PRZEKŁADY
J.M. Butler, Amy E. Decker, Margaret C. Kline, Peter M. Vallone
Duplikacje chromosomowe na chromosomie Y
i ich potencjalny wpływ na interpretację Y-STR
Journal of Forensic Sciences, 2005, vol. 50, nr 4
Chromosom Y jest specyficzny dla tym zaobserwowaliS
my jednoczesną i DYS439. Amplifikację PCR przepro-
osobników męskich, co decyduje duplikację nawet w czterech różnych wadzono zgodnie z instrukcjami pro-
o możliwoS
ci jego wykorzystania loci Y-STR i  jednej kopii , pochodzą- ducenta w 30 cyklach i na 1 2 ng ma-
w badaniach dotyczących napaS
ci na cych od jednej osoby. W tym krótkim trycy DNA. Wykonano też badania za
tle seksualnym, kiedy istnieje potrze- opracowaniu zostanie omówiony pomocą NIST 20plex i 11plex.
ba identyfikacji DNA sprawcy przy wpływ duplikowanych (a nawet triple-
przeważającej iloS
ci żeńskiego DNA towanych) regionów chromosomu Y Wykrywanie i analiza produktów PCR
ofiary (ryc. 3). Na chromosomie Y zi- na ocenę tego, czy w materiale do-
dentyfikowano szereg markerów wodowym występuje mieszanina Rozdział i wykrywanie produktów
krótkich powtórzeń tandemowych DNA pochodząca od wielu dawców. PCR przeprowadzono na sekwenato-
(STR), na podstawie których stwo- rze ABI Prism� 310 albo ABI
rzono multipleksowe sondy reakcji Materiały i metody PRISM� 3100 (system 16-kapilaro-
łańcuchowej polimerazy (PCR), wy) (Applied Biosystems) zgodnie
umożliwiające rozróżnianie niespo- Próbki DNA z protokołami producenta. Po zebra-
krewnionych mężczyzn. niu danych przeanalizowano próbki
Jedno z potencjalnych zastoso- Anonimowe próbki krwi płynnej za pomocą Genescan� 3.7 (Applied
wań badania Y-STR to ustalanie licz- o znanej przynależnoS
ci etnicznej za- Biosystems) i oznaczono allele za
by osób, których materiał biologiczny kupiono w Międzystanowym Banku pomocą Genotypera 3.7 (Applied
znalazł się w materiale dowodowym Krwi (Interstate Blood Bank) w Mem- Biosystems).
w przypadkach zgwałceń zbioro- phis w stanie Tennessee i firmie Mil-
wych. W takich sytuacjach mamy lenium Biotech, Inc. (Ft. Launderdale Wyniki i omówienie
często do czynienia z mieszanym w stanie Floryda) zgodnie z przepisa-
profilem, który jest interpretowany mi NIST (National Institute of Stan- Duplikacje w wielu loci
drogą badania liczby oraz względ- dards and Technology). Z próbek w obrębie jednej próbki
nych wysokoS
ci pików występujących tych uprzednio izolowano DNA i typo-
w danym locus. WiększoS
ć po- wano za pomocą 15 autosomalnych Przeprowadzając przegląd około
wszechnie stosowanych markerów Y- STR, z zastosowaniem kitu Amp- 650 prób populacyjnych w USA, au-
STR to pojedyncze kopie, z wyjąt- FISTR� Identifiler"! (Applied Biosys- torzy zaobserwowali w pewnej liczbie
kiem locus polimorficznego DYS385. tems z Foster City w Kalifornii). Miało próbek duplikacje w kilku loci Y-STR.
Ponieważ więc chromosom Y nie ma to na celu wykazanie, że próbki się Niektóre z tych próbek zbadano po-
chromosomu w pełni homologiczne- nie powtarzają i nie są mieszaninami. nownie przy użyciu kitu PowerPlex Y,
go, obserwujemy tylko jeden produkt aby zweryfikować fakt występowania
PCR w wyniku amplifikacji markera Odczynniki Y-STR wielu alleli w różnych loci Y-STR.
