GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
TEN ROZDZIAA
NIE JEST JESZCZE GOTOWY
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW
Organizacja materiału genetycznego bakterii
Pojedynczy chromosom prokariotyczny zawiera praktycznie całą informację
genetyczną. Zdecydowana większość bakterii ma chromosom kolisty i nie posiada
błony oddzielającej go od cytoplazmy co daje możliwość bliskiego występowania
procesu produkcji mRNA na matrycy DNA oraz maszynerii odpowiedzialnej za
biosyntezę białek.
W komórkach prokariotycznych procesy transkrypcji i translacji zachodzą
jednocześnie do tego stopnia, że możliwe jest rozpoczęcie translacji na jednym końcu
mRNA zanim zostanie zakończona transkrypcja na drugim końcu.
Kolisty chromosom bakteryjny jest podzielony na kilkadziesiąt pętli, które mają
końce unieruchomione w białkowym szkielecie. Białka występujące w
chromosomach bakteryjnych tzw. białka histonopodobne, poza organizowaniem DNA
w chromosomie pełnią jeszcze pewne dodatkowe funkcje przypominając działaniem
czynniki transkrypcyjne w komórkach eukariotycznych.
Mapa chromosomu bakteryjnego daje pewne wiadomości o jego organizacji. Poza
niektórymi grupami genów skupionymi w operony, nie da się zaobserwować
konkretnego wzorca, według którego następowałaby lokalizacja genów w
chromosomie bakteryjnym. Transkrypcja operonów może zachodzić dla niektórych w
jednym kierunku, a dla innych w przeciwnym.
Miejsce replikacji chromosomu bakteryjnego jest ściśle określone tzw.ori (origin of
replication) dla każdego typu bakterii, ponadto podobna jest aranżacja genów
zarówno w ori jak i w miejscu terminacji syntezy DNA. Poza tym w niektórych
bakteriach wydaje się ważne, aby w przypadku pewnych regionów kierunek
transkrypcji był taki sam jak kierunek poruszania się widełkek replikacyjnych DNA.
(FIG7.33bomicroorg.)
1 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
Replikacja DNA
W replikacji DNA głównym problemem jest precyzyjna duplikacja sekwencji
nukleotydowych, co zachodzi dzięki parowaniu komplementarnemu. Proces replikacji
jest semikonserwatywny, co oznacza, że wyprodukowane podwójne helisy zawierają
jedną nić rodzicielską i jedną nowoutworzoną.
Replikacja zachodzi od 5' do 3' końca dzięki polimerazom DNA. Enzymy te nie mogą
rozpocząć syntezy nowej nici bez primera (zwykle krótka cząsteczka RNA).
Dobrze poznany jest mechanizm replikacji u E. coli. Proces ten zaczyna się w ori
(origin of replication, około 300 b rozpoznawanych przez specyficzne białka). W ori
podwójna helisa DNA otwiera się i zachodzi inicjacja na obu niciach jednocześnie z
utworzeniem specyficznej struktury tzw. widełek replikacyjnych.
W kolistym DNA E. coli dwukierunkowa replikacja prowadzi do powstania struktur
theta (na rysunku). U bakterii tej są trzy polimerazy DNA: I, II i III. Polimeraza DNA
III działa w widełkach replikacyjnych dodając nowe nukleotydy. W celu zajścia
replikacji podwójna helisa DNA jest rozwijana przez helikazę i stabilizowana przez
SSBP (single stranded binding protein).
Pomiędzy syntezą DNA na obu niciach istnieją wyraz
ne różnice. Synteza na nici
wiodącej 5' U
3' przebiega w sposób ciągły, gdyż jest koniec 3'OH, do którego można
dodać nowy nukleotyd. Na drugiej nici DNA jest syntetyzowane fragmentami,
ponieważ nie ma końca 3'OH i konieczne jest zsyntetyzowanie małego primera RNA
aby dostarczyć wolne grupy 3'OH.
Po syntezie primeru primaza jest zastępowana przez polimerazę DNA III, która
dodaje nukleotydy do momentu dojścia do uprzednio zsyntetyzowanego DNA. Wtedy
polimeraza DNA III jest odłączana a pojawia się polimeraza DNA I, która poza
zdolnością do syntezy DNA, może usuwać primer RNA znajdujący się przed nią.
Po usunięciu primera polimeraza DNA I jest uwalniania i ostatnie wiązanie
fosfodiestrowe zostaje wyprodukowane przy pomocy ligazy DNA.
Podczas syntezy DNA w widełkach replikacyjnych następują zmiany w zwinięciu
DNA spowodowane przez enzymy rozplatające oraz topoizomerazy, które w pewnym
stopniu regulują proces replikacji.
Błędy replikacyjne naprawiane są przez polimerazę DNA III, która poza zdolnością
do syntezy DNA, ma aktywność 3' U
5' egzonukleazy, co oznacza, że usuwa ona z
le
wstawiony nukleotyd i zastępuje go nukleotydem prawidłowym. System naprawczy
nie zawsze zdoła wychwycić wszystkie błędy co może spowodować powstanie
mutacji.
Modele replikacyjne:
obracającego się koła
theta
przemieszczającej się pętli
2 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
Wytłumaczone na rysunkach
Regulacja ekspresji genów u bakterii
Pierwszym etapem ekspresji każdego genu jest transkrypcja. Prowadzi ona do
powstania RNA na matrycy DNA. Proces ten jest przeprowadzany przez polimerazę
RNA, a prekursorami są ATP, GTP, UTP, CTP. W przeciwieństwie do polimerazy
DNA polimeraza RNA może zacząć nową nić bez primera. Wszystkie polimerazy
RNA u bakterii są skomplikowanymi enzymami składającymi się z wielu
podjednostek. Enzym ten u E. coli zawiera podjednostki b , b ', a w dwóch kopiach
oraz s , która jest luz
no związana z pozostałymi i łatwo może oddysocjować. Wiązanie
polimerazy RNA do DNA odbywa się w specjalnych miejscach promotorowych.
Cząsteczka s bierze udział tylko w formowaniu początkowego kompleksu polimerazy
RNA z DNA i jest odpowiedzialna za rozpoznanie promotorów: sekwencji -35 od
miejsca inicjacji i sekwencji Pribnow box w regionie -10 od miejsca inicjacji. W
wyniku działania polimerazy RNA w kierunku 5' U
3' powstaje mRNA.
U Prokaryota pojedyncza molekuła mRNA często koduje więcej niż jedno białko ze
względu na występowanie grup genów zwanych operonami. Polimeraza RNA
transkrybuje wtedy wszystkie geny z danego operonu na pojedynczą molekułę mRNA
(tak zwane policystroniczne mRNA). W mRNA u Prokaryota zazwyczaj nie
występują introny, jednak jeśli już się tam znajdą to są samoistnie wycinane przez
RNA (zwane rybozymem).
tRNA i rRNA powstają jako długie cząsteczki prekursorowe, które są następnie cięte
w kilku miejscach w celu utworzenia dojrzałych cząsteczek RNA. mRNA podlega na
ogół bezpośredniej translacji.
Translacja zachodzi w kilku etapach : inicjacja, elongacja, terminacja, uwolnieni i
sfałdowanie polipeptydu przy wykorzystaniu całej maszynerii jaką jest m.in. rybosom.
U Prokaryota rybosomy składają się z dwóch podjednostek: 30S i 50S dających w
połączeniu rybosom 70S. Podjednostka 30S zawiera 16S rRNA i około 21 białek,
natomiast podjednostka 50S zawiera 5S i 23S rRNA i około 34 białek.
Inicjacja syntezy białek zaczyna się od uformowania kompleksu zawierającego
podjednostkę 30S, mRNA, tRNA dla formylometioniny i czynniki inicjatorowe. Do
tego kompleksu przyłącza się podjednostka 50S. Związanie mRNA z rybosomem
zależy od tzw. sekwencji Shine-Dalgarno (3 do 9 nukleotydów zlokalizowanych przed
kodonem inicjacyjnym na mRNA). Ta sekwencja jest komplementarna do 3' końca
16S RNA rybosomu i pozwala komórkom prokaryotycznym na translację
policystronicznego mRNA.
