Kinetyka reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez
inwertazÄ™.
Prowadzący: dr inż. Ilona WANDZIK
Miejsce ćwiczenia: sala 105
CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest wyznaczenie stałej Michaelisa (Km) oraz szybkości
maksymalnej (Vmax) dla reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazÄ™
oraz określenie wpływu stężenia enzymu na szybkość hydrolizy sacharozy.
WST
P TEORETYCZNY
Kinetyka reakcji enzymatycznych
(na podstawie  Ćwiczenia z biochemii , praca zbiorowa pod redakcją Leokadii Kłyszejko-
Stefanowicz, PWN, Warszawa-Poznań 1982)
Kinetyka reakcji chemicznych zajmuje się badaniem szybkości przebiegu reakcji w
zależności od różnych czynników (stężenia reagentów, temperatury, obecności
katalizatorów). Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji i matematyczne ujęcie
zależności pomiędzy szybkością reakcji a czasem jej trwania, co pozwala na podanie
szybkości reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu substratu.
PodstawÄ… katalitycznej reakcji enzymatycznej jest odwracalne wzajemne
oddziaływanie substratu (S) z enzymem (E), przy którym powstaje nietrwały kompleks
(ES), który następnie rozpada się na enzym i produkt reakcji (P).
Schemat reakcji enzymatycznej można przedstawić równaniem:
k1
k3
E + S
E + P
ES
k2
Gdzie: E wolny enzym
S substrat
ES kompleks enzym-substrat
P produkt
k1, k2, k3 stałe szybkości reakcji
W równaniu tym zakłada się nieodwracalny mechanizm reakcji.
Przy małym stężeniu enzymu, lecz przy zmieniającym się w szerokich granicach
początkowym stężeniu substratu, zmiany początkowej szybkości reakcji, wyrażone jako
ilość substratu przetworzonego w jednostce czasu, można przedstawić w postaci krzywej:
szybkość
V=-d[S]/dt
-d[S]/dt=k[E]
-d[S]/dt=k[E][S]
stężenie substratu [S]
Wpływ zwiększania stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej
2
Krzywa w pewnym punkcie zgina się i osiąga wartość maksymalną. Przy małym stężeniu
substratu reakcja jest I rzędu i szybkość reakcji jest uzależniona od stężenia substratu [S].
Przy zwiększeniu stężenia substratu osiąga się maksymalną szybkość reakcji, która jest
niezależna od stężenia substratu. Tłumaczy się to faktem, że przy zbyt małym stężeniu
substratu niektóre cząsteczki enzymu nie są połączone z substratem w danym momencie i
niecałkowite wysycenie enzymu jest przyczyną tego, że nie wykazuje on maksymalnej
aktywności katalitycznej.
W miarę zwiększania stężenia substratu dochodzi do momentu, gdy wszystkie cząsteczki
enzymu są z nim połączone i wówczas enzym pracuje z maksymalną szybkością. Dalsze
zwiększanie stężenia substratu nie wpływa już na zwiększenie szybkości reakcji- reakcja
przebiega ze stałą szybkością.
Dla reakcji (1) szybkość poszczególnych przemian jest następująca:
v1=k1[E][S]=k1[Ec-ES][S] (2)
v2=k2[ES] (3)
v3=k3[ES] (4)
gdzie: [E]  stężenie enzymu wolnego
[S]  stężenie substratu
[ES]  stężenie kompleksu enzym-substrat
[Ec]  stężenie całkowite enzymu biorącego udział w reakcji
Kompleks ES tworzy się z szybkością v1, a rozkłada z szybkością v2+v3
k1[Ec-ES][S]=k2[ES]=k3[ES] (5)
Po przekształceniu otrzymujemy:
[Ec-ES][S]
k2+k3
= = Km
(6)
[ES]
k1
Uwzględniając, że [Ec-ES]=[E], otrzymujemy:
[E][S]
(7)
= Km
[ES]
Wielkość Km zwana stałą Michaelisa jest wyrazem powinowactwa enzymu do substratu.
Enzymy o niskiej wartości Km działają znacznie sprawniej niż enzymy o wysokiej Km.
Szybkość tworzenia produktu v3 zależy od [ES], a więc im wartość [ES] jest większa, a
tym samym sta
Å‚a Michaelisa mniejsza, tym szybsze powstawanie produktu.
