Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 951
r ryg n n r g n r
Wpływ monenzyny na aktywnoS
ć i żywotnoS
ć
neutrofili izolowanych od jałówek
w przebiegu zespołu oddechowego
WOJCiECH CYBULSKi, JOANNA WESSELY-SZPONDER*, LiDiA RADKO,
RYSZARD BOBOWiEC*, ANDRZEJ WERNiCKi**
Zakład ToksykoIogii i Ochrony \
rodowiska, *Zakład PatofizjoIogii Katedry PrzedkIinicznych Nauk Weterynaryjnych,
**Zakład Prewencji Weterynaryjnej instytutu Chorób Zakaz
nych i inwazyjnych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej AR,
uI. Akademicka 12, 20-033 LubIin
CybuIski W., WesseIy-Szponder J., Radko L., Bobowiec R., Wernicki A.
Influence of monenzin on secretion and viability of neutrophils isolated from BRD infected heifers
Summary
Bovine respiratory disease (BRD) outbreaks are common in heifer herds. Monenzin, a feed additive, is often
used in order to improve rumen digestion. The impact of this antibiotic on neutrophil phagocytes and the
secretion of its granule s contents have been reported in several species, although not in cattle. The presented
study focused on the secretor and viability traits of neutrophils from healthy heifer blood (n=4) and BRD
heifers (n=6). Isolated cells were subjected to monenzin (1 50 mM) within a 24 hr incubation period. Elastase,
myeloperoxidase and alkaline phosphates activities as well as ROS, NO and cell viability assessment were
carried out using MTT tests in incubation media. Neutrophils of BRD heifers displayed a significantly higher
granular enzyme release and lowered vitality than in the healthy animals. Increased concentrations of monenzin
inhibited secretions of NO both in healthy and BRD heifers, yet did not influence O-. levels. Monenzin at
2
1 mM stimulated ALP activity, but higher concentrations of the substance suppressed their release. Elastase
output grew in relation to increasing amounts of the antibiotic. Cell viability was significantly affected by
higher concentrations of monenzin. The obtained in-vivo results suggest that heifers fed with monenzin-
-containing diets may have neutrophil-augmented reactions, and, as a result, the course of BRD may become
more severe.
Keywords: neutrophils, monenzin, BRD
Rozwój zespołu oddechowego (BRD), zwłaszcza ona nie tylko skład komensalicznej flory bakteryjnej,
w okresie organizowania stada, wynika, między inny- ale przypuszczalnie, przynajmniej u innych gatunków
mi, z aktywności chemotaktycznej neutrofili. W wy- zwierząt, działa też bezpośrednio na neutrofile (14).
niku nasilonej infekcyjnej odpowiedzi zapalnej oraz Z uwagi na stosowanie dodatków paszowych zawie-
zubożenia pokarmu w mikroelementy (Zn, Mn, Se) rających monezynę podjęto badania mające na celu
i witaminy, w tym zwłaszcza w wit. E, dochodzi do określenie wpływu in vitro tego antybiotyku na żywot-
przestawienia funkcji fagocytarnej makrofagów (Mf) ność i aktywność enzymatyczną neutrofili pochodzą-
w kierunku syntezy groz
nych chemokin (IL-8 i MIP-2 cych od jałówek zdrowych i z objawami BRD.
