Wykład:
Genetyka bakterii fermentacji mlekowej
TrochÄ™ historii
1. Badania nad genetyką bakterii fermentacji mlekowej rozpoczęto dopiero na początku lat 70-tych ubiegłego
stulecia.
2. Pierwsze badania dotyczyły plazmidów oraz naturalnego transferu genów u laktokoków.
Obecny stan badań nad genetyką LAB
·ð PogÅ‚Ä™bianie wiedzy z zakresu genetyki LAB: głównie transferu genów i inżynierii genetycznej LAB.
·ð To obecnie jedna z najważniejszych dziedzin mikrobiologii żywnoÅ›ci.
Budowa komórki bakteryjnej
Lokalizacja genów
·ð Na chromosomie (nukleoidzie),
·ð Na pozachromosomowych kawaÅ‚kach DNA zwanych plazmidami.
·ð Poszczególne gatunki bakterii różniÄ… siÄ™ miÄ™dzy sobÄ… wielkoÅ›ciÄ… genomu (wielkoÅ›ciÄ… DNA i iloÅ›ciÄ… genów
kodujących informację o komórce).
Chromosom i plazmidy
bp (z ang. base pairs) = par zasad = par nukleotydów
Nukleoid
·ð Obszar komórki bakteryjnej (priokariotycznej) bÄ™dÄ…cy odpowiednikiem jÄ…dra komórkowego
u organizmów wyższych (eukariotycznych),
·ð Nukleoid nie jest oddzielony od cytoplazmy otoczkÄ… jÄ…drowÄ…,
·ð Zawiera genofor (chromosom bakteryjny), czyli pojedynczÄ…, kolistÄ… czÄ…steczkÄ™ DNA,
·ð Nukleoid wraz z plazmidami zawiera peÅ‚nÄ… informacjÄ™ genetycznÄ… komórki (genom).
Chromosom
·ð Jest to wzglÄ™dnie maÅ‚a, pojedyncza kolista czÄ…steczka DNA, o dÅ‚ugoÅ›ci ok. 200 nm, zawiera 1,8 - 3,4 Mb
(mln par zasad) (dla porównania: u ludzi genom ma długość 2 metrów i wielkość 3,5 - 5,6 mld pz),
·ð Niezwykle dÅ‚uga w porównaniu do wielkoÅ›ci komórek bakteryjnych, niezwykle silne poskrÄ™cana (tzw.
superhelikalny DNA), co pozwala na jej upakowanie w komórce bakteryjnej.
Chromosom
·ð Prawie wszystkie geny u bakterii sÄ… zlokalizowane na chromosomie (reszta na plazmidach),
·ð OkoÅ‚o 75 - 85% DNA chromosomu bakteryjnego to geny, pozostaÅ‚e 15 - 25% to tzw. miÄ™dzygenowy DNA,
oddzielający poszczególne geny (w genomie człowieka te proporcje są odwrócone  tylko ok. 5% genomu
koduje jakieś białka!).
·ð Niektóre geny w chromosomie sÄ… pogrupowane w rodziny zwane operonami,
·ð Operony kodujÄ… biaÅ‚ka zwiÄ…zane ze sobÄ… funkcjami, zaÅ› geny w jednym operonie sÄ… regulowane z
skoordynowany sposób,
·ð Inne geny sÄ… rozmieszczone w chromosomie bakteryjnym przypadkowo.
·ð Terminy zwiÄ…zane z elementami strukturalnymi chromosomu:
- introny i eksony,
- otwarta ramka odczytu (ORF),
- transpozony.
Introny i eksony
·ð Sekwencje kodujÄ…ce informacjÄ™ sÄ… zwykle rozdzielone na seriÄ™ odcinków DNA, zwanych eksonami.
·ð Eksony sÄ… porozdzielane przez introny, które nie zawierajÄ… użytecznych informacji,
·ð Przed wykorzystaniem informacji biologicznej genów do syntezy biaÅ‚ka, introny muszÄ… być usuniÄ™te z
ciÄ…gu sekwencji kodujÄ…cej,
·ð W komórkach bakteryjnych intronów jest niewiele.
Otwarta ramka odczytu
·ð ORF  z ang. open reading frame,
·ð Jest to ciÄ…g nukleotydów rozpoczynajÄ…cy siÄ™ od kodonu startowego ATG i koÅ„czÄ…cy kodonem koÅ„cowym.
