminotransferazy asparaginianowej dla 1 g siewek wynosi 120 µmola
szczawiooctanu, a aminotransferazy alaninowej 96 µmola pirogronianu. Po
uwzględnieniu czasu reakcji enzymatycznej wynoszącej 30 minut, aktywności te będą
równe odpowiednio 4,0 µmola szczawiooctanu × min.-1 × g siewek-1 i 3,2 µmola
pirogronianu × min.-1 × g siewek-1
Dzieląc te wartości przez siebie stwierdzimy, \
e stosunek aktywności aminotransferazy
asparaginianowej do alaninowej wynosi 1,25
Pytania
1. Jaką rolę w metabolizmie komórki pełni aminotransferaza alaninowa?
2. Jaka jest przyczyna występowania roślinnej aminotransferazy asparaginianowej
w postaci kilku izoenzymów?
3. Podać wzór i pełną nazwę koenzymu współdziałającego z aminotransferazami. Której
witaminy jest on pochodnÄ…?
4. Który z 2-oksokwasów jest najczęściej akceptorem grup aminowych w reakcjach
transaminacji? Napisać wzór tego 2-oksokwasu i jego pochodnej L-aminokwasowej.
5. W jakich jednostkach wyra\
a się aktywność aminotransferaz w metodzie stosowanej
na ćwiczeniu?
6. Podczas oznaczania aktywności aminotransferazy asparaginianowej metodą
spektrofotometryczną otrzymana ró\
nica absorbancji wynosiÅ‚a 0,3. Obliczyć ile µmoli
szczawiooctanu powstalo podczas 30-minutowej reakcji transamiacji.
Literatura
Bergmayer HU, Bernt E (1974). Glutamate-oxaloacetate transaminase. Bergmayer HU.
Methods of enzymatic analysis. Verlag Chemie Weinheim Academic Press: 727-732.
Horder M. Rej R. (1983). Alanine aminotransferase. w: Methods of enzymatic analysis, red.
Bergmeyer HU., Verlag Chemie: 444-456.
Orzechowski S. Socha-Hanc J. Paszkowski A. (1999). Alanine aminotransferase and glycine
aminotransferase from maize (Zea mays L.) leaves. Acta Biochim Polon 46: 447-457.
Orzechowski S. Socha-Hanc J. Paszkowski A. (1999). Purification and properties of alanine
aminotransferase from maize (Zea mays L.) leaves. Acta Physiol Plant 21: 323-330.