Proces inicjacji rozpoczyna się przyłączeniem aminoacylo-tRNA do kodonu start. U
bakterii inicjatorowym aminoacylo-tRNA jest formylometionina. Terminacja syntezy
białek zachodzi gdy osiągnięty zostanie kodon nonsensowny inaczej zwany kodonem
stop. Białka uwalniają się, a rybosom dysocjuje na dwie podjednostki.
Zgromadzenie powiązanych ze sobą funkcyjnie genów bakteryjnych w jednym
miejscu związane jest z regulacją przeprowadzaną przez specyficzne cząsteczki,
umożliwiającą kontrolę ekspresji genów jednego szlaku metabolicznego.
Tego typu regulacja ekspresji genów bakteryjnych bierze się z konieczności
3 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
efektywnego wykorzystania ograniczonych zapasów i energii oraz produkcji
wyłącznie niezbędnych związków.
Prawidłowo funkcjonująca komórka bakteryjna nie powinna syntetyzować enzymów
do metabolizmu laktozy, jeżeli brak jest laktozy w pożywce. Podobnie bezsensowne
byłoby produkowanie enzymów do syntezy tryptofanu jeśli znajdowałby się on w
wystarczającej ilości.
Dlatego też komórki bakteryjne opracowały precyzyjne mechanizmy kontroli syntezy
różnych związków oparte na strukturze ich informacji genetycznej, w której geny
odpowiedzialne za konkretny szlak metaboliczny znajdują się w jednym miejscu i
tworzą tzw. operon.
Pierwszym poznanym mechanizmem regulacji operonowej u bakterii jest proces
rozkładu laktozy u E.coli. Laktoza jest disacharydem ulegającym rozłożeniu na dwa
cukry składowe: galaktozę i glukozę, pod wpływem enzymu beta-galaktozydazy. Jeśli
w środowisku nie ma laktozy, w komórce E.coli znajduje się tylko kilka cząsteczek
tego enzymu. Natomiast w momencie gdy w środowisku znajduje się laktoza, w
komórce pojawiają się tysiące cząsteczek beta-galaktozydazy. Dodatkowo zwiększa
się w komórce ilość pozostałych enzymów zaangażowanych w szlak laktozowy
(galaktozydopermeazy i transacetylazy galaktozydowej). Każdy z tych enzymów jest
kodowany przez oddzielny gen jednak ich ekspresja ulega wspólnej regulacji. Geny
tych trzech enzymów znajdują się w jednym liniowym odcinku na chromosomie
E.coli i zostały oznaczone według kolejności występowania:
Z - beta galaktozydaza
Y - beta galaktozydopermeaza (białko transportowe)
A - transacetylaza galaktozydowa.
Ekspresja wszystkich trzech genów podlegać może jednoczesnej indukcji przez
cząsteczkę laktozy. Na tej podstawie stwierdzono, że przed tymi genami musi się
znajdować niezależny element genetyczny, który reguluje ich ekspresję.
W końcu okazało się, że w regulacji bierze udział kilka genów:
gen regulatorowy (gen lacI), który koduje cząsteczkę represora zdolną do
przejścia w inne miejsce, do operatora, gdzie indukuje ona sygnał wyłączający
operon
gen operatora, który otrzymuje sygnał wyłączający z represora
trzy geny kodujące białka, które są transkrybowane na jedno mRNA
miejsce promotora (częściowo nachodzące na gen operatorowy), gdzie
przyłącza się RNA polimeraza i indukuje syntezę mRNA
Operon laktozowy, lac, działa w następujący sposób. Gen regulatorowy produkuje
cząsteczkę represora, która może przenieść się do miejsca występowania operatora,
przyłączyć się do niego i zahamować transkrypcję genów strukturalnych w tym
operonie.
Jeżeli w pobliżu nie ma cząsteczek laktozy, cząsteczka represora przyjmuje
konformację zdolną do związania się z operatorem. Gdy represor zwiąże się z
operatorem, promotor jest częściowo zasłonięty, wobec czego polimeraza RNA nie
4 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
może się z nim związać i nie dochodzi do transkrypcji mRNA a następnie syntezy
trzech białek.
Jeżeli natomiast w środowisku obecna jest laktoza, represor wiąże się z nią i
przyjmuje inny kształt, który nie pozwala na połączenie się z operatorem. Promotor
pozostaje odsłonięty, wiąże się z polimerazą RNA i dochodzi do ekspresji genów,
które następnie prowadzą do rozkładu laktozy.
Jest to przykład regulacji genów na poziomie transkrypcyjnym.
FIG 14-10 z Hopsona p. 314 An inducible operon
Ten mechanizm jest prosty i ładnie tłumaczy dlaczego komórka E.coli produkuje
tylko tyle beta-galaktozydazy ile jest jej potrzebne. Jednak w rzeczywistości sytuacja
staje się nieco bardziej skomplikowana gdyż komórka bakterii może jednocześnie
otrzymać laktozę i glukozę. Co wtedy?
Dla bakterii korzystniejsze jest rozłożenie glukozy niż laktozy, ponieważ glukoza
może być natychmiast zużyta w metabolizmie, a laktoza musi zostać najpierw
rozłożona w skomplikowanych reakcjach chemicznych.
Bakteria zdolna do zużycia glukozy pomimo obecności laktozy w pożywce będzie
rosła szybciej niż inne bakterie tym samym zdobywając pewną nad nimi przewagę.
Dlatego też nie należy się dziwić, że powstał mechanizm tzw. represja kataboliczna,
który umożliwia bakterii zużywanie na początku glukozy nawet gdy jest laktoza.
Mechanizm represji katabolicznej opiera się na fakcie, że polimeraza RNA łączy się z
promotorem w operonie lac dużo lepiej w obecności specyficznego białka CAP
(catabolite gene activator protein), które musi być związane ze specyficznym
miejscem DNA położonym w pobliżu tzw.CBS (CAP binding site). Białko CAP wiąże
się z tym miejscem jeśli do tego białka przyłączą się cząsteczki cAMP, co zachodzi
przy braku glukozy.
Jeżeli natomiast glukoza znajduje się w pożywce, spada poziom cAMP, białko CAP
zmienia kształt, nie wiąże się z CBS, polimeraza RNA gorzej wiąże się z promotorem i
synteza enzymów szlaku laktozowego zostaje spowolniona.
Fig14-11 p.315 Represja kataboliczna Biology Wessels Hopson
Istnieją więc trzy różne poziomy aktywności operonu lac, zależne od obecności
laktozy i glukozy w pożywce oraz regulowane przez trzy różne białka: lac represor,
polimerazę RNA i CAP.
Najniższy poziom ekspresji zachodzi pod nieobecność laktozy: nie ma substratu,
niepotrzebne są enzymy do katalizy, represor lac jest połączony z operonem i blokuje
wiązanie się polimerazy RNA.
Najwyższy poziom ekspresji obserwuje się przy obecności laktozy, lecz braku
glukozy: laktoza wiąże represor uniemożliwiając mu związanie się z operatorem, co z
kolei pozwala na przyłączenie polimerazy RNA, a dodatkowo wysoki poziom cAMP i
łączenie się go z CAP i CAP z CBS co w rezultacie uaktywnia polimerazę RNA.
Model regulacji rozkładu laktozy w operonie lac jest jednym z wielu jakie funkcjonują
w komórkach bakteryjnych. Jest to przykład pozytywnej regulacji ekspresji gdyż
obecność substratu w pożywce indukuje produkcję enzymów.
5 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
Ponadto mamy do czynienia z innymi modelami regulacji ekspresji genów również
wynikającymi z dążenia komórki do efektywnego wykorzystania surowców ale
jednocześnie nie nadprodukowania jakiejś substancji bez wyraz
nej potrzeby. Ten typ
mechanizmu regulacji to represja czyli zahamowanie syntezy enzymów szlaku
biosyntetycznego w odpowiedzi na nadmiar końcowego produktu. Przykładem
operonu regulowanego w ten sposób jest operon tryptofanowy (trp).
Operon ten zawiera pięć genów (E,D,C,B,A) kodujących enzymy, które prowadzą do
syntezy aminokwasu - tryptofanu. W przypadku operonu tryptofanowego również
mamy do czynienia z cząsteczką represora kodowaną w niewielkiej odległości od
operonu. Cząsteczka represora trp podobnie jak lac może istnieć w dwóch
konformacjach: jedna powoduje łączenie z operatorem i zablokowanie transkrypcji,
natomiast druga konformacja nie pozwala na związanie się represora z operatorem i
umożliwia zajście transkrypcji.