To znaczy, że ORF określa potencjalny gen, kodujący jakiś peptyd,
·ð Aby dany OFR mógÅ‚ być okreÅ›lony jako potencjalny gen musi mieć dÅ‚ugość co najmniej 50 kodonów
(kodon, inaczej triplet, jest to sekwencja 3 nukleotydów kodująca jeden aminokwas),
·ð Liczba ORF w genomie wskazuje na liczbÄ™ genów kodujÄ…cych biaÅ‚ka.
Transpozony
·ð SÄ… elementami sekwencji DNA zdolnymi do przemieszczania siÄ™ w genomie (w bakteryjnym chromosomie
i plazmidach),
·ð MogÄ… być wstawione w dowolnym miejscu chromosomu lub przenoszone w dowolne miejsce w
chromosomie
·ð SÄ… to elementy niezależne  każdy transpozon koduje enzym transponazÄ™, katalizujÄ…cÄ… transpozycjÄ™
transpozonu.
·ð SÄ… najprostszymi elementami ruchomymi.
·ð WystÄ™pujÄ… u wielu LAB,
·ð Znanych jest wiele rodzajów transpozonów,
·ð PrzykÅ‚adem sÄ… sekwencje insercyjne (IS, z ang. insertion sequences), które mogÄ… być przenoszone nawet z
jednej komórki bakteryjnej do innej podczas koniugacji komórek (jednego gatunku lub gatunków blisko
spokrewnionych) przy użyciu plazmidów.
·ð Zdolność do przemieszczania siÄ™ w genomie oznacza, że mogÄ… powodować mutacjÄ™ genów, do których sÄ…
wprowadzone,
·ð MogÄ… kodować np. zdolność do wytwarzania nizyny, fermentacji sacharozy, oporność na bakteriofagi,
antybiotyki lub metale ciężkie (i mogą te zdolności przekazywać innym bakteriom własnego gatunku lub
gatunków blisko spokrewnionych).
·ð Rozprzestrzenianie siÄ™ wankomycynoopornoÅ›ci. Gen vanB gene (z lewej) na 64 kb transpozonie jest częściÄ…
250 kb elementu ruchomego przenoszonego z jednej komórki enterokoka do innej.
Transpozony u LAB
·ð U szczepów Lac. lactis spotyka siÄ™ 5 różnych sekwencji insercyjnych (IS) i u wiÄ™kszoÅ›ci takich szczepów
występują one w co najmniej dwóch kopiach,
·ð Niektóre szczepy posiadajÄ… koniugacyjne transpozony (wielkoÅ›ci 68 kbp),
·ð Sekwencje IS sÄ… stwierdzane również u bakterii z rodzaju Lactobacillus i Leuconostoc, ale nie u Str.
thermophilus.
Plazmidy
·ð SÄ… kolistymi, superzwiniÄ™tymi dwuniciowymi czÄ…steczkami DNA, wystÄ™pujÄ…cymi obok chromosomu
bakteryjnego prawie u wszystkich bakterii.
·ð SÄ… niezależnie replikowanymi czÄ…steczkami DNA (ich replikacja odbywa siÄ™ niezależnie od replikacji
chromosomu komórki),
·ð LAB majÄ… plazmidy w różnej liczbie kopii: niskokopiowe (liczba kopii 1 - 50) i wysokokopiowe (liczba
kopii 100 - x100).
·ð Nie sÄ… niezbÄ™dne dla życia - mogÄ… być usuniÄ™te bez szkody dla komórki (nie kodujÄ… funkcji, które byÅ‚yby
konieczne do jej życia, ale zwiększają różnorodność zajmowanych środowisk),
·ð Ilość genów zgromadzonych w plazmidach odgrywa znaczÄ…cÄ… rolÄ™ w ewolucji i zdolnoÅ›ci adaptacyjnych
komórek, w których się znajdują.
·ð Niektóre maÅ‚e plazmidy wykorzystujÄ… do replikacji (powielania siÄ™) enzymy komórkowe, wiÄ™ksze plazmidy
posiadają często geny kodujące własne enzymy replikacyjne,
·ð Istnieje wiele różnych plazmidów bakteryjnych,
·ð Poszczególne gatunki bakterii mogÄ… posiadać nawet kilka typów plazmidów, ale nie muszÄ…
posiadać wszystkich.
5 typów plazmidów
·ð Typu R  zawierajÄ… geny kodujÄ…ce oporność np. na antybiotyki, bakteriocyny, metale ciężkie.
Mogą przenosić oporność na antybiotyki między gatunkami bakterii, co ma ogromne znaczenie
w pojawianiu się antybiotykoopornych szczepów bakterii patogennych.