Y-STR za pomocą jednej pary prime- Ryc. 1 przedstawia wyniki z Genoty-
rów PCR. Jednak ostatnio, w czasie Przy użyciu kitu PowerPlex� pera dla jednej z tych próbek, w któ-
przeprowadzania studium populacyj- z Promega Corporation (z Madison rych zaobserwowano wiele alleli Y-
nego, stwierdzono, że w ponad 1% w stanie Wisconsin) amplifikowano -STR w więcej niż jednym locus. Na-
badanych próbek wystąpiło wiele al- loci Y-STR: DYS19, DYS385a/b, leży zauważyć, że w locus DYS385
leli z loci, które wczeS
niej uważano DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS- często obserwuje się dwa allele, po-
za markery pojedynczych kopii. Poza -392, DYS393, DYS437, DYS438 nieważ na chromosomie Y często
70 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05
PRZEKŁADY
jedynczych kopii i dlatego przy ampli-
fikacji powinny dawać tylko jeden pik,
jeżeli materiał pochodzi tylko od jed-
nego mężczyzny  autorzy postano-
wili zbadać zjawisko duplikacji marke-
ra Y-STR trochę dokładniej i rozwa-
żyć jego potencjalny wpływ na wykry-
wanie mieszanin mężczyzna-męż-
czyzna za pomocą badania Y-STR.
Triplikacje
Próbkę, w której stwierdzono trzy
allele w DYS19 z powodu triplikacji
locus DYS19, amplifikowano przy
użyciu kitu PowerPlex Y. Należy za-
uważyć, że wszystkie trzy allele dla
DYS19 są zbliżone do siebie pod
względem wysokoS
ci piku i że
Ryc. 1. Elektroferogram PowerPlex Y dla próbki Tabela 1
zawierającej materiał od jednego mężczyzny z
Zestawienie duplikacji albo triplikacji dla częstych loci Y-STR. Informacje pochodzą
wieloma allelami w loci  pojedynczej kopii
z Y-STR Haplotype Reference Database (http://www.yhrd.org), wydania 13. z 1 lipca
DYS389I, DYS389II, DYS439 i DYS437
2004, składającego się z 25 066 minimalnych haplotypów. WartoS
ci wytłuszczone
(zaznaczone). JednorodnoS
ć próbki potwierdzono
obejmują allele rozdzielone jedną jednostką powtórzeń. AMG oznacza informacje
poprzez badanie 15 STR autosomalnymi za
pomocą zestawu Identifiler. Warunki zgodne z
otrzymane od Ann Marie Gross z Laboratorium Kryminalistycznego Biura Kryminalne-
opisem w częS
ci  Materiały i Metody dla 1 ng
go w Minnesocie. *Nomenklatura DYS448 za Redd i wsp.
DNA i wykrywaniem na ABI 3100.
występują dwie kopie. Ponieważ sy-
gnały alleli DYS3891, DYS439, DY-
389II i DYS437 są praktycznie równe
w obrębie każdego locus, na pierw-
szy rzut oka to spostrzeżenie może
sugerować obecnoS
ć dwóch męskich
komponentów w podobnych ilo-
S
ciach. Jednak w tej konkretnej prób-
ce, która była też badana za pomocą
15 loci autosomalnych STR, stwier-
dzono proporcjonalne heterozygo-
tyczne allele w 13 loci, a homozygoty
tylko w TPOX i D5S818. Ponieważ
po zbadaniu tak wielu polimorficz-
nych STR w żadnym locus autoso-
malnym STR nie stwierdzono wystę-
powania więcej niż dwóch alleli, jest
mało prawdopodobne, że w tej kon-
kretnej próbce występuje dobrze
zrównoważona mieszanina materiału
od dwóch różnych mężczyzn.
Ze względu na fakt, że loci DYS-
389I, DYS439, DYS389II i DYS437
są zwykle uznawane za markery po-
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05 71
PRZEKŁADY
wszystkie wysokoS
ci pików alleli z in-
nych loci są zbliżone, co sugeruje, że
każdy zaobserwowany allel występu-
je na chromosomie Y tylko raz.
Chociaż triplikacje są rzadsze,
x
ródła donoszą o ich występowaniu
w DYS19 i DYS385. Triplikacje
w DYS385 mogą powstawać w wyni-
ku duplikacji jednego z już zdupliko-
wanych alleli DYS385 albo duplikacji
całego regionu chromosomu Y, za-
wierającego allel  a i  b . Często su-
ma tych dwóch alleli jest równa inne-
mu allelowi z duplikacjami DYS385.