W obecności tryptofanu cząsteczka represora wiąże się z tym aminokwasem i zmienia
konformację, na taką która umożliwia związanie się z operatorem i zablokowanie
syntezy enzymów.
Jeżeli tryptofan jest nieobecny, represor nie może związać się z operatorem. Dochodzi
wtedy do przyłączenia polimerazy RNA i syntezy enzymów, które w następstwie
doprowadzą do syntezy tryptofanu.
Oba opisane mechanizmy regulacji ekspresji genów czyli indukcja operonu lac i
represja operonu trp są przykładami na kontrolę negatywną. Oznacza to, że ekspresja
genów podlegających takiej kontroli zachodzi dopóki nie zostanie wyłączona przez
cząsteczkę represora.
Istnieje jeszcze model pozytywnej regulacji ekspresji genów, co z kolei oznacza, że
geny znajdujące się pod taką kontrolą ulegają ekspresji dopiero pod wpływem
działania specyficznego białka regulatorowego. Przykładem tego typu regulacji może
być opisana już wcześniej aktywacja kompleksu promotor-polimeraza RNA operonu
lac przez wiąząnie się białka CAP do CBS.
Innym przykładem regulacji pozytywnej jest katabolizm maltozy u E.coli. Enzymy do
rozkładu maltozy są syntetyzowane dopiero po dodaniu maltozy do pożywki. Ich
synteza jest regulowana na poziomie transkrypcji przez białko aktywujące
(AP-activator protein). AP nie może związać się z DNA dopóki nie połączy się z
cząsteczką maltozy. Gdy AP zwiąże się z cząsteczką maltozy, kompleks taki łączy się
z DNA i umożliwia polimerazie RNA rozpoczęcie transkrypcji. Aktywator podobnie
jak represor rozpoznaje specyficzną sekwencję DNA tzw. miejsce wiązania
aktywatora. Geny potrzebne do katabolizmu maltozy znajdują się w kilku operonach
wobec czego aktywator kontroluje więcej niż jeden operon. Grupa operonów
regulowanych przez jedno białko aktywujące nazywana jest regulonem.
Atenuacja
Atenuacja jest typem regulacji opartym na fakcie, że w organizmach
prokariotycznych transkrypcja i translacja są procesami wzajemnie połączonymi.
Atenuacja została zaobserwowana w niektórych operonach kontrolujących
biosyntezę aminokwasów.
Najlepiej zbadanym przykładem jest atenuacja w operonie tryptofanowym. Poza
6 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
wspomnianymi już wcześniej genami i strukturami znajdującymi się w tym operonie,
operon ten zawiera tzw. sekwencję liderową w obrębie której znajduje się region
atenuatora kodujący polipeptyd zawierający przy końcu kodony tryptofanu. Jeżeli w
komórce znajduje się dużo tryptofanu peptyd liderowy zostanie zsyntetyzowany.
Natomiast przy braku tryptofanu nie powstanie peptyd liderowy. Jakie są tego
rezultaty?
Synteza peptydu liderowego prowadzi do zahamowania transkrypcji genów
tryptofanowych. W jaki sposób?
Proces ten jest możliwy ze względu na fakt, że transkrypcja i translacja w komórkach
bakterii zachodzi praktycznie jednocześnie. Sekwencja liderowa jako pierwsza ulega
transkrypcji i gdy następnie transkrypcja idzie dalej, mRNA sekwencji liderowej ulega
już translacji. Jednakże w przypadku mRNA sekwencji liderowej, gdy jest już
uwolnione z DNA i połączy się z rybosomem ulega ono sfałdowaniu w podwójną
pętlę, która sygnalizuje zatrzymanie transkrypcji dalszych genów (tryptofanowych).
Jeśli nie ma tryptofanu to nie dojdzie do translacji całej sekwencji liderowej gdyż
zostanie ona zatrzymana na kodonie tryptofanowym, co powoduje przyjęcie innej
konformacji przez mRNA sekwencji liderowej. Ta konformacja nie blokuje
polimerazy RNA, która przechodzi dalej do transkrypcji genów tryptofanowych.
Mechanizmy represji i atenuacji operonu tryptofannowego w precyzyjny sposób
kontrolują syntezę enzymów szlaku biosyntezy tryptofanu.
Podobne modele atenuacji odkryto w innych szlakach metabolicznych bekterii np. w
biosyntezie histydyny czy fenyloalaniny.
Antysensowne RNA
Większość systemów kontrolujących czy to transkrypcję czy translację wykorzystuje
białka jako cząsteczki regulatorowe. Jednak niekiedy zdarza się, że w regulację
zostanie zaangażowane RNA.
Jednym z rodzajów regulatorowego RNA jest RNA antysensowne używane w
kontroli różnych genów bakteryjnych. Antysensowne RNA oddziałuje jako regulator
poprzez parowanie z komplementarną, sensowną nicią RNA. Jeżeli tą
komplementarną nicią jest mRNA, to parowanie z antysensownym RNA może
zapobiec zajściu translacji.
Antysensowne RNA może być syntetyzowane z tego samego genu co mRNA przez
zastosowanie drugiego promotora zorientowanego w przeciwnym kierunku do
pierwszego lub poprzez drugi gen z promotorem na przeciwnym końcu.
PLAZMIDY
Plazmidy są to elementy genetyczne zdolne do autonomicznego powielania się i
istnienia pozachromosomalnego. Większość plazmidów ma koliste, superzwinięte
dsDNA, a niektóre liniowe dsDNA. Wiele plazmidów może być przenoszonych w
procesie koniugacji z jednej do drugiej komórki. Niektóre plazmidy mają zdolność do
wintegrowywania się w chromosom bakteryjny i wtedy ich replikacja podlega
kontroli bakterii.
7 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
Jednym z najlepiej poznanych plazmidów jest plazmid F z E.coli. Jest tp plazmid typu
koniugacyjnego i może być transferowany z komórki donora do akceptora nawet z
fragmentami chromosomalnego DNA donora. Plazmid F jest kolistą cząsteczką
(dł.100bp) i zawiera różne geny niezbędne do procesu replikacji i transferu , a
ponadto sekwencje, które pozwalają na rekombinację z chromosomem bakteryjnym
w celu utworzenia Hfr. Plazmidy zdolne do integracji w chromosom gospodarza
nazywane są episomami.
Większość plazmidów w bakteriach gramujemnych przechodzi replikację
dwukierunkową według modelu theta z zastosowaniem enzymów komórkowych.
Natomiast plazmidy bakterii gramdodatnich w większości replikują według modelu
obracającego się koła. Plazmidy, które posiadają materiał genetyczny w formie
liniowej replikują w sposób podobny do adenowirusów. FIG 6.47
Pomimo, że plazmidy są niezależnie replikującymi elementami genetycznymi, ilość
ich cząsteczek w komórce jest do pewnego stopnia określona przez daną komórkę a
ponadto przez warunki zewnętrzne.
Plazmidy są w biologii molekularnej bardzo istotnym narzędziem służącym do
badania różnorodnych procesów genetycznych czy ekologii i życia bakterii. Ponadto
stosowane są w biotechnologii.
Obecność plazmidów w komórce może mieć znaczny wpływ na jej fenotyp np. u
Rhizobium to plazmidy umożliwiają współdziałanie z roślinami.
Ze względu na zróżnicowanie wielkości plazmidów oraz posiadanych przez nie genów
na:
produkcję toksyn
uodpornienie komórki gospodarza na antybiotyki i inne substancje
katabolizm nietypowych substrató np. pestycydów
kontrolę procesu koniugacji
i wiele innych, nie jest łatwo sklasyfikować plazmidy według jakiejś
charakterystycznej cechy.
Jednak dokonuje się podziału na pewne grupy.
Plazmidy koniugacyjne
Plazmidy te mają zdolność do przenoszenia się z komórki donora do akceptora w
procesie koniugacji. Za ten proces odpowiedzialne są geny w regionie tra znajdujące
się w plazmidach. Geny te związane są między innymi z syntezą pili np. F i I
Pili typu F biorą udział w transferze plazmidu F oraz niektórych plazmidów z
odpornością na antybiotyki. Pili typu I są zaangażowane w przenoszenie plazmidów z
opornością na antybiotyki i innymi właściwościami.
