Ćwiczenie 4
Materiały do ćwiczeń dla
Wydziału Medycyny
Weterynaryjnej
Mechanizmy odporności nieswoistej
Izolacja granulocytów
Funkcje granulocytów
Opracowanie:
lek. wet. Jan P. Madej
prof. dr hab. Wojciech Nowacki
Odporność wrodzona (nieswoista)
Składowe odporności wrodzonej:
" bariery anatomiczne
" bariery fizjologiczne
" składniki komórkowe
komórki dendrytyczne - należą do komórek odporności wrodzonej i są
najważniejszym ogniwem pomiędzy odporością
wrodzoną i nabytą
" składniki humoralne
Cechy odporności wrodzonej:
" niezmienność w rozpoznawaniu Ag
" brak pamięci o Ag
" szybkość odpowiedzi
" spontaniczna fagocytoza (np. węgiel, karbonylek)
" immunofagocytoza (z udziałem opsonin)
" wybiórcza aktywacja poprzez interakcję PRR - PAMP
1
Odporność nieswoista komórkowa
Komórki fagocytujące: neutrofile (w mniejszym stopniu eozynofile),
monocyty i makrofagi
Cechy granulocytów:
" zdolność ruchu
" zdolność adherencji:
a) in vivo  do powierzchni śródbłonka naczyń włosowatych i do
migracji przez ścianę naczyń do tkanek
(czynniki chemotaktyczne)
b) in vitro  do powierzchni szkła i plastiku
" zdolność rozpoznawania (PRR  PAMP) i fagocytowania
" zdolność zabijania (destrukcji) na drodze mechanizmów zależnych
i niezależnych od tlenu:
a) wewnątrzkomórkowo
b) zewnątrzkomórkowo (ADCC)
I. Badania zdolności ruchu granulocytów
" test migracji spontanicznej i chemotakcji leukocytów
pod agarem
" test kapilarowy migracji spontanicznej i chemotaksji
leukocytów
" test chemotaksji leukocytów w komorze Boydena
Liczba leukocytów u niektórych gatunków zwierząt
Gatunek Liczba leukocytów
(109/L lub tys/mm3)
pies 12,0
kot 15,0
konie 10,0
bydło 8,0
świnie 15,0
owce 8,0
Krzymowski T.:  Fizjologia zwierząt , Warszawa 1998
2
Pobranie krwi
krew pełna (antykoagulant) surowica (skrzep)
(morfologia) (biochemia)
Test spontanicznej migracji granulocytów
Izolacja granulocytów:
" pobrać krew na heparynę (20 j.m./ml)
" odwirować 600 x g, 20 min
" usunąć osocze z  kożuszkiem  na dnie pozostają granulocyty (PMN 
polymorphonuclear cells) i erytrocyty
" zlizowć erytrocyty przy użyciu 0,84% NH4Cl lub H2O
" odwirować (200 x g, 10 min) i 3x odpłukać PBS z dodatkiem
antybiotyków
" określić żywotność komórek 1% roztworem błękitu trypanu
" doprowadzić do koncentracji 2x108/ml
Izolacja granulocytów
45 sek
1500 obr/min 10min
2000 obr/min 7min
PBS
10 x stęż.
płyn
woda
erytrocyty i leukocyty komórki
3
Przygotowanie podłoża do migracji:
" dwukrotnie stęż. r-r płynu Hanksa uzupełnić antybiotykami i surowicą o
końcowej koncentracji 10%. (pH 7,2 - 7,4 )
" zmieszać w łaz
ni wodnej o temp 48�C, z równą objętością 1,5% r-ru
wodnego agarozy (lub agaru); stężenie końcowe 0,75%.
" rozlać do szklanych płytek Petriego
" po zestaleniu agaru, wyciąć zbiorniki o średnicy 2 mm.
Wykonanie testu i odczyt:
" nanieść komórki w objętości 5 �l (każda próba w 3 powtórzeniach)
" inkubować płytki w cieplarce, w komorze wilgotnej, przez 18 h.
" płytki utrwalić 40% roztworem buforowanej formaliny, przez 30 min,
a następnie alkoholem metylowym przez 20 min.
" zdjąć agar, komórki zabarwić metodą May - Gr�nwalda - Giemsy.
" określić wielkość strefy migracji (średnia 3 pól migracji r2)
Test migracji leukocytów pod agarem
4
Test chemotaksji leukocytów pod agarem
Kowalski M.2000
Indeks chemotaksji:
jest to stosunek odcinka  A do  B
indeks > 1 działanie chemotaktyczne
indeks = 1 brak chemotaksji
indeks < 1 działanie hamujące
Test kapilarowy migracji leukocytów
Kowalski M.2000
5
Test chemotaksji leukocytów w komorze Boydena
Kowalski M.2000
6
II. Test na zdolność granulocytów do adherencji
7
Kuby Immunology ed.Goldsby et al.
