AMINOKWASY
1. Analiza jakościowa aminokwasów
Na podstawie reakcji a, b, c rozróżnić następujące związki: prolinę, metioninę, cysteinę,
tyrozynÄ™, kwas bursztynowy
a. Odróżnianie aminokwasów od innych związków
Wykonanie:
Odmierzyć do 5 probówek po 0,5 cm3 roztworów oznaczonych jako A, B, C, D, E. Do wszystkich
probówek dodać po 0,5 cm3 0.1% roztworu ninhydryny w acetonie i ogrzewać przez trzy minuty
na Å‚az
ni wodnej. Pojawia się intensywne zabarwienie fioletowe w obecności wolnego aminokwasu
lub żółte w obecności wolnego iminokwasu. Reakcja ta może być używana do ilościowego
oznaczania wolnych aminokwasów, a reakcja z tzw. kwaśną ninhydryną (roztwór ninhydryny w
mieszaninie kwasu octowego i fosforowego) do ilościowego oznaczania wolnej proliny.
Rys. 16. Wzory strukturalne A. izoleucyny i B. proliny (iminokwasu)
A B
b. Wykrywanie wolnych grup tiolowych
Zasada:
Do aminokwasów zawierających atomy siarki należy metionina, cysteina i cystyna (Rys. 17). W
celu wykrycia obecności grupy tiolowej należy do eksperymentu wziąć cysteinę lub cystynę,
bowiem metionina ma atom siarki zwiÄ…zany z grupÄ… metylowÄ….
Rys. 17. Wzory strukturalne A. metioniny, B. cysteiny i C. cystyny.
A B C
Wykonanie:
Odmierzyć do probówek po 0,5 cm3 roztworów niezidentyfikowanych w punkcie a. Do każdej
próby dodać po 1 cm3 20% roztworu NaOH oraz po 0,25 cm3 2% roztworu octanu ołowiowego.
Ogrzewać przez 3 do 5 minut we wrzącej łaz
ni wodnej. W obecności grup tiolowych tworzy się
brunatnoczarny osad.
c. Wykrywanie obecności pierścieni aromatycznych
Zasada:
Do aminokwasów zawierających pierścień aromatyczny zaliczane są: tryptofan, tyrozyna i
fenyloalanina (Rys. 18). Ten ostatni aminokwas jest na tyle niestabilny, że w poniżej
przedstawionej reakcji w roztworze wodnym pierścień aromatyczny ulega rozerwaniu. Obecność
grup -OH przy pierścieniu zwiększa natomiast jego trwałość. Z tego względu eksperyment lepiej
wykonać na tyrozynie i tryptofanie.
Rys. 18. Wzory strukturalne aminokwasów aromatycznych
Wykonanie:
Odmierzyć do probówek po 0,5 cm3 roztworów niewyeliminowanych w podpunktach a i b. Do
każdej próby dodać po 0,5 cm3 stężonego kwasu azotowego i ogrzewać przez 5 minut we wrzącej
Å‚az
ni wodnej. Po ostudzeniu dodać ostrożnie (!), małymi porcjami, i ciągle mieszając po 1,75 cm3
20% roztworu NaOH. W obecności pierścieni aromatycznych pojawia się pomarańczowe
zabarwienie.
Sprawozdanie:
Podać jakie związki były oznaczone literami A, B, C, D, E i na jakiej podstawie poszczególne
aminokwasy zostały rozróżnione.
2. Oznaczanie ilościowe aminokwasów metodą formaldehydową Sorensena
Zasada:
Formaldehyd (HCOH) kondensuje z grupą aminową aminokwasów wydzielając wodę i tworząc
grupę -N=CH2. Tym samym aminokwasy tracą właściwości amfoteryczne i można je
miareczkować wodorotlenkiem sodowym w obecności fenoloftaleiny.