Plazmidy opornościowe (R - resistance)
8 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
Plazmidy te nadają komórce oporność na antybiotyki i inne inhibitory wzrostu.
Plazmidy R mogą posiadać różnorodne geny oporności na antybiotyki. Geny te
kodują zazwyczaj białka które inaktywują antybiotyk albo wpływają na pobranie
antybiotyku przez komórkę.
Plazmid R100 niesie oporność na sulfonamidy, streptomycynę, tetracyklinę,
chloramfenikol i inne. Plazmid ten może być przenoszony pomiędzy bakteriami z
Enterobakteriaceae: Escherichia, Klebsiella czy Salmonella.
Poza tym znane są plazmidy z opornością na kanamycynę, penicylinę czy
neomycynę. Ponadto plazmidy typu R posiadają geny, które hamują wprowadzanie
plazmidu tego samego typu do komórki, plazmid dodatkowy zostaje zgubiony w
procesie replikacji, co nie przeszkadza współistnieć w jednej komórce plazmidom z
dwóch różnych grup.
Możliwa jest rekombinacja genetyczna pomiędzy dwoma R co może prowadzić do
powstania organizmów opornych na wiele leków. Plazmidy R są odpowiedzialne za
uzyskiwanie przez bakterie chorobotwórcze oporności na leki (antybiotyki).
Komórki bakteryjne mogą wymieniać między sobą materiał genetyczny w trzech
procesach, które zachodzą naturalnie: koniugacja, transdukcja i transformacja.
mechanizmy przekazywania materiału genetycznego nie są związane z procesem
reprodukcji komórki bakteryjnej, zachodzą one w konkretnych warunkach i polegają
na przekazaniu niewielkiej części materiału genetycznego z komórki dawcy do biorcy.
REKOMBINACJA DNA U BAKTERII
Proces rekombinacji jest to przeprowadzanie wymiany pomiędzy
homologicznymi odcinkami DNA. Jest to podstawowy mechanizm wymiany
genów pomiędzy chromosomami w żywych organizmach. Powoduje on
zwiększenie różnorodności genetycznej, a ponadto w sytuacjach ekstremalnych
przy dużym zniszczeniu DNA umożliwia przeżycie organizmu.
W trakcie rekombinacji u bakterii uczestniczy specyficzne białko RecA. Białko to ma
zdolność do niespecyficznego (czyli niezależnego od sekwencji) wiązania się z
jednoniciowym DNA. Następnie kompleks białko- DNA atakuje losowo drugą
cząsteczkę DNA, powodując rozplecenia nici. Jeżeli natrafi na sekwencję
komplementarną to zapoczątkowuje powstanie DNA rekombinowanego z nici
atakującej i atakowanej. Powstaje przejściowa struktura krzyżowa (rysunek). Po
czym struktura ta zostaje pocięta przez endonukleazy i powstają dwie
zrekombinowane cząsteczki DNA.
W organizmach bakteryjnych rekombinacja zachodzi na trzy sposoby:
koniugacja
transformacja
transdukcja
Koniugacja
9 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
Koniugacja u bakterii jest to proces transferu genetycznego zachodzący podczas
kontaktu dwóch komórek. Przenoszonym materiałem genetycznym może być plazmid
lub fragment chromosomu, który jest transferowany dzięki plazmidowi. W koniugacji
jedna z komórek tzw. donor przekazuje informację genetyczną komórce biorcy.
Komórka dawcy posiada specyficzną strukturę powierzchniową tzw. pilus płciowy,
który pozwala na kontakt pomiędzy komórkami. Natomiast komórka biorcy posiada
na swej powierzchni specyficzne receptory dla pilusa płciowego. Znane są dwa typy
dawców:
F+ plazmid w tej komórce funkcjonuje jak typowy plazmid i tylko on jest
przenoszony w procesie koniugacji
Hfr plazmid jest wintegrowany w chromosom dawcy i umożliwia on
przekazanie DNA chromosomalnego podczas koniugacji.
Gdy komórki koniugujące już się ze sobą zetkną, zostaje zainicjowana synteza DNA i
zachodzi przejście pojedynczej nici DNA z jednej do drugiej komórki. Synteza DNA
w obu komórkach prowadzi do zachowania dwuniciowej natury DNA i zapewnia
zachowanie pełnej informacji genetycznej w komórce dawcy. Przekazanie materiału
genetycznego zachodzi sekwencyjnie zaczynając od określonego miejsca w
chromosomie dawcy.
Transfer DNA z F+ do F-
Podczas koniugacji musi zajść synteza DNA. Odbywa się to według modelu
obracającego się koła. Koliste DNA plazmidowe zostaje nacięte i jedna nić
rodzicielska jest przekazywana do komórki biorcy.
Gdy komórki koniugujące już się ze sobą zetkną, zostaje zainicjowana synteza DNA i
zachodzi przejście pojedynczej nici DNA z jednej do drugiej komórki. Synteza DNA
w obu komórkach prowadzi do zachowania dwuniciowej natury DNA i zapewnia
zachowanie pełnej informacji genetycznej w komórce dawcy. Przekazanie materiału
genetycznego zachodzi sekwencyjnie, w konkretnym miejscu na chromosomie
dawcy.
Koniugacja pomiędzy komórkami typu F+ i F-, zachodzi podobnie do modelu
replikacji obracającego się koła. Gdy dojdzie do kontaktu pomiędzy dwiema
komórkami, zostaje nacięte DNA plazmidowe i jedna nić jest przekazywana do
komórki biorcy. Synteza DNA według modelu obracającego się koła odbudowuje
drugą nić DNA u dawcy. Podobnie komplementarna nić jest tworzona u biorcy.
Obecność plazmidu F w komórce powoduje różne zmiany:
komórka ma zdolność do syntezy pilii płciowych
istnieje możliwość przeniesienia fragmentów DNA do innej komórki
zmiana receptorów komórkowych uniemożliwiająca pobieranie kolejnych
plazmidów
Plazmid może być wintegrowany w chromosom w konkretnych miejscach, które
charakteryzują się homologią DNA komórkowego do plazmidowego. Po
wintegrowaniu plazmidu mamy do czynienia z komórką typu Hfr (high frequency of
recombination), która nie może w koniugacji przekształcić komórki F- w F+ lub Hfr,
10 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
ponieważ bardzo rzadko zachodzi w takich sytuacjach transfer całego plazmidu.
Szczegółowe wyjaśnienie procesu na rysunkach
W procesie koniugacji przerywanej przeprowadzanym doświadczalnie możliwe jest
zmapowanie ułożenia genów na chromosomie.
Transdukcja
W procesie transdukcji DNA między bakteriami jest przekazywane przy udziale
bakteriofagów. Wyróżniamy dwa typy transdukcji: ogólną i ograniczoną.
Transdukcja ogólna polega na przeniesieniu przez faga dowolnych genów
zlokalizowanych w przypadkowym miejscu w genomie bakterii do komórki biorcy, z
niską efektywnością.
Transdukcja ograniczona występuje tylko w przypadku fagów łagodnych i polega na
tym, że fag wintegrowuje się w specyficzne miejsce w genomie bakterii, następnie
jako profag jest replikowany wraz z genomem komórki gospodarza. Potem zachodzi
proces uwolnienia profaga, który może być na tyle nieprecyzyjny, że spowoduje
wycięcie profaga wraz z pobliskim fragmentem chromosomu. Kolejnym etapem jest
liza komórki i uwolnienie cząsteczek fagowych z konkretnymi fragmentami
chromosomów. FIG 7 16 7 17
Transformacja
Transformacja jest to proces pobierania przez komórki bakteryjne wolnego DNA z
podłoża lub uwolnionego przez inne bakterie. Niektóre komórki mają naturalną
zdolność do przeprowadzania tego procesu dzięki specyficznym systemom w błonie,
ułatwiającym pobranie DNA. Są to tzw. bakterie kompetentne. W inżynierii
genetycznej stosuje się różne metody umożliwiające również innym bakteriom
przeprowadzenie transformacji. Podczas pojedynczej transformacji może dojść do
pobrania niewielkiej ilości DNA, która jednak wydatnie rośnie przy zastosowaniu
bakterii kompetentnych.