III. Fagocytoza
WH.Freeman and Co.2000
Etapy fagocytozy
skupiska bakterii
8
IV. Mechanizmy zabijania
wykorzystywane przez neutrofile
Mechanizmy zależne od tlenu:
OKSYDAZA NADPH
NADPH + 2 O2 2 O 2
+ NADP+ + H+
DYSMUTAZA PONADTLENKOWA
2 O 2
+ 2 H+ H2O2 + O2
KATALAZA
H2O2 H2O + 02
H2O2 + Fe2+ Fe3+ + OH + OH
HOCl + H2O2 1O2 + H2O + Cl + H+
HOCl + aminy chloraminy
MIELOPEROKSYDAZA
H2O2 + Cl- HOCl + OH-
Mechanizmy niezależne od tlenu:
" BPI  czynnik bakteriobójczy zwiększający przepuszczalność
" katepsyna G
" defensyny
" kateliny
" lizozym
" laktoferyna
" MBP  główne białko zasadowe (major basic protein)
" białko kationowe eozynofilów (ECP), neurotoksyna eozynofilów (EDN)
" elsataza, azurocydyna, kalprotektyna, ubikwicydyna
9
Mechanizm działania defensyn
Gołąb, Jakóbisiak, Lasek, 2005
Gołąb, Jakóbisiak, Lasek, 2005
Test NBT
Komórki posiadające zdolność wewnątrzkomórkowego zabijania
drobnoustrojów wykazują wysoki potencjał oksydo-redukcyjny i mogą
zredukować błękit nitrotetrazolowy (NBT) (żółty) do nierozpuszczalnego
formazanu (ciemnogranatowy).
Test spontaniczny:
komórki + barwnik ocena liczby komórek redukujących i
nieredukujących (rozmaz)
Test pobudzony:
komórki + endotoksyny bakteryjne lub inne czynniki pobudzające
(np. zymozan). Jeżeli w teście pobudzonym ilość komórek redukujących
wynosi mniej niż 80% świadczy to o defektach leukocytów.
U zdrowego bydła: 21% neutrofilów w teście spontanicznym i 40% w pobudzonym.
U psów w teście spontanicznym: 8% redukuje prawidłowo; podczas infekcji
powyżej 14%
10
Wykonanie testu:
" szkiełka podstawowe powlec 0,1% alkoholowym r-rem NBT i wysuszyć
" pobrać krew z dodatkiem heparyny (do 10 j.m./ml)
" wykonać cienki rozmaz z krwi pełnej na szkiełku podstawowym z filmem
NBT
" inkubacja w łaz
ni wilgotnej 20 min 37�C, a następnie 20 min w temp.
pokojowej
" po wyschnięciu barwić metodą May-Gr�nwalda-Giemsy
prawidłowy eozynofil, neutrofil i limfocyt
11
reakcja +/
reakcja ujemna
Badania funkcji granulocytów:
1) in vivo:
" badanie zdolności ruchu i migracji z krwi do miejsc działania czynnika
zapaleniotwórczego
2) in vitro:
" liczba leukocytów we krwi lub innych płynach ustrojowych
" obecność receptorów umożliwiających adherencję i migrację z naczyń
" zdolność ruchu pod warstwą żelu agarozowego
" zdolności fagocytujące (bakterie, ziarna zymozanu)
" właściwości oksydacyjno-redukcyjne oraz aktywność mieloperoksydazy
i produkcji nadtlenków (w tym H2O2)
" właściwości bakteriobójcze
" produkcja cytokin
12
Diagnostyka zaburzeń fagocytarnych
I. Testy przesiewowe (skriningowe):
" leukocyty: liczba, wzór, morfologia
" test NBT
II. Testy zaawansowane:
" specjalna morfologia
" okienko skórne Rebuck a
" ruchliwość spontaniczna (przypadkowa) i chemotaksja
" fagocytoza
" czynność bakteriobójcza
III. Testy specjalne:
" chemiluminescencja
" metabolizm tlenowy fagocytów
" analiza molekuł adhezyjnych
" badania enzymatyczne
" ocena zdolności odkształcenia, adherencji, agregacji
TEST FAGOCYTOZY IN VITRO
Do testu używa się najczęściej komórek fagocytujących, wyizolowanych z krwi,
płuc,
wysięku otrzewnowego.
A. Przygotowanie zawiesiny bakterii
Skosy agarowe z wyhodowanymi bakteriami Staphylococcus aureus zmywa się
PBS-
em. Zawiesinę bakterii odwirowujemy przy 3000 obr/min przez 20 minut, płuczemy
3 x w
PBS, każdorazowo wirując w tych samych warunkach. Z uzyskanego osadu
przygotowujemy
zawiesinę komórek o gęstości 0,5 - 7,0 x l O9 komórek ml"1 ( ilość bakterii
sprawdzona
spektrofotometrycznie przy długości fali 600 nm porównując zmętnienie zawiesiny
badanej ze
zmętnieniem zawiesiny standardowej przygotowanej według skali McFarlanda ).
B. Izolujemy badane komórki fagocytujące z krwi, płuc lub otrzewnej.
C. Wykonanie testu i odczyt
'7
B
A
ączymy badane komórki 0,lml(5xl0 komórek/ml) z O, l ml zawiesiny gronkowca (
3x10
komórek/ml ) i 0,1 ml surowcy ( aktywnej lub dekomplementowanej - inaktywacja
dopełniacza 56 C, 30 min ). Inkubujemy 45 minut w łaz
ni wodnej o temp. 37� C.
13