 macrofage inflamatory proteins). Cytokiny te są silny-
mi chemoatraktantami dla neutrofili. W takich warun- Materiał i metody
kach neutrofile nie tylko masowo migrują do tkanki
Doświadczenie przeprowadzono na 10 jałówkach rasy
okołooskrzelowej i śródmiąższowej płuc, ale również,
nizinnej czarno-białej w wieku od 10 do 11 miesięcy. Na
podobnie do Mf, zmieniają swoją funkcję fagocytarną
podstawie badania klinicznego i bakteriologicznego zwie-
na sekrecyjną. Uwalniają wówczas zawartość ziar-
rzęta podzielono na dwie grupy. Kontrolę (n = 4) stanowiły
nistości pierwotnych (mieloperoksydazę) i wtórnych
zwierzęta zdrowe, u których badaniem klinicznym ani ba-
(proteazy  kolagenazę, elastazę, żelatynazę) oraz re-
daniem bakteriologicznym wymazu z nozdrzy nie stwier-
aktywne formy tlenu (ROS) o silnym działaniu destruk-
dzono występowania zespołu oddechowego. Drugą grupą
cyjnym dla otaczających elementów podścieliska (3,
(n = 6) były jałówki z objawami ostrej postaci zespołu od-
15). Aktywność neutrofili może być ponadto zmienia- dechowego. Od każdej jałówki pobrano krew, z której wy-
na przez stosowane w dodatkach paszowych antybio- izolowano neutrofile według metody Mottola (15). Otrzy-
tyki jonoforowe, w tym monenzynę (13). Modyfikuje many osad został zawieszony w płynie hodowlanym
952 Medycyna Wet. 2006, 62 (8)
Tab. 1. Wpływ różnych ilości monenzyny na uwalnianie enzymów (w % maksymalnego uwalniania) i tlenku azotu (w �M/106
neutrofili) z neutrofili izolowanych od jałówek zdrowych i z BRD po 24 godzinach hodowli (
x ą s)

Objaśnienia: jałówki zdrowe; jałówki z BRD; * p < 0,05; ** p < 0,01; PMA  neutrofile stymulowane octanem forbolu
DMEM (Sigma) z 10% dodatkiem surowicy cielęcej (Bio- fosfatazy (ALP) oraz wytwarzania tlenku azotu (NO) wy-
med-Lublin). Od każdego zwierzęcia uzyskano zawiesinę konano według metodyki opisanej we wcześniejszej publi-
neutrofili o gęstości 2 � 106 komórek/ml. Otrzymane w ten kacji autorów (15). Wytwarzanie anionu ponadtlenkowe-
sposób hodowle podzielono na dwie części: do jednej go (O2 ) przez neutrofile określono za pomocą reakcji Con-
dodano 5 �l PBS (Biomed-Lublin), a do drugiej 5 �l PBS fera (3). Do oznaczania żywotności neutrofili zastosowano
z 1 �M octanu forbolu (PMA-Sigma). Do obu części ho- test MTT zaadaptowany wg metodyki INVITTOX (8, 9).
dowli neutrofili dodano roztwór roboczy soli sodowej mo- Analizę statystyczną otrzymanych wyników przeprowa-
dzono przy pomocy programu Statistica PL. Istotność róż-
nenzyny (Sigma), uzyskując roztwory o zawartości: 0, 1,
5, 10, 50 �M antybiotyku. Grupę kontrolną stanowiła za- nic (p < 0,05 i p < 0,01) pomiędzy uzyskanymi wartościa-
wiesina komórek w PBS. Tak przygotowane hodowle in- mi poszczególnych parametrów określono stosując test
t-Studenta. Wyniki przedstawiono jako średnie (
x ą s).
kubowano w cieplarce w temperaturze 37�C, w atmosferze
5% CO2. Po 0,5, 5 i 24 godzinach inkubacji dokonywano
Wyniki i omówienie
odczytu absorbancji w automatycznym czytniku Elisa
(Alab-Plate Reader ELISA). Po zastosowaniu różnych ilości monenzyny w za-
Oznaczanie aktywności wydzielniczej na podstawie kresie od 0 do 50 �M zarówno przy, jak i bez stymula-
uwalniania elastazy, mieloperoksydazy (MPO) i zasadowej
cji PMA, uwalnianie elastazy, MPO, ALP i NO w ho-
dowlach neutrofili pochodzących od ja-
łówek dotkniętych BRD było wyższe
80
niż od jałówek zdrowych (ryc. 1, tab. 1).
**
70
Jałówki zdrowe
**
Wcześniejsze badania wykazały wzmo-
Jałówki z BRD
60
** żoną aktywność sekrecyjną neutrofili od
50
jałówek w przebiegu infekcji układu
40
oddechowego w porównaniu do zwie-
30
** rząt zdrowych. Obejmowała ona zarów-
**
**
**
**
20
no uwalnianie enzymów (elastazy,
10 MPO i ALP) uznanych za markery
uszkodzeń płuc, jak i wytwarzanie tlen-
0
0,5 5 24 0,5 5 24 0,5 5 24
ku azotu (15).