WIRUSY
Wirus jest to element genetyczny nie posiadający organizacji komórkowej. Może on
istnieć pozakomórkowo, jednak wtedy nie zachodzą w nim żadne przemiany
metaboliczne. Pozakomórkowa forma wirusa, wirion, jest cząsteczką zawierającą
kwas nukleinowy, otoczoną przez białka i niekiedy posiadającą pewne inne
komponenty makrocząsteczkowe.
Replikacja wirusa odbywa się dopiero po wprowadzeniu jego materiału genetycznego
do komórki. Gdy wirus znajdzie się w komórce rozpoczyna się jego reprodukcja.
Proces ten związany jest z infekowaniem komórki gospodarza.
W związku z małą wielkością wirus zawiera jedynie bardzo podstawowe informacje
dotyczące jego genomu, regulacji reprodukcji oraz budowy otoczki białkowej. Wobec
tego podczas procesu reprodukcji jest on w dużym stopniu zależny od metabolicznych
11 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
i strukturalnych cech gospodarza, dostosowując je w pewnym stopniu do swoich
potrzeb.
Wirus zdolny jest do wprowadzania dziedzicznych zmian w genomie gospodarza.
Zmiany te mogą mieć charakter korzystny lub destruktywny dla gospordarza.
Wirusy można sklasyfikować w oparciu o organizację posiadanego przez nie
materiału genetycznego. Materiał genetyczny wirusów może występować w kilku
formach: DNA jedno- lub dwuniciowe, RNA jedno- lub dwuniciowe oraz zarówno
DNA jak i RNA lecz na różnym etapie istnienia wirionu.
Poza tym dokonuje się podziału na grupy w zależności od rodzaju infekowanego
gospodarza: wirusy roślinne, zwierzęce i bakteryjne.
WIRIONY
Wiriony cechuje zarówno różnorodność kształtu jak i wielkości. Są one znacznie
mniejsze niż komórki (około 28 - 200 nm) a ponadto mają dużo mniejsze genomy (
największe około 200kbp).
Kwas nukleinowy znajduje się wewnątrz cząsteczki wirionu i otoczony jest przez
białkowy "płaszcz" zwany kapsydem, precyzyjnie uformowany z kilku podjednostek
białkowych tzw. kapsomerów. Informacja dotycząca formy kapsydu zawarta jest w
strukturze kapsomerów, a tworzenie otoczki zachodzi na zasadzie samoskładania,
często z udziałem chaperonów.
Kompleks otoczki z kwasem nukleinowym zwany nukleokapsydem, często jest
dodatkowo otoczony dwuwarstwową błoną lipidową zawierającą glikoproteiny
pochodzenia wirusowego oraz lipidy pochodzące z błony komórki gospodarza. Błona
wirusa jest pierwszym elementem wchodzącym w interakcje z komórką gospodarza i
jej pochodzenie wpływa na sposób infekcji oraz penetracji wirusa wewnątrz komórki.
Wewnątrz wirionu mogą znajdować się specyficzne enzymy odgrywające pewną rolę
w procesie infekowania komórki gospodarza. Wiele wirusów zawiera własne
polimerazy, natomiast retrowirusy posiadają odwrotne transkryptazy. Ponadto w
wirusach występują neuroaminidazy, które rozrywając wiązania glikozydowe
glikoprotein i glikolipidów ułatwiają wirusom penetrację tkanek zwierzęcych oraz
lizozym, który umożliwia wniknięcie wirusów bakteryjnych do komórki oraz
powoduje jej lizę.
Wirusy posiadają pewną symetrię budowy. Symetria wirusów odnosi się do
nukleokapsydu a nie do całego wirusa z błoną.
Wyróżniamy dwa podstawowe typy symetrii:
helikoidalna, gdy podjednostki białkowe są ułożone w heliks, którego długość
zależy od długości kwasu nukleinowego a szerokość od wielkości i upakowania
podjednostek. Przykładem jest tu wirus RNA mozaiki tytoniowej TMV
izometryczna (bryłowa) gdy mamy do czynienia z ikosaedrami czyli
12 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
dwudziestościanami
ZASADY REPRODUKCJI WIRUSA
Podstawowym problemem jaki wirus napotyka na swej drodze w namnażaniu jest
wzbudzenie komórki gospodarza do produkcji elementów niezbędnych do
wytworzenia następnych cząsteczek wirusa.
Pierwszym etapem w tym procesie jest przyłączenie się lub też adsorpcja wirionu na
podatnej komórce gospodarza. Następnie zachodzi penetracja, która polega na
iniekcji wirionu lub jego kwasu nukleinowego do wnętrza komórki.
Początkowa faza replikacji polega na przystosowaniu maszynerii biosyntetycznej
komórki gospodarza do syntezy kwasu nukleinowego wirusa. Produkowane są
enzymy wirusowe.
Kolejnym etapem jest replikacja kwasu nukleinowego wirusa, a następnie synteza
podjednostek białkowych otoczki i ich składanie oraz upakowanie kwasu
nukleinowego w nowe cząsteczki wirusa i uwolnienie ich z komórki.
W genomie wirusa kodowane są niektóre enzymy niezbędne do jego replikacji jednak
reszta czyli: systemy zapewniające energię, rybosomy, tRNA (z pewnymi wyjątkami)
oraz enzymy aktywujące aminokwasy są dostarczane przez komórkę gospodarza.
FIG 6-9 p 194.
(Powyżej opisany proces dotyczy wirusów bakteryjnych).
PRZYA

CZENIE
Pierwszy etap replikacji wirusa charakteryzuje się dużą specyficznością interakcji
pomiędzy wirusem a gospodarzem. Cząsteczka wirusa posiada na swojej powierzchni
białka, które oddziałują ze specyficznymi elementami powierzchniowymi na komórce
zwanymi receptorami. Zwykle pełnią one w komórce normalne funkcje np. białka
transportowe czy białka otoczki bakteryjnej lub w przypadku grypy jest to
glikoproteina na erytrocytach.
Jeśli receptor nie występuje lub jest zmieniony, wirus nie może adsorbować i infekcja
nie zajdzie - gospodarz staje się odporny na wirusa, oczywiście dopóki w wirusie nie
zajdzie mutacja umożliwiająca mu adsorpcję do zmutowanego receptora.
Przyłączanie się wirusa może zachodzić również na niespecyficznej drodze poprzez
fagocytozę lub inne procesy endocytozy (powszechne wśród wirusów zwierzęcych i
roślinnych).
PENETRACJA
Proces penetracji wirusa do wewnątrz komórki gospodarza zależny jest od charakteru
tej komórki, szczególnie od jej struktur powierzchniowych w wyniku czego penetracja
zachodzi inaczej w komórkach zwierzęcych pozbawionych ściany komórkowej niż w
roślinnych i bakteryjnych.
13 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
Przykładem skomplikowanego mechanizmu penetracji jest infekcja komórki E.coli
bakteriofagiem T4 (FIG 6.11) Wirion T4 posiada strukturę głowową, osadzoną na
ogonku, który kończy się zestawem włókien ogonowych. Włókna te jako pierwsze
przyłączają się do powierzchni komórki a następnie obkurczają co powoduje zbliżenie
się rdzenia ogonka do powierzchni komórki. Enzym wirusowy o charakterze lizozymu
powoduje powstanie niewielkiego otworu w ścianie komórkowej, przez który wnika
DNA wirusowe.
Na tym etapie istnieje jeszcze możliwość usunięcia kwasu nukleinowego wirusa
poprzez działanie enzymów restrykcyjnych znajdujących się na terenie komórki.
Jednakże wirusy "nauczyły się" przeciwdziałać temu procesowi; modyfikując kwasy
nukleinowe w podobny sposób jak komórki gospodarza lub hamując działanie
systemów restrykcyjnych przez specyficzne białka.
WIRUSOWE mRNA
W celu powstania nowych białek wirusowych muszą zostać utworzone specyficzne
mRNA. Synteza mRNA wirusowego zależy od typu wirusa i jego materiału
genetycznego. FIG6.12 p196.