Szybkość reakcji enzymatycznej można zapisać równaniem
v3 = v1-v2 (8)
Reakcja v2 przebiega bardzo wolno, więc można przyjąć, że szybkość procesu
enzymatycznego v przebiega z szybkością v3:
v = v3 = k3[ES] (9)
Gdy substrat występuje w dużym nadmiarze, cały enzym jest nasycony substratem,
[ES]=[Ec], szybkość reakcji osiąga swą wartość maksymalną:
Vmax = k3[Ec] (10)
Korzystając z odpowiednich przekształceń równań otrzymujemy zależność:
Vmax[S]
= V (11)
Km+[S]
3
szybkość
reakcji
V
Vmax
1/2 V
Km
[S]
Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Mentena
Jeżeli do równania (11) wstawimy v=vmax/2, to otrzymamy po przekształceniu:
Km = [S] (12)
Czyli stała Michaelisa odpowiada takiemu stężeniu substratu, przy którym szybkość
reakcji wynosi połowę szybkości maksymalnej.
Praktyczną metodą określania stałej Michaelisa i szybkości reakcji jest metoda graficzna.
Doprowadzając równanie (11) do postaci:
1
1 Km 1
=
+
(13)
V Vmax [S]
Vmax
Otrzymujemy rónanie o postaci ogólnej y = ax + b, gdzie: b = 1/Vmax
Równanie (13) nosi nazwę równania Lineweavera-Burka. Przekształcenie to ma na celu
uzyskanie równania o ogólnej postaci linii prostej. W układzie współrzędnych wartości 1/v
odkłada się na osi rzędnych, a wartości 1/[S] na osi odciętych. Równanie daje wówczas
linię prostą, której nachylenie określa stosunek Km/Vmax. Przecina ona oś rzędnych w
punkcie 1/Vmax, a oś odciętych w punkcie 1/Km. W ten sposób można określić maksymalną
szybkość Vmax oraz stałą Michaelisa Km.
Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Mentena według Lineweavera-Burka
4
Aktywność optyczna
Związki optycznie czynne posiadają zdolność skręcania płaszczyzny polaryzacji światła.
Gdy światło spolaryzowane, wykazujące drgania w określonej płaszczyz
nie przejdzie
przez substancję optycznie czynną, wówczas jego drgania pojawiają się w innej
płaszczyz
nie. Kierunek i stopień skręcenia można mierzyć za pomocą polarymetru.
Skręcenie w lewo oznaczamy znakiem (-), a skręcenie w prawo znakiem (+). Na przykład
(+)-sacharoza jest prawoskrętna. Wielkość kąta skręcenia zależy od liczby cząsteczek
znajdujących się na drodze wiązki światła podczas jej przechodzenia przez rurkę
polarymetryczną, a zatem zależy od stężenia próbki i od długości rurki pomiarowej.
Skręcalność właściwą [ą danego związku definiujemy jako zaobserwowaną wartość
Ä…]D
Ä…Ä…
skręcenia, gdy długość rurki pomiarowej wynosi 1 decymetr, stężenie próbki wynosi
1g/ml, a długość fali światła wynosi 589 nm.
Ä…
[Ä…]D =
l c
ą - obserwowane skręcenie (w stopniach),
l  długość rurki polarymetrycznej (w dm),
c  stężenie roztworu (g/ml).
Skręcalność właściwa [ą]D jest wielkością fizyczną charakterystyczną dla danego
zwiÄ…zku optycznie czynnego, podobnie jak temperatura topnienia, temperatura wrzenia,
gęstość lub współczynnik załamania światła.
Hydroliza sacharozy
Sacharoza jest dwucukrem zbudowanym z czÄ…steczki D-glukopiranozy i D-
fruktofuranozy. Wiązanie łączące glukozę z fruktozą ulega hydrolizie i to zarówno pod
wpływem kwasów mineralnych, jak i enzymu zwanego inwertazą. Z tą reakcją związane
jest zjawisko zwane inwersją sacharozy, polegające na zmianie znaku skręcalności
roztworu sacharozy (+), gdyż w powstałej równomolowej mieszaninie cukrów fruktoza
silniej skręca płaszczyznę polaryzacji w kierunku (-) niż glukoza (+) i cały roztwór
przyjmuje skręcalność ujemną, czyli po reakcji znak skręcalności roztworu zmienia się na
przeciwny (inwersja). Otrzymywany produkt, który jest mieszaniną D-glukozy i D-
fruktozy nazywany jest cukrem inwertowanym.