Elastaza Mieloperoksydaza Zasadowa fosfataza
W grupie jałówek zdrowych żywot-
Czas inkubacji (h)
ność neutrofili pod wpływem monen-
zyny była istotnie wyższa niż w grupie
Ryc. 1. Uwalnianie enzymów z neutrofili pod wpływem monenzyny (50 �M)
jałówek z BRD. Stymulacja PMA neu-
w toku 24-godzinnej hodowli (
x ą s)
Objaśnienia: * różnice statystycznie istotne (p < 0,05), ** różnice statystycznie istot- trofili jałówek dotkniętych BRD obni-
ne (p < 0,01)
żała ich żywotność, co istotnie zazna-
% maksymalnego uwalniania enzymów
Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 953
tywności MPO w miarę wzrastających
110
dawek monenzyny (tab. 1). W doświad-
100
czeniu przeprowadzonym przez Fitt-
90
schena i Hensona (6), ludzkie neutrofi-
**
**
le poddane działaniu monenzyny od-
80
**
znaczały się wzmożonym uwalnianiem
70 *
Jałówki zdrowe *
enzymów z ziarnistości azurofilnych
60
Jałówki zdrowe/PMA
(10). Bodz
cem krytycznym wydaje się
**
Jałówki z BRD
50
** tu nagromadzenie jonów Na+, które
Jałówki z BRD/PMA
40
wymieniane są za H+ (proton) przez bło-
0 1 5 10 50
ny ziarnistości, powodując alkalizację
�M monenzyny
organelli, co prowadzi do sekrecji bez
Ryc. 2. Zmiany żywotności neutrofili pod wpływem monenzyny po 24 godzi- lizy komórek i zużycia energii (1, 6).
nach inkubacji (
x ą s)
Uwalnianie ALP w grupie jałówek
Objaśnienia: * różnice statystycznie istotne (p < 0,05), ** różnice statystycznie istot-
zdrowych było podwyższone już po 0,5
ne (p < 0,01)
godzinie inkubacji i rosło istotnie (p <
0,01) przy większych dawkach, osiąga-
czało się po 24 godzinach inkubacji w hodowlach z naj- jąc wartość 14,27% ą 0,38 przy 50 �M. Po 5 godzi-
wyższą ilością monenzyny, 50 �M (ryc. 2). W dostęp- nach nie wykazano istotnych zmian, chociaż w ostat-
nym piśmiennictwie opisano podobne badania neutro- nim pomiarze (po 24 godzinach) ALP wzrosła przy
fili królików i ludzi, które zmniejszały żywotność 1 �M monenzyny, a następnie malała wraz ze wzros-
w hodowlach w wyniku ich lizy pod wpływem mo- tem stężenia monenzyny (tab. 1). W grupie jałówek
nenzyny w dawkach powyżej 100 �M (5). Jednakże z BRD obserwowano podobną odpowiedz
, jak u jałó-
wymienieni autorzy stosowali krótsze czasy inkuba- wek zdrowych (ryc. 1). W przypadku stymulacji PMA
cji, do 60 min., a lizę określano na podstawie aktyw- wartości otrzymane we wszystkich badanych grupach
ności dehydrogenazy mleczanowej. Nie pozwala to na były nieznacznie wyższe (tab. 1). Ponieważ dane lite-
miarodajne porównanie wyników obu badań. raturowe podkreślają, że monenzyna nie wywiera
Nasilone uwalnianie elastazy przez neutrofile sty- wpływu na ziarnistości wtórne (6, 7), należy przyjąć,
mulowane i nie stymulowane PMA pochodzące za- że uwalniana z nich zasadowa fosfataza była wyni-
równo od jałówek zdrowych, jak i z BRD następowa- kiem ich lizy. Z kolei końcowe obniżenie poziomu
ło sukcesywnie wraz ze wzrostem dawki monenzyny wszystkich badanych enzymów wiązało się z letalnym
po 0,5 i 5 godzinach inkubacji. Natomiast po 24 go- efektem monenzyny na neutrofile i ostatecznym spad-
dzinach odnotowano znaczny spadek uwalniania ela- kiem ich liczby w hodowli.