W przypadku gdy informację genetyczną wirusa stanowi RNA możliwe jest kilka
rozwiązań dla produkcji mRNA. Gdy mamy do czynienia z wirusem zawierającym
jednoniciowe RNA pozytywne (+), oznacza to, że służy ono bezpośrednio jako
mRNA. W tym RNA kodowana jest między innymi polimeraza RNA specyficzna dla
wirusa. Polimeraza ta początkowo powoduje powstanie negatywnej nici
komplementarnej, która następnie służy jako matryca do wytworzania większej ilości
nici pozytywnych.
Jeśli natomiast wyjściowym materiałem genetycznym jest jednoniciowe RNA
negatywne (-) lub dwuniciowe RNA sytuacja się nieco komplikuje, gdyż nie może
ono pełnić bezpośrednio funkcji mRNA. Aby powstało mRNA konieczna jest
RNA-zależna polimeraza RNA, która występuje w wirusach i prowadzi do syntezy
mRNA.
Retrowirusy (wirusy RNA) replikują się dzięki pośrednictwu DNA. Proces
kopiowania informacji genetycznej z RNA na DNA jest to odwrotna transkrypcja i
zachodzi on pod wpływem enzymu tzw. odwrotnej transkryptazy. Po zainfekowaniu
komórki, RNA wirionu kopiowane jest na dwuniciowe DNA (dsDNA) z przejściem
przez etap ssDNA. Następnie dsDNA służy jako matryca do syntezy mRNA.
BIAA
KA WIRUSOWE
Gdy mamy już mRNA możliwa jest synteza białek wirusowych. Białka te należą do
trzech głównych grup:
wczesne białka o charakterze enzymatycznym, niezbędne do replikacji kwasu
nukleinowego wirusa, syntetyzowane w niewielkich ilościach
póz
ne białka czyli m.in. białka płaszcza wirusowego, białka strukturalne,
14 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
syntetyzowane w dużych ilościach
białka lityczne, które umożliwiają otworzenie komórki gospodarza i uwolnienie
cząsteczek wirusa.
WIRUSY BAKTERYJNE
Istnieje ogromna liczba wirusów bakteryjnych, wiele z nich ma skomplikowaną
strukturę, tylko niektóre posiadają lipidową otoczkę. Większość badanych wirusów
atakuje E.coli lub Salmonella typhimurium.
Bakteriofagi RNA
Najlepiej poznane bakteriofagi RN-owe zawierają jednoniciowe RNA. U
Enterobacteriaceae bakteriofagi infekują tylko komórki odgrywające rolę donorów w
procesie rekombinacji genetycznej co związane jest z występowaniem na tych
komórkach specyficznech pili, będących jednocześnie receptorami dla cząsteczek
tych wirusów.
Bakteriofagi te, są niewielkie (ok. 26 nm) i mają symetrię ikosaedralną. Niektóre
genomy tych bakteriofagów zostały już poznane np. MS2 ma genom o długości 3569
nukleotydów, nić RNA (+), która działa bezpośrednio jako mRNA. W komórce
gospodarza mRNA wchodzi do rybosomu i produkowane są cztery typy białek;
dojrzałości, odpowiedzialne za lizę, strukturalne do budowy płaszcza oraz replikaza
RNA (kombinacja polipeptydów wirusa i gospodarza). Ciekawostką jest, że gen
białka odpowiedzialnego za lizę komórki gospodarza nachodzi zarówno na gen białka
płaszczowego jak i na gen replikazy, co w rezultacie powoduje, że rozpoczęcie
translacji tego genu jest niemożliwe dopóki nie powstanie odpowiednia ilość białka
płaszczowego.
Ikosaedralne bakteriofagi ssDNA
Bakteriofagi ssDNA mają genom w formie zamkniętego koła o średnicy ok. 25 nm,
płaszcz zbudowany z pojedynczego białka w 60 kopiach, do którego dołączone są
inne białka tworzące strukturę szpikulcopodobną.
Bakteriofagi te, w przeciwieństwie do poprzednich, podczas replikacji korzystają
głównie z maszynerii komórkowej i posiadają we własnym genomie jedynie
podstawowe informacje dotyczące białek kapsydowych, szpikulcowych czy
powodujących lizę komórki bakteryjnej.
Najpowszechniej badany wirus z tej grupy to f X174, atakujący E.coli, w którym po
raz pierwszy odkryto geny nachodzące na siebie (ang. overlapping genes). Geny te
stanowią rozwiązanie problemu małej ilości DNA kodującego, pozwalając na bardziej
efektywne wykorzystanie informacji genetycznej, ale jednocześnie stwarzają
niebezpieczeństwo, że jedna mutacja może wpłynąć na dwa geny.
FIG 6.17
Replikacja tego wirusa zachodzi według modelu obracającego się koła (rolling circle
15 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
replication). Najpierw jednak dochodzi do powstania RF, czyli replikacyjnej formy
DNA. Jest to superzwinięte dsDNA, które powstaje wskutek działania komórkowych
enzymów na ssDNA wirusa.
Następne RF tworzone są w konwencjonalny sposób poprzez semikonserwatywną
replikację z pośrednimi formami theta, ale utworzenie genomu ssDNA zachodzi
według wspomnianego wyżej modelu. FIG 6-18.
Jedna nić zostaje przerwana i koniec 3' używany jest do rozpoczęcia syntezy nowej
nici. Synteza ta jest asymetryczna ponieważ tylko jedna z nici jest matrycą. Gdy
zostanie osiągnięta odpowiednia długość odpowiedni enzym przecina i łączy dwa
końce nowej nici.
Bakteriofagi dsDNA
Wiele wirusów zawiera materiał genetyczny w postaci podwójnej nici DNA (dsDNA).
Były to pierwsze odkryte wirusy bakteryjne i są one bardzo intensywnie badane.
Bakteriofag T7 jest wirusem atakującym E.coli, posiada ikosaedralną główkę i mały
ogonek. Jego genom został zsekwencjonowany i zbadany. Okazało się, że część
genów nachodzi na siebie i ich kolejność wpływa na regulację powielania wirusa.
DNA wirusowe wchodzi liniowo do komórki gospodarza, zaczynając od lewego
końca i następuje natychmiastowa transkrypcja kilku genów na tym końcu dzięki
komórkowej RNA polimerazie.
Powstają nachodzące na siebie policystroniczne mRNA, które zostają przecięte przez
komórkową Rnazę, dając mniejsze mRNA kodujące: białka hamujące system
restrykcyjny gospodarza oraz wirusową RNA polimerazę, a także białka hamujące
RNA polimerazę komórki gospodarza.
Gdy zostaje zahamowana polimeraza komórki bakteryjnej (kontrola negatywna),
zakończona jest transkrypcja wczesnych genów T7. Natomiast fagowa polimeraza
rozpoznaje tylko pozostałe promotory na genomie T7 prowadząc do syntezy reszty
białek faga.
Replikacja DNA zaczyna się w ori skąd odbywa się w obu kierunkach jednocześnie,
przy zastosowaniu dwóch typów primerów RNA ; w lewo primer syntetyzowany
przez primazę T7, w prawo syntetyzowany przez T7 RNA polimerazę. Oba primery
podlegają wydłużaniu przez fagową polimerazę DNA. FIG6.21
Wirus T7 posiada pewną cechę strukturalną tzw. dtr (direct terminal repeat o długości
ok.160bp, na 5' końcach cząsteczki) przydatną podczas replikacji. W celu
zakończenia replikacji na 5' końcu DNA primery RNA muszą zostać usunięte. Na obu
końcach DNA faga T7 zostają pewne fragmenty, które nie uległy replikacji. T7
"rozwiązuje" ten problem przy użyciu wspominanych już sekwencji dtr. Na obu
niciach 3' DNA znajdują się sekwencje komplementarne do dtr i łączą się z nimi
tworząc cząsteczkę o podwojonej długości w porównaniu do normalnego T7.
Niezreplikowane do tej pory fragmenty DNA zostają uzupełnione dzięki działaniu
polimerazy i ligazy DNA co prowadzi do utworzenia tzw. konkatameru. Konkatamer
zostaje pocięty na cząsteczki o długości odpowiadającej wirusowi T7 przez specjalny
enzym.
16 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
Duże bakteriofagi dsDNA
Największe i najbardziej skomplikowane fagi zarówno pod względem struktury jak i
replikacji należą do tzw. grupy fagów T-parzystych.