Model duplikacji locus Y-STR
i dywergencji
Analiza skończonej sekwencji re-
gionu eurochromatycznego chromo-
somu Y pozwala zauważyć, że duża Ryc. 2. Elektroferogram PowerPlex Y próbki zawierającej materiał od jednego mężczyzny, w którym
stwierdzono trzy allele w DYS19. Warunki zgodne z opisem w częS
ci  Materiały i Metody dla 1 ng DNA
częS
ć sekwencji chromosomu Y po-
i wykrywaniem na ABI 3100.
jawia się więcej niż jeden raz, często
we wzorze palindromicznym. Ponie-
waż na chromosomie Y zdaje się wy-
stępować niewiele genów, istnieją
mniejsze ograniczenia co do utrzy-
mania konkretnego kontekstu se-
kwencji i dlatego możliwe są polimor-
fizmy insercji dużych regionów chro-
mosomu Y. Przy braku rekombinacji
z innymi chromosomami istnieje duże
prawdopodobieństwo akumulacji
zdarzeń insercji na chromosomie Y,
co prowadzi do powstania licznych
kopii, czyli obszarów przyłączenia al-
leli dla loci, które początkowo były
markerami jednej kopii. Niedawno
doniesiono o tym zjawisku dla obsza-
rów flankowania DYS19. Po amplifi-
kacji PCR zamiast jednej kopii locus
amplifikowano dwie, jeżeli na chro-
mosomie Y istniały dwa obszary
Ryc. 3. Schemat procesu duplikacji i dywergencji, który może doprowadzić do powstania mnogich alleli
przyłączenia. Duplikacje mogą też
na chromosomie Y, kiedy wykorzystuje się specyficzne dla locus primery Y-STR. Najpierw dochodzi do
duplikacji odcinka (a) i powstaje odcinek (a ), który następnie może z czasem podlegać mutacji w
skomplikować interpretację polimorfi-
odnoS
nym locus Y-STR poprzez nabycie albo utratę jednostki powtórzenia, aby stworzyć allel
zmu pojedynczego nukleotydu chro-
oznaczony (b). Zauważmy, że najlepiej zauważalne allele powinny znajdować się w odległoS
ci jednej
mosomu Y (Y-SNP) z loci takimi jak
jednostki powtórzenia, ponieważ mutacje jednostopniowe są najpowszechniejsze dla markerów STR.
P25 i 92R7, utrudniając też ewentual-
ną interpretację mieszaniny z tymi lo- pojawienie się najpierw zduplikowa- na generację, jednostopniowo, pro-
ci, które występują wiele razy na nego regionu (a ) w innym miejscu na wadząc do powstania allela  b , który
chromosomie Y. chromosomie Y. Region ten może na- najprawdopodobniej będzie się różnił
Ryc. 3 pokazuje, jak wystąpienie stępnie niezależnie mutować z upły- od oryginału o jedną jednostkę po-
duplikacji Y-STR może powodować wem czasu z prędkoS
cią około 10-3 wtórzenia.
72 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05
PRZEKŁADY
Duplikowane mogą być całe od- Prinz, ustalenie liczby dawców nasie- koS
ć pozostałych pików Y-STR w tym
cinki chromosomu Y, obejmujące set- nia w przestępstwach na tle seksual- samym kolorze, co sugeruje, że wy-
ki par zasad (kb). Markery Y-STR fi- nym jest normalnie dużo prostsze stępują dwie kopie allela 11  po jed-
zycznie leżące niedaleko siebie na przy użyciu Y-STR, ponieważ żeński nej od każdego dawcy płci męskiej.
chromosomie Y mogą po duplikacji komponent DNA nie jest wykrywany. Zauważmy także, że w tej konkretnej
wykazywać dywergencyjne allele Jak widać na ryc. 4, w tej konkret- mieszaninie locus DYS439 ma allele
specyficzne dla loci w tej samej prób- nej mieszaninie dwóch składników 10 i 13, które różnią się trzema jed-
ce DNA. Istotne jest to, że próbki, męskich większoS
ć loci Y-STR o jed- nostkami powtórzeń. Podobnie DYS-
w których wystąpiły konkret- -437 zawiera allele 14 i 16,
ne duplikacje, na przykład al- Tabela 2. Fizyczna lokalizacja 50 markerów Y-STR na które są w odległoS
ci dwóch
chromosomie Y na podstawie przeszukania sekwencyjnego
leli 15 i 16 DYS19, wszystkie jednostek powtórzeń.