+
C12H22O11 + H2O C6H12O6 C6H12O6
sacharoza
D-glukoza D-fruktoza
[Ä…]D = +66.4o
[Ä…]D = +52.1o [Ä…]D = -93.1o
cukier inwertowany
[Ä…]D = -20.5o
5
WYKONANIE ĆWICZENIA
Sprzęt:
polarymetr,
rurka polarymetryczna,
kolba miarowa o poj. 100 ml, 4 szt,
pipeta miarowa o poj. 25 ml,
kolby stożkowe o poj. 50 ml, 4 szt.,
mikropipeta, ,
waga analityczna.
Materiał i odczynniki:
sacharoza,
bufor octanowy o pH 4,7
roztwór inwertazy
Zadanie 1. Wyznaczanie stałej Michaelisa dla reakcji hydrolizy
sacharozy katalizowanej przez inwertazÄ™.
Wykonanie ćwiczenia:
Przygotować 100 ml 4% roztworu sacharozy w buforze octanowym. Do 25 ml
roztworu dodać 0.05 ml (50µl) roztworu inwertazy, wymieszać, szybko napeÅ‚nić rurkÄ™
polarymetryczną i zmierzyć kąt skręcania. Pomiary wykonać w 2, 4, 6, 8 i 10 minucie
od wprowadzenia inwertazy do roztworu.
Z pozostałego 4% roztworu sacharozy sporządzić przez rozcieńczenie roztwory 2%,
1% i 0,5%. Przeprowadzić hydrolizę sacharozy wobec takiej samej ilości enzymu dla
każdego z roztworów.
Opracowanie wyników:
1. Uzyskane wyniki zebrać w tabeli (dla każdego stężenia substratu):
Stężenie Stężenie Szybkość
Czas, Skręcalność,
substratu, cs produktu, co-cs, poczÄ…tkowa, vo, 1/cO 1/vO
min stopnie
g/100 ml g/100 ml g/min
2
4
6
8
10
1,16
cS = *Ä… + 0, *23 cO
l
l- długość rurki polarymetrycznej, dm
ą- kąt skręcania, stopnie
cO- stężenie wagowe sacharozy na początku pomiarów, g/100 ml.
6
2. Dla każdego stężenia sacharozy wykreślić zależność ilości wytworzonego
produktu (cO  cS) od czasu.
3. Na każdym wykresie przeprowadzić styczną do krzywej w punkcie t = 0 i
wyznaczyć szybkość początkową reakcji równą tgą.
4. Sporządzić wykres Michaelisa-Mentena na podstawie wyznaczonych szybkości
początkowych vO oraz wyznaczyć na tej podstawie stałą Michaelisa Km.
5. Sporządzić wykres zależności 1/vO od 1/cO dla równania Lineweavera-Burka i
wyznaczyć stałą Michaelisa Km oraz maksymalną szybkość reakcji Vmax.
Zadanie 2. Wpływ stężenia enzymu na szybkość hydrolizy sacharozy.
Wykonanie ćwiczenia:
Przygotować 100 ml 10% roztworu sacharozy w buforze octanowym i do 25 ml tego
roztworu wprowadzić 0.25 ml roztworu inwertazy. Wymieszać, szybko napełnić
roztworem rurkę polarymetryczną i zmierzyć kąt skręcenia. Pomiary powtórzyć w 5,
10, 15 i 20 minucie doświadczenia.
Analogicznie przeprowadzić badania stosując: 0.125 ml, 0.050 ml, 0.025 ml roztworu
inwertazy.
Opracowanie wyników:
1. Uzyskane wyniki zebrać w tabeli  dla każdego stężenia inwertazy:
Stężenie Stężenie Szybkość
Czas, Skręcalność,
substratu, cs produktu, co-cs, poczÄ…tkowa, vo,
min stopnie
g/100 ml g/100 ml g/min
0
5
10
15
20
2. Dla każdego stężenia enzymu sporządzić wykresy zależności ilości produktu od
czasu.
3. Wyznaczyć szybkości początkowe reakcji.
4. Przedstawić graficznie zależność szybkości vO od stężenia enzymu.
5. Zinterpretować uzyskane wyniki.
Warunki zaliczenia ćwiczenia:
" Pozytywny wynik kartkówki dopuszczającej do wykonania ćwiczenia
" Wykonanie sprawozdania,
Uwaga: na zajęcia należy przynieść papier milimetrowy
7