Przykładowym fagiem z tej grupy jest T4, mający ikosaedralną główkę wydłużoną
przez dodatkowe białka oraz zróżnicowany strukturalnie ogonek. W genomie T4
znajduje się nietypowy nukleotyd 5-hydroksymetylocytozyna (dodatkowo
glukozylowany) zamiast cytozyny, który powoduje że dane DNA jest odporne na
restrykcyjne endonukleazy bakteryjne. DNA T4 występuje w formie liniowej jednak
jego mapa genetyczna przedstawiana jest w formie kołowej.
Proces replikacji DNA T4 jest podobny do T7 jednakże enzym tnący DNA na
jednakowe fragmenty liniowe nie jest specyficzny do sekwencji co powoduje
powstawanie zróżnicowanych końcow cząsteczki i nieco dłuższych genomów
wirusowych.
Geny fagaT4 kodują dwie podstawowe grupy białek; wczesne, czyli enzymy
zaangażowane w proces replikacji i transkrypcji, oraz póz
ne czyli białka strukturalne
główki i ogonka, a także enzymy uwalniające faga z komórki. Fag T4 korzysta w
trakcie syntezy z polimerazy RNA występującej w komórce bakteryjnej. Formowanie
główki i ogonka zachodzi niezależnie, DNA zostaje upakowane w główce nastepnie
przyłącza się ogonek i fag gotowy jest do opuszczenia komórki. Liza ściany
komórkowej bakterii zachodzi pod wpływem lizozymu, który atakuje peptydoglikany
komórkowe. Cały proces może trwać około 25 minut.fig6.24
Wirusy łagodne
Większość wirusów bakteryjnych przechodzi cykl lityczny prowadzący do zabicia
komórki bakteryjnej. Jednakże jest wiele wirusów, które pomimo możliwości zabicia
komórki wybierają drogę lizogeniczną czyli łagodną kiedy to większość genów faga
nie ulega ekspresjii a genom fagowy wbudowany do bakteryjnego ulega
synchronicznej replikacji i wraz z podziałami komórkowymi jest przekazywany
następnym pokoleniom bakterii. FIG 6.25 koniecznie Bakteria zainfekowana wirusem
w łagodnej postaci jest odporna na następne ataki nowych cząsteczek tego wirusa.
Wirusy łagodne istnieją w komórkach zazwyczaj w formie zwanej prowirusem.
Prowirus posiada taką samą informację genetyczną jak wirus. Jednak jest ona
zablokowana przez specjalny fagowy represor i nie ulega ekspresji. Ta sytuacja może
ulec zmianie pod wpływem specyficznych czynników (np.UV, promieniowanieX)
powodujących inaktywację represora - indukcja lizogeniczna.
Wirus łagodny może istnieć w dwóch formach zależnych od warunków. Czasem jako
niezależna jednostka, kontrolująca swoją replikację (cykl lityczny), lub jako DNA
wintegrowane w materiał genetyczny komórki gospodarza (cykl łagodny -
lizogeniczny).
Najlepiej poznanym wirusem łagodnym jest lambda atakująca E.coli, zawiera on
dsDNA w formie liniowej z 12-nukleotydowymi jednoniciowymi, komplementarnymi
ogonami na 5' końcach, które łączą sie formując dwuniciową kolistą cząsteczkę.
Genom faga lambda zawiera dwa zestawy genów; jeden - kontrolujący cykl lityczny,
drugi - lizogeniczny. Podczas infekcji dochodzi do zapoczątkowania ekspresji genów
obu cykli. Fag lambda zawiera kilka operonów.
17 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
Po wprowadzeniu wirusa do komórki zapoczątkowana zostaje transkrypcja jego
genów. Produktem genu cI jest białko cI będące represorem transkrypcji genów
zaangażowanych w cykl lityczny. Jeśli represor zgromadzi się w komórce zanim
ulegną ekspresji geny lityczne to zahamuje on cykl lityczny.
Powodem dla którego liza nie zawsze zostaje zahamowana jest istnienie białka Cro
będącego produktem genu cro. Kluczem do zrozumienia tego procesu jest położenie
genów kodujących te dwa białka. Te dwa geny leżą blisko siebie, są transkrybowane
w przeciwnych kierunkach a pomiędzy nimi znajdują się promotory i operatory do
których mogą się wiązać produkty obu genów. Gdy represor lambda jest związany ze
swoim operatorem, zasłania on promotor cro. Natomiast gdy białko Cro jest związane
ze swoim operatorem zasłania ono jeden z promotorów dla cI.
W cyklu lizogenicznym następuje ciągła ekspresja genu cI. Produkt czyli represor
wiąże się z dwoma operatorami na DNA i wyłącza transkrypcję reszty genów faga
lambda (kontrola negatywna), jednocześnie indukuje syntezę samego siebie (kontrola
pozytywna). W ten sposób represor zapewnia zahamowanie ekspresji innych genów
koniecznych do wzrostu i reprodukcji faga.
W komórce lizogenicznej powielenie faga może zajść tylko w przypadku inaktywacji
represora, co jest możliwe przy zastosowaniu czynników niszczących DNA. Jednym z
rezultatów działania takich czynników jest zmiana białka RecA ( w normalnych
warunkach biorącego udział w rekombinacji genetycznej) w specyficzną proteazę,
która bierze udział w zniszczeniu represora. W momencie gdy represor jest
zdezaktywowany, może już zachodzić transkrypcja pozostałych genów faga lambda
do tej pory zablokowanych, co w rezultacie prowadzi do lizy komórki.
FIG 6.25, 27
DNA faga lambda integruje w chromosom gospodarza w postaci kolistej w
specyficznym miejscu na chromosomie tzw.att (bacterial attachment sites) dzięki
enzymowi integrazie (kodowanym przez fagowy gen int).
Podczas wzrostu komórki system represji faga lambda uniemożliwia zajście lizy
komórki, natomiast w trakcie replikacji DNA gospodarza zachodzi równoczesna
replikacja DNA faga i w komórce potomnej dochodzi do uruchomienia cyklu
produktywnego.
Fag lambda używany jest jako wektor w inżynierii genetycznej, do konstruowania
hybryd DNA z enzymami restrykcyjnymi. Fag lambda zawiera długi region DNA,
który dzięki temu, że nie pełnie żadnych istotnych funkcji w replikacji może być
zastępowany obcym DNA.
Bakteriofag Mu
Bakteriofag Mu jest jednym z bardziej interesujących fagów ze względu na jego
możliwość replikacji jako ruchomego elementu genetycznego. Mu jest wyjątkowo
mutagenny, ponieważ może integrować w środku genu komórki gospodarza
inaktywując go, ponadto ma zdolność do przemieszczania się w genomie.
WIRUSY ZWIERZ
CE
18 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
Wirusy zwierzęce posiadają materiał geneyczny zarówno w formie RNA jak i DNA.
Jedną z ważniejszych grup wirusów zwierzęcych są retrowirusy, gdyż powodują one
choroby bardzo groz
ne dla człowieka (AIDS). Wirusy dzieli się na różne grupy w
zależności od typu kwasu nukleinowego, obecności otoczki i niekiedy według
stosowanego modelu replikacyjnego.
FIG6.35
Wirusowa infekcja komórki zwierzęcej może mieć rożne efekty. Wirus może
spowodować rozpadnięcie się komórki, trwałą infekcję z powolnym uwalnianiem
cząsteczek wirusa lub infekcję utajoną kiedy to symptomy pojawiają się ze znacznym
opóz
nieniem w stosunku do czasu infekcji. Ponadto wirusy mogą powodować
powstawanie nowotworów.
FIG6.36
Wirusy zwierzęce RNA (+)
Do tej grupy wirusów należą: wirus polio, hepatitis A, wirusy przeziębieniowe. W
małych wirusach RNA takich jak polio, RNA działa bezpośrednio jako pojedyncze
mRNA korzystając z translacyjnej maszynerii komórkowej produkuje pojedynczą
długą poliproteinę, która następnie zostaje pocięta na liczne małe białka niezbędne w
procesie powielania kwasu nukleinowego (polimeraza RNA) oraz powstania nowej
cząsteczki wirusa (np. białka strukturalne). Synteza białek komórkowych zostaje
zahamowana.