COOH COOH
| |
H-C-NH2 + HCOH = H-C-N=CH2 + H2O
| |
R R
Wykonanie:
Pobrać 10 cm3 roztworu glicyny do kolby stożkowej, dodać 20 cm3 20% formaliny (pod wyciągiem) i
zmiareczkować 0,1 mol/dm3 roztworem NaOH wobec fenoloftaleiny. Oddzielnie w ten sam sposób
wykonać miareczkowanie ślepej próby (do formaliny dodać wodę destylowana zamiast roztworu
aminokwasu zachowując proporcje objętościowe oraz dwie krople fenoloftaleiny). Z różnicy ilości
zużytego NaOH wyliczyć ilość moli aminokwasu w próbce. Wynik podać w mg/cm3. Biorąc pod
uwagę, że 1 mol NaOH reaguje z 1 molem aminokwasu można wyliczyć, że 1 cm3 0,1 M roztworu
NaOH odpowiada 100 mikromolom aminokwasu.
3. Miareczkowanie aminokwasu
Wykonanie:
Do zlewki o pojemności 50 cm3 nalać 20 cm3 roztworu trzech różnych aminokwasów, np.
alaniny, kwasu glutaminowego i lizyny o stężeniu 1 mol×ðdm-3. ZlewkÄ™ ustawić na mieszadle
magnetycznym, wrzucić do środka  element mieszający , uruchomić mieszadło i umieścić w
zlewce elektrodę pH-metru w sposób uniemożliwiający jej rozbicie. Zapisać wartość pH.
Dodawać stopniowo (po 0,5 cm3) 10 cm3 1 molowego roztworu HCl. Każdorazowo, po
ustabilizowaniu się odczytu pH zapisywać jego wartość. Powtórzyć procedurę używając do
miareczkowania roztworu NaOH o stężeniu 1 mol×ðdm-3.
Rys. 19. Przykładowa krzywa miareczkowania glicyny
Sprawozdanie:
Na podstawie obydwu wyników narysować krzywą miareczkowania: na osi x wartości pH, na
osi y ilość dodanego HCl (wartości dodatnie) i NaOH (wartości ujemne). Odczytać z wykresu
wartość punktu izoelektrycznego (odczyt pH przed miareczkowaniem), oraz pKa i pKb (punkty
przegięcia krzywej). Narysować na wykresie w jakich formach jonowych występuje dany
aminokwas na poszczególnych odcinkach krzywej, oraz wyjaśnić jej charakterystyczny przebieg.
4. Chromatografia bibułowa aminokwasów
Zasada:
Informacje na temat metod chromatograficznych podano na str& ..
Wykonanie:
Przygotować cztery szalki Petri ego. Do dolnej części każdej z szalek wlać rozpuszczalnik
(mieszaninę trzeciorzędowego butanolu, 88% kwasu mrówkowego i wody w stosunku
objętościowym 15:15:70). Z bibuły wyciąć 4 krążki o średnicy trochę większej niż szalka. W
każdym krążku naciąć pasek o szerokości 5 mm dochodzący do środka krążka i zagiąć tak, by
tylko on sięgał do rozpuszczalnika w szalce, a reszta krążka była w powietrzu. W odległości 2
mm od środka krążka zakreślić ołówkiem na naciętym pasku kółeczko o średnicy 1,5 mm (Rys.
20 b). Na narysowaną kroplę nakładać powoli 1% roztwory: glicyny, fenyloalaniny, seryny i
badanego aminokwasu (na jeden krążek po jednym aminokwasie). Nanoszenie przeprowadzamy
stopniowo (tak by mokra plama nie wyszła poza zaznaczone pole) za pomocą pipety o
pojemnoÅ›ci 0,2 do 10 mðl. Po dodaniu każdej kolejnej kropli bibuÅ‚Ä™ należy przesuszyć. A
Ä…cznie
należy nanieść 20 mðl aminokwasu.
Rys. 20. Schemat chromatografii bibułowej aminokwasu
a) widok ogólny b