stazy z neutrofili stymulowanych, jak i nie stymulo- Zwiększone uwalnianie enzymów z neutrofili jałó-
wanych PMA (tab. 1). Zwiększone uwalnianie elasta- wek chorych na BRD wynika z podwyższonej reak-
zy, wobec podkreślanego w literaturze (5, 6) braku tywności (15), a także stwierdzonej w naszych bada-
bezpośredniej aktywacji ziarnistości wtórnych, wyni- niach obniżonej ich żywotności. Ulegające nekrozie
ka zasadniczo z nekrozy i lizy neutrofili pod wpływem i rozpadowi neutrofile są dodatkowym z
ródłem uwal-
wzrastających stężeń monenzyny. W efekcie końco- nianych enzymów, w tym tak groz
nych, jak elastaza,
wy spadek uwalniania tego enzymu przypuszczalnie MPO i ALP (3). Toksyczny wpływ monenzyny należy
spowodowany jest, z jednej strony, ograniczeniem po- uwzględnić zwłaszcza w przebiegu BRD. Nasilone jest
pulacji neutrofili, z drugiej, mechanizmem zahamo- wówczas uwalnianie enzymów z neutrofili, które przy-
wania degranulacji opisanym przez Pamleya i wsp. czyniają się do uszkodzenia płuc przy wczesnym na-
(13). Według tych autorów, monenzyna zmienia mor- pływie neutrofili do tego narządu w przebiegu infek-
fologię neutrofili, wpływając na proces tworzenia się cji układu oddechowego (2, 11, 12, 15).
ziarnistości, głównie w obrębie aparatu Golgiego. Po- Rosnące dawki monenzyny wywierały efekt hamu-
nadto przedstawione w tej pracy dane, a także cyto- jący na ilość wytworzonego NO, który nasilał się wraz
wane wcześniejsze prace wskazują na postępujący z czasem inkubacji i był najbardziej widoczny po 24
wraz z czasem inkubacji spadek degranulacji pod godzinach (tab. 1). Na podstawie wyznaczonej linii
wpływem monenzyny, dotyczący zarówno ziarnistoś- regresji stwierdzono, iż wytwarzanie NO pozostawa-
ci pierwotnych, jak i wtórnych (13). ło w zależności od żywotności neutrofili poddanych
Uwalnianie MPO z neutrofili w obu badanych gru- działaniu 50 �M monenzyny (ryc. 3). Zarówno u jałó-
pach w obecności monenzyny zmieniało się w czasie. wek zdrowych, jak i dotkniętych BRD nie zaobserwo-
O ile nie występowały różnice po 0,5 godzinie inku- wano istotnych zmian wytwarzania anionu ponadtlen-
bacji, to po 5 godzinach obserwowano wzrost aktyw- kowego pod wpływem wzrastających dawek monen-
ności, który wzmagał się w hodowlach z dodatkiem zyny. Dane literaturowe dotyczące uwalniania wolnych
PMA (ryc. 1). Po 24 godzinach inkubacji neutrofile rodników przez neutrofile pod wpływem monenzyny
(po i bez stymulacji PMA) reagowały spadkiem ak- są fragmentaryczne. Nie badano oddziaływania tego
ŻywotnoS
ć neutrofili (%)
954 Medycyna Wet. 2006, 62 (8)
robowe zwierząt. W efekcie skarmianie monenzyną
Wsp. korelacji = 0,50994
4,2
jednocześnie z wystąpieniem zespołu BRD wydaje się
4,0
pogłębiać proces chorobowy u bydła.
3,8
PiS
miennictwo
3,6
1.Araki A., Inoue T., Cragoe E. J., Sendo F.: Na+/H+ exchange modulates rat
neutrophil mediated tumor cytotoxicity. Cancer Res. 1991, 15, 3212-3216.
3,4
2.Bednarek D.: Aktualne poglądy na patofizjologię enzootycznej bronchopneu-
3,2 monii cieląt (EBC). Medycyna Wet. 1998, 54, 372-377.
3.Confer A. W., Simons K. R.: Effects of Pasteurella haemolytica lipopoly-
3,0
saccharide on selected functions of bovine leukocytes. Am. J. Vet. Res. 1986,
47, 154-157.
2,8
4.Coomber B. L., Galligan C. L., Gentry P. A.: Comparison of in vitro function
of neutrophils from cattle deficient in plasma factor XI activity and from
2,6
70 74 78 82 86 90
normal animals. Vet. Immunol. Immunolpathol. 1997, 58, 121-131.