Wirusy zwierzęce RNA (-)
W tych wirusach RNA nie odgrywa bezpośrednio roli mRNA. Najpierw jest ono
kopiowane przez RNA-zależną polimerazę RNA pochodzenia wirusowego dzięki
czemu powstaje mRNA następnie wykorzystywane do syntezy białek wirusowych,
które prowadzą do replikacji genomu wirusowego i powstania nowych cząsteczek
wirusa. FIG6.39
Przykładem wirusa tego typu jest ludzki wirus grypy, ponadto rhabdowirusy.
Wirusy zwierzęce dsDNA
Wśród wirusów DN-owych można wyróżnić cztery główne rodziny; papovawirusy,
wirusy herpes, pox i adenowirusy. Spośród nich wszystkie poza wirusami pox
przechodzą replikację w jądrze komórkowym, natomiast pox nietypowo powiela się w
cytoplazmie.
Niektóre wirusy z grupy papovawirusów mają zdolność do indukowania
transformacji nowotworowej komórek gospodarza. Gdy wirus tego typu infekuje
komórkę, mogą zajść dwa typy replikacji w zależności od komórki. W komórkach
pierwszego typu infekcja wirusa polega na tworzeniu nowych wirionów i lizie
komórki gospodarza. W drugim typie komórek nie dochodzi do wielokrotnego
19 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
powielenia wirionu, lecz DNA wirusowe integruje w genomie niektórych komórek
prowadząc do genetycznej modyfikacji, która w konsekwencji może spowodować
transformację komórki i brak zahamowania jej wzrostu. Przykładem takiego wirusa
jest SV40 posiadający zdolność do indukowania nowotworów w komórkach
zwierzęcych FIG.6.44
Wirusy herpes są dużą grupą dsDNA wirusów powodujących wiele chorób u zwierząt
i człowieka (np. ospę wietrzną), mają zdolność do pozostawania w formie utajonej w
komórkach gospodarza, niektóre mogą prowadzić do transformacji nowotworowej
(np.wirus Epsteina-Barra).
Najbardziej skomplikowane i największe wirusy zwierzęce należą do grupy wirusów
pox. Unikatową wlaściwością tych wirusów jest zdolność do przeprowadzania
replikacji DNA na terenie cytoplazmy komórki gospodarza. Do tej grupy należy wirus
ospy, który jako pierwszy został szczegółowo zbadany, oraz wirus krowianki
(cowpox), który powoduje bardzo łagodną i niegroz
ną infekcję w komórkach
ludzkich. Wirus krowianki służy jako szczepionka przeciw ospie oraz jest używany w
eksperymentach genetycznych do wprowadzania obcych genów do komórek
zwierzęcych i ludzkich.
Adenowirusy zostały po raz pierwszy wyizolowane z migdałków, powodują one
łagodne infekcje dróg oddechowych i występują często w zdrowych osobnikach.
Retrowirusy
Jedną z najbardziej skomplikowanych i niewątpliwie najciekawszych grup wirusów
zwierzęcych są retrowirusy. Przyczyn, dla których znajdują się one w centrum
zainteresowania jest wiele.
Po pierwsze, to one zostały początkowo zidentyfikowane jako czynniki indukujące
powstawanie nowotworów. Po drugie, jeden z retrowirusów jest przyczyną jednej z
najgroz
niejszych i najbardziej kontrowersyjnych współcześnie chorób czyli AIDS.
Ponadto mogą one specyficznie wintegrowywać w genom komórki gospodarza przez
pośrednicze DNA. Proces ten jest badany pod kątem wprowadzania obcych genów
do komórek w terapii genowej.
Poza tym retrowirusy posiadają enzym - odwrotną transkryptazę, która stosując RNA
jako matrycę kopiuje informacje genetyczną z RNA na DNA. Enzym ten jest
powszechnie stosowany w inżynierii genetycznej. Należy tutaj zaznaczyć, że
odwrotna transkryptaza nie jest "narzędziem" zarezerwowanym wyłącznie dla
retrowirusów - posiadają ją także retrotranspozony u Eukaryota czy E.coli.
Retrowirusy posiadają otoczkę o nieokreślonej symetrii. Genom retrowirusów ma
bardzo nietypową budowę. Składa się on z dwóch jednakowych pojedynczych nici
RNA (+) , połączonych wiązaniami wodorowymi poprzez parowanie nukleotydów ze
specyficznymi cząsteczkami tRNA. 5' koniec RNA posiada cap natomiast 3' koniec
posiada ogon poly(A) wobec czego RNA mogłoby służyć bezpośrednio jako mRNA,
jednak tak się nie dzieje.
Ogólnie proces replikacji retrowirusów zachodzi w kilku etapach. Na początku wirus
dostaje się do komórki, następnie jedna z nici RNA jest odwrotnie transkrybowana w
ssDNA które zostaje przekształcone w liniowe dsDNA przez odwrotną transkryptazę.
Kolejnym etapem jest wintegrowanie powstałego dsDNA retrowirusa w genom
20 z 21 2010-04-04 13:29
GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/gen_pro/gen_pro0.html
komórki gospodarza. Potem zachodzi transkrypcja DNA wirusowego,
powstajemRNA i "potomne" wirusowe RNA, które zostaje upakowane w kapsydzie
na terenie cytoplazmy. W końcu nowe cząsteczki wirusa są odpączkowywane z błony
cytoplazmatycznej i uwalniane z komórki. FIG 6.48.49.50.
Pierwszym etapem po wejściu wirusa do komórki jest transkrypcja RNA na DNA
przy zastosowaniu odwrotnej transkryptazy. Enzym ten wykazuje kilka rodzajów
aktywności; synteza DNA z wykorzystaniem RNA jako matrycy (odwrotna
transkryptaza), synteza DNA z wykorzystaniem DNA jako matrycy (polimeraza
DNA) oraz degradowanie nici RNA w hybrydzie RNA-DNA (rybonukleaza H). Jak
wszystkie polimerazy DNA enzym ten wymaga primeru do syntezy DNA.
W reakcji przeprowadzanej przez odwrotną transkryptazę primerem jest specyficzne
tRNA komórkowe. Rodzaj użytego tRNA jest związany z typem wirusa i pochodzi z
ostatniej komórki gospodarza. Przy użyciu danego tRNA jako primeru około 100
nukleotydów RNA z
5'końca jest odwrotnie transkrybowanych na DNA. Gdy transkrypcja dojdzie do 5'
końca, zostaje ona zatrzymana.
W celu skopiowania pozostałej większości RNA stosowany jest inny mechanizm.
Najpierw usuwane jest RNA już skopiowane przez RT (reverse transcriptase -
odwrotna transkryptaza) dzięki jej aktywności rybonukleazowej co powoduje
pozostawienie małego odcinka jednoniciowego DNA komplementarnego do 3' końca
RNA. Ten odcinek DNA jest transferowany na drugą stronę nici RNA i hybrydyzuje z
3' końcem i następnie dokończona zostaje synteza DNA(-) na matrycy RNA.
Działanie RT jako rybonukleazy prowadzi do usunięcia RNA z wyjątkiem małego
fragmentu, który zostaje użyty jako primer do syntezy pozytywnej nici DNA.
Ostatecznie zostaje utworzona dsDNA z LTR (long terminal repeats) na obu końcach.
LTR zawierają silne promotory transkrypcji i biorą udział w procesie integracji, który
może zajść w dowolnym punkcie DNA komórkowego. Wintegrowany fragment
wirusa nazywany jest prowirusem i staje się stabilnym elementem genetycznym.
Prowirusowe DNA jest transkrybowane przez komórkową RNA polimerazę w RNA
które zostaje opatrzone ogonem poly(A) i czapeczką cap, a następnie może zostać
upakowane w cząsteczki wirusa lub może ulec translacji w białka wirusowe.
WIROIDY
Wiroidy są to małe, koliste cząsteczki jednoniciowego RNA. Wiroidy są
najmniejszymi znanymi patogenami w postaci kwasu nukleinowego. Cząsteczki te
atakują rośliny wyższe. Pozakomórkowo występują one w postaci "nagiego" RNA
pozbawionego nawet kapsydu. Wiroidy nie zawierają genów kodujących białka
strukturalne i są całkowicie zależne od komórki gospodarza.
(c) 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster
This server is running Apache
21 z 21 2010-04-04 13:29