z wykorzystaniem zestawienia sekwencji Human Genome,
mogą należeć do tej samej W tym przykładzie, w któ-
z lipca 2003 (http://genome.ucsc.edu). Pozycje w megaza-
haplogrupy. Tabela 2 przed- rym wyrax
ny stosunek wyso-
sadach (Mb) są zaokrąglone do najbliższego tysiąca par za-
stawia zestawienie wszyst- koS
ci/pól pików od poszcze-
sad. Loci badane w niniejszym artykule są wytłuszczone.
kich pozycji markera Y-STR gólnych dawców jest bliski 1:
Bliskie sąsiedztwo zduplikowanych loci zaobserwowanych
dla obecnie najczęS
ciej uży- 1, nie jest możliwe przypisa-
na ryc. 1 (DYS437, DYS439, DYDS389I, YS389II) zazna-
wanych loci. Zauważmy, że nie z pewnoS
cią alleli  więk-
czono ramką, sugerującą, że ten cały region został zdupli-
DYS437, DYS439 i DYS- szoS
ciowemu czy  mniej-
kowany, a potem, z upływem czasu, nastąpiła dywergencja
389I/II, które są duplikowane szoS
ciowemu dawcy (waż-
alleli STR.
w próbce przedstawionej na ne, by odnotować, że więk-
ryc. 1, występują w odległo- szoS
ć mieszanin spotyka-
S
ci nie większej niż 150 kb od nych w S
ladach prawdopo-
siebie i dlatego jest bardziej dobnie nie będzie pozosta-
prawdopodobne, że były du- wała w stosunku 1:1). Za-
plikowane razem. Ten region miast przypisywania alleli
AZFa chromosomu Y został konkretnym dawcom w celu
także odnotowany przez Bo- stworzenia haplotypów Y-
scha i Joblinga jako dupliko- STR, które można by porów-
wany u niektórych jednostek. nać z bazą danych, jest bar-
dziej prawdopodobne, że
Przykład mieszaniny dojdzie do wykluczenia albo
mężczyzna-mężczyzna potwierdzenia zgodnoS
ci po-
dejrzanego z profilem mate-
Aby sprawdzić, czy zaob- riału dowodowego. Przypisa-
serwowaną duplikację locus nie alleli konkretnemu dawcy
Y-STR można odróżnić od w celu stworzenia złożonego
prawdziwej mieszaniny męż- haplotypu Y-STR najprawdo-
czyzna-mężczyzna, zbadano podobniej byłoby łatwiejsze
próbkę zawierającą materiał przy mieszaninie o nierów-
od dwóch różnych mężczyzn nych proporcjach (np. 3:1 za-
za pomocą zestawu Power- miast 1:1).
Plex Y. Tę konkretną miesza-
ninę dokładnie zanalizowano Rozróżnianie mieszaniny
wczeS
niej jako  próbkę X od duplikacji locus
w studium NIST Mixed Stain
Study #3, ponieważ zawiera Aby ułatwić rozróżnianie
przeważającą iloS
ć DNA żeń- ewentualnej duplikacji locus
skiego i dwa komponenty męskie. nej kopii ma więcej niż jeden pik i wy- od potencjalnej mieszaniny materiału
Poszczególne składniki z oznacze- soce polimorficzne locus DYS385 za- od dwóch mężczyzn przy wykonywa-
niami autosomalnego allela STR mo- wiera cztery piki zamiast typowych niu badania Y-STR, przedstawiamy
gą być trudne do rozszyfrowania, kie- dwóch. Dodatkowo wysokoS
ć/pole tu kilka zasad opracowanych ad hoc.