Powszechne stosowanie antybiotyków w lecznictwie, doprowadziło do rozpowszechnienia się plazmidów R
wśród chorobotwórczych bakterii.
·ð Typu F i umożliwiajÄ… przenoszenie genów miÄ™dzy komórkami bakteryjnymi w procesie zwanym
koniugacjÄ….
Mogą zawierać dodatkowe geny, przejęte z chromosomu, które są przenoszone do drugiej komórki podczas
koniugacji.
·ð Kolicynowe  na których zlokalizowane sÄ… geny kodujÄ…ce biaÅ‚ka zabijajÄ…ce inne bakterie (bakterioncyny).
·ð Degradacyjne  kodujÄ…ce biaÅ‚ka pozwalajÄ…ce metabolizować nietypowe zwiÄ…zki chemiczne, np. toluen,
nikotynÄ™.
·ð Wirulencji  kodujÄ…ce zdolność wywoÅ‚ywania chorób.
Plazmidy u LAB
·ð SÄ… powszechniejsze u laktokoków niż u paÅ‚eczek mlekowych,
·ð WiÄ™kszość szczepów laktokoków zawiera po 4 - 7 różnych plazmidów,
·ð CzÄ™sto spotykane u paÅ‚eczek mlekowych i pediokoków,
·ð Czasami stwierdzane u Str. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus i paÅ‚eczek
pochodzenia jelitowego.
Plazmidy u laktokoków
1. Mają szczególne znaczenie, gdyż warunkują cechy użyteczne dla bakterii - kodują istotne dla procesu
fermentacji mlekowej takie zdolności bakterii, jak:
- metabolizm cukrów, np. laktozy i galaktozy,
- aktywność proteinaz (aktywność proteolityczna),
- transport oligopeptydów,
- oporność na bakteriofagi i bakteriocyny,
- wytwarzanie egzopolisacharydów (EPS),
- wykorzystanie kwasu cytrynowego (fermentacja cytrynianów).
Zaburzenia w replikacji lub zmiana warunków środowiskowych (np. temperaturowych) bytowania komórek
bakteryjnych powodują, że bakterie gubią plazmidy,
Gubienie plazmidów przez komórki bakteryjne powoduje brak stabilności cech szczepów przemysłowych podczas
przeszczepiania i pasażowania (np. utratę zdolności fermentacji laktozy, cech proteolitycznych, oporności na fagi lub
bakteriocyny).
Problemy z plazmidami u LAB
·ð Komórka bezplazmidowa DAJE w nastÄ™pnym pokoleniu już tylko komórki bezplazmidowe, a ta, która
zawiera jeszcze plazmidy MOŻE dać potomstwo bezplazmidowe.
·ð LAB posiadajÄ… 2 typy plazmidów:
- teta - o masie ponad 10 tys. par zasad, w trakcie replikacji daje 2 identyczne, stabilne czÄ…steczki
plazmidów
- RCR (rolling-circle replicating) - o masie ok. 10 tys. par zasad, wysokokopiowe, ale niestabilne, przy
zaburzeniach w replikacji może dać komórki bezplazmidowe.
·ð MaÅ‚e plazmidy (< 5 kb) stwierdzane u Lactobacillus spp., podobnie jak wiele innych plazmidów bakterii
Gram-dodatnich, wykazują organizację modułową i są replikowane jak plazmidy RCR.
Wymiana informacji genetycznej między LAB
1. Koniugacja
2. Transdukcja
3. Transformacja
Koniugacja
1. Koniugacja wymaga bezpośredniego kontaktu komórek,
2. Zachodzi za pośrednictwem plazmidów, głównie typu F, przenoszenie jest kierowane przez geny
znajdujÄ…ce siÄ™ w plazmidach.
3. Przenoszonym materiałem genetycznym może być plazmid lub fragment chromosomu, który jest transferowany
dzięki plazmidowi.
4. Plazmid F może być autonomiczny lub zintegrowany z chromosomem bakterii (ten drugi przypadek ułatwia
przeniesienie genów do innej komórki bakteryjnej w procesie koniugacji).
Transdukcja
LAB mogą pozyskiwać nowe geny poprzez transdukcję, czyli przeniesienie materiału genetycznego z
wykorzystaniem bakteriofagów. Zazwyczaj przenoszony jest tylko mały fragment DNA. Nie wszystkie bakteriofagi
mają zdolność do transdukcji, nie każda bakterię można transdukować.