ŻywotnoS
ć 5.Di Virgilio F., Gomperts B. D.: Ionophore monensin induces Na+-dependent
Regresja 95% p. ufnoS
ci
secretion from rabbit neutrophils. Biochim. Biophys. Acta 1983, 763, 292-
-298.
6.Fittschen C., Henson P. M.: Selective secretion of azurophil granule contents
Ryc. 3. Zależność wytwarzania NO od żywotności neutrofili
induced by monovalent cation ionophores in human neutrophils: evidence
jałówek z BRD poddanych działaniu monenzyny (50 �M)
for direct ionophore effects on the granule membrane. J. Leuk. Biol. 1991,
50, 517-528.
jonoforu na wytwarzanie NO. Także doświadczenia
7.Fittschen C., Henson P. M.: Linkage of azurophil granules secretion in neu-
nad działaniem monenzyny na produkcję O2 przez
trophils to chloride ion transport and endosomal transcytosis. J. Clin. Invest.
bydlęce neutrofile nie były dotychczas wykonywane. 1994, 93, 247-255.
8.INVITTOX-The ERGATT/FRAME Data Bank of In Vitro Techniques in To-
Wykazano jedynie, że monenzyna nie zmienia wytwa-
xicology  MTT assay 1990, Nr 17.
rzania O2 przez ludzkie neutrofile (6, 13).
9.Muzyczuk-Piekarska A., Kowalska-Pyłka H., Cybulski W., Rzeski W.: Ocena
U bydła żywionego paszą suplementowaną monen- cytotoksycznego działania fungicydów o budowie benztioanilidów. Medy-
cyna Wet. 2004, 60, 1124-1128.
zyną (np. preparaty Coban, Rumensin) pojawia się ona
10.Nauseef W. M., Olsson I., Arnljots K.: Biosynthesis and processing of myelo-
we krwi, a jej poziom ograniczony jest ustalonymi li-
peroxidasa-A marker for myeloid cell differentiation. Eur. J. Haematol. 1988,
mitami tolerancji. W praktyce hodowlanej dla monen-
40, 97-110.
11.Novilla M. N.: The veterinary importance of the toxic syndrome induced by
zyny wynoszą one: 200 i 360 mg/dzień/zwierzę dla
ionophores. Vet. Hum. Toxicol. 1992, 34, 66-69.
bydła o masie ciała powyżej 182 kg, odpowiednio
12.Oehme F. W., Pickrell J. A.: An analysis of the chronic oral toxicity of poly-
w chowie pastwiskowym i alkierzowym. Natomiast
ether ionophore antibiotics in animals. Vet. Hum. Toxicol. 1999, 41, 251-
w badaniach toksykologicznych najwyższą dawkę mo- -257.
13.Pamley R. T., Kinkade J. M., Akin D. T., Gilbert C. S., Guzman G. S.: Monen-
nenzyny, nie powodującą objawów zatrucia oznaczo-
sin disruption of neutrophil granule genesis. Am. J. Pathol. 1988, 133, 537-
no na 765 mg/dzień/zwierzę (14). Uzyskane wyniki
-548.
badań izolowanych neutrofili pod wpływem zastoso- 14.Stephenson K. A., Lean I. J.: The effect of monensin on the chemotactic
function of bovine neutrophils. Aust. Vet. J. 1996, 74, 315-317.
wanych ilości monenzyny wskazują na możliwość
15.Wessely-Szponder J., Bobowiec R., Martelli F., Wójcik M., Kosior-
wystąpienia podobnych reakcji w warunkach przyży-
-Korzecka U.: Assessment of neutrophil components as markers of lung in-
ciowych, zaznaczających się w przypadku ALP już
jury in the courser of bovine respiratory tract infections. Pol. J. Vet. Sci.
2004, 7, 157-161.
przy poziomie 1 �M tego antybiotyku. Spotęgowaną
odpowiedz
wydzielniczą ziarnistości neutrofili może
Adres autora: dr hab. Wojciech Cybulski, ul. Akademicka 12, 20-033
wywołać przedawkowanie monenzyny i/lub stany cho- Lublin; e-mail: [e-mail]
Wytworzony NO (w uM azotynu)