Techniki biologii molekularnej
Marcin Kurowski
P C R
Celem reakcji Å‚aocuchowej polimerazy jest
wykonanie jak największej liczby kopii
fragmentu DNA.
 molekularna kserokopiarka
Zastosowanie PCR
" Diagnostyka bakteriologiczna i wirusologiczna
" Medycyna sÄ…dowa
" Kryminalistyka
" Ustalanie ojcostwa/pokrewieostwa
" Typowanie HLA
SEKWENCJONOWANIE
CEL: określenie porządku
(sekwencji) nukleotydów
w danym genie
(= fragmencie DNA)
SEKWENCJONOWANIE
" Kopiowanie określonej sekwencji (polimeraza
DNA I)
" Mieszanina inkubacyjna zawiera 4 trifosforany
deoksyrybonukleozydów oraz 2 ,3 -
dideoksyanalogi
" Wbudowanie analogu uniemożliwia dalsze
wydłużanie łaocucha DNA
" Powstają fragmenty o różnej długości
kooczące się różnymi dideoksyanalogami
SEKWENCJONOWANIE
" Fragmenty DNA wykrywa siÄ™ na podstawie ich
fluorescencji - znacznik fluorescencyjny emituje
światło o odmiennej barwie dla każdej reakcji
termiancji
" Elektroforeza żelowa w automatycznym
sekwencjonerze
" Laser wzbudza świecenie znaczników
" Detekcja świecenia
" Konwersja do chromatogramu
Metoda Sangera
QIAGEN Sequencing Guide
Chromatogram
ENDONUKLEAZY RESTRYKCYJNE
" RozpoznajÄ… specyficzne sekwencje zasad w
dwuniciowej helisie i zrywajÄ… obie nici w
dokładnie zdefiniowanych miejscach
"  precyzyjne skalpele
" Syntetyzowane przez wiele różnych
organizmów Procaryota
C) RFLP
PRZYKA
ADOWE ENZYMY RESTRYKCYJNE:
Eco47I (AvaII) NcoI
5'...G“!G T C C...3' 5'...C“!C A T G G...3'
3'...C C A GÄ™!G...5' 3'...G G T A CÄ™!C...5'
RFLP  wizualizacja produktów
trawienia
500 pz
497 pz
400 pz
353 pz
300 pz
200 pz
144 pz
100 pz
Wzorzec masy
W 1 2 4 5
3 6
Badane DNA
Wykorzystanie
" Badanie struktury chromosomów
" Analiza (sekwencjonowanie) krótkich
fragmentów DNA
" Izolowanie genów
" Tworzenie nowych czÄ…steczek DNA