Transformacja
·ð MetodÄ… transformacji, czyli przekazania genów w formie rozpuszczalnego DNA, uwolnionego z komórek
bakteryjnych. Ten sposób przekazywania genów między bakteriami został wykryty jako pierwszy.
·ð W warunkach in vitro transformacja polega na wymieszaniu czystych hodowli bakteryjnych z
wyizolowanym i oczyszczonym DNA, pobranym od innych bakterii. Te komórki, które pobrały DNA, są
następnie selekcjonowane i namnażane w hodowlach.
·ð Metoda transformacji jest wykorzystywana w laboratoriach do mapowania (poznawania) i manipulowania
informacjÄ… genetycznÄ… (modyfikacji genetycznych).
·ð Sposoby transformacji:
- kompetencja (naturalna zdolność niektórych gatunków bakterii do pobierania DNA, np. Streptococcus),
- indukcja kompetencji różnymi zabiegami (u komórek niezdolnych do kompetencji naturalnej),
- protoplastyzacja komórek Gram-dodatnich,
- elektroporacja (zmiana przepuszczalności błon biologicznych pod wpływem pola elektrycznego i
transformacja plazmidowego DNA).
Po co nam wiedza o genach LAB?
·ð UÅ‚atwia lub umożliwia bardzo dokÅ‚adnÄ… klasyfikacjÄ™ i identyfikacjÄ™ LAB (homologia genów, głównie
sekwencjonowanie i porównanie fragmentów restrykcyjnych 16S rDNA w reakcji PCR).
·ð drzewo filogenetyczne oparte na 16S rRNA
·ð Ale poznanie sekwencji genów to nie jest wszystko - trzeba jeszcze poznać biaÅ‚ka, które sÄ… kodowane
i ich właściwości.
·ð Pozwala na poznanie narzÄ™dzi (np. wektorów plazmidowych)do udoskonalania szczepów LAB
stosowanych przemysłowo.
·ð Umożliwia otrzymanie nowych szczepów LAB o lepszych lub nowych wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ciach:
- zdolnościach fermentacyjnych lub wzrostowych (np. szybsza fermentacja, lepsze cechy sensoryczne
żywności fermentowanej, hamowanie rozwoju patogenów lub mikroflory psującej żywność),
- brak wytwarzania niepożądanych substancji ubocznych fermentacji, np. gorzkich peptydów,
- większej odporności na czynniki stresowe
lub bakteriofagi.
·ð Umożliwia otrzymanie szczepów LAB o nowych wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ciach, np.:
- wytwarzania substancji antybiotycznych, utrwalających żywność, składników odżywczych (takich jak
witaminy, aminokwasy),
- rozkładania lub neutralizacji substancji szkodliwych, np. alergenów, mykotoksyn, metali ciężkich,
cholesterolu.
·ð Możliwość wykorzystania LAB dla poprawy zdrowia ludzi (profilaktycznie i jako terapeutyki, bez skutków
ubocznych dla organizmu człowieka).
·ð Możliwość regulacji szlaków metabolicznych LAB
Najnowsze efekty?
·ð Regulacja metabolizmu aminokwasów i peptydów podczas wzrostu w mleku proteinazo-dodatnich (Prt+) i
-ujemnych (Prt-) szczepów Lactococcus lactis.
·ð Badania nad zwalczaniem bakterii patogennych metodÄ… alternatywnÄ… do antybiotyków, przy użyciu
plazmidów, zwaną strategią  Konia trojańskiego .
·ð Strategia  Konia trojaÅ„skiego polega na zabiciu patogennej bakterii przez wprowadzenie zabójczego
plazmidu przy pomocy koniugacji z komórką nieszkodliwej bakterii.
·ð Bakterie mlekowe być może pomogÄ… walczyć z AIDS. Naukowcom z Brown Medical School w USA udaÅ‚o
się zmodyfikować bakterie mlekowe w ten sposób, że wytwarzają lek przeciwko HIV (białko nazwane
cynowiryną, które łączy się z wirusem HIV i zapobiega jego przyłączeniu do komórek błony śluzowej).
·ð Zespół naukowców dokonaÅ‚ tego używajÄ…c metody elektroporacji. Przez komórki bakterii, zawieszone
w roztworze ochronnym (PEG, glikol polietylenowy), przepuścili impulsy silnego prądu stałego.
Spowodowało to utworzenie małych porów w błonie komórkowej bakterii. Dzięki temu, zawieszone w
roztworze cząsteczki DNA mogły wniknąć do wnętrza komórek bakteryjnych i bakterie zaczęły
produkować białko, którego gen został do nich wprowadzony.