dy w próbce występuje DNA od wię- piku dla DYS392 wynosi mniej więcej Po pierwsze, należy odnotować licz-
cej niż jednego dawcy. Jak zauważył dwa razy tyle co analogiczna wiel- bę loci, w których wystąpiło więcej al-
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05 73
PRZEKŁADY
leli. Im większa liczba loci z więcej niż wanych za pomocą primerów specy- duplikacja musi wystąpić u prawdzi-
jednym allelem, z wyjątkiem układu ficznych dla locus, aby sprawdzić, wego sprawcy. Dlatego przypadki du-
DYS385a/b, tym większe prawdopo- czy któreS
loci posiadają allele róż- plikacji takie jak opisane w tym opra-
dobieństwo, że w próbce występuje niące się o więcej niż jedną jednost- cowaniu nie powinny wywoływać nie-
mieszanina materiału od kilku męż- kę powtórzeń. Duplikacje zazwyczaj pokoju w kontekS
cie badań kryminali-
czyzn. są w odległoS
ci większej niż jedno stycznych wykonywanych przy uży-
Po drugie, jeżeli więcej alleli wy- powtórzenie, iloS
ć produktu PCR dla ciu markerów Y-STR. Celem autorów
stępuje w więcej niż jednym locus, alleli jest podobna (np. DYS537 alle- jest zademonstrowanie, że w próbce
należy ustalić, czy te loci są zlokali- le 14 i 15), podczas gdy mieszaniny zawierającej materiał od jednej oso-
zowane blisko siebie na chromoso- najprawdopodobniej będą miały jed- by mogą wystąpić wielokrotne dupli-
mie Y, posługując się informacjami no albo więcej loci o rozstrzeleniu kacje i dlatego nie należy formułować
na temat względnej pozycji Y-STR, większym niż jedna jednostka powtó- pochopnych wniosków co do liczby
np. zawartych w tabeli 2. Jeżeli do- rzenia (np. DYS437 allele 14 i 16). dawców, kiedy w locus o pojedynczej
mniemane zduplikowane loci są bli- Jeżeli przyjrzymy się odległoS
ciom kopii zaobserwuje się więcej niż je-
sko siebie (np. <1 Mb), wówczas ca- alleli dla duplikowanych loci w tabeli den allel o równej intensywnoS
ci.
ły odcinek chromosomu Y mógł zo- 1, dojdziemy do wniosku, że więk- Duplikacja locus na chromosomie
stać zduplikowany kiedyS
w przeszło- szoS
ć alleli dzieli jedna jednostka po- Y jest pod wieloma względami analo-
S
ci i obecnie ma rozbieżne allele. Im wtórzeń. Wreszcie należy zbadać giczna do heteroplazmii w DNA mito-
chondrialnym, co w zależnoS
ci od
okolicznoS
ci może przyczynić się do
zwiększenia  siły zgodnoS
ci między
dwiema próbkami. Opisane zjawisko
duplikacji loci nie powinno uniemożli-
wiać wiarygodnej interpretacji, cho-
ciaż może utrudnić wyjaS
nianie wyni-
ków w sądzie. Specyficzny dla osob-
ników męskich chromosom Y jest
użytecznym narzędziem wspomaga-
jącym identyfikację, choć może się
ona okazać bardziej złożona, niż po-
czątkowo sądzono.
Przegląd literatury
zawierającej doniesienia
na temat duplikacji Y-STR
Autorzy dokonali przeglądu ok.
200 publikacji, zawierających infor-
Ryc. 4. Elektroferogram PowerPlex Y dla mieszaniny materiału od 2 mężczyzn. W zaznaczonych loci
macje na temat populacji haplotypo-
jest widocznych wiele alleli, które są oddzielone więcej niż jedną jednostką powtórzenia. Oprócz tego
wej Y-STR. Opracowania pochodzą
wysoce polimorficzne locus DYS385 ma cztery allele zamiast normalnych dwóch. Warunki zgodne z
ze zbioru literatury na temat STR
opisem w częS
ci  Materiały i Metody dla 1 ng DNA i wykrywaniem na ABI 3100.
znajdującego się pod adresem
bardziej domniemane zduplikowane DYS385 i sprawdzić, czy to wysoce http://www.cstl.nist.gov/biotech/strba-
loci są oddalone od siebie na chro- polimorficzne locus posiada więcej se/str_ref.htm. CzęS
ć wyników stu-
mosomie Y (np. DYS19 i DYS438, niż dwa allele. Jeżeli tak, i spełnione diów populacyjnych można znalex
ć
które znajdują się na różnych ramio- są inne kryteria dla mieszaniny, ist- w Y-STR Haplotype Reference Data-
nach chromosomu Y), tym bardziej nieje wówczas większe prawdopodo- base (YHRD; http://yhrd.org, wcze-
prawdopodobne jest to, że próbka bieństwo, że mamy do czynienia S
niej www.ystr.org.
zawierająca wiele alleli w wielu loci z mieszaniną niż duplikacją locus.
jest mieszaniną. OczywiS
cie jeżeli S
lad dowodowy oprac. Ewa Nogacka
Po trzecie, należy zbadać odle- zawiera materiał z jednego x
ródła,
głoS
ć wielokrotnych alleli amplifiko- w którym wykryto duplikację, ta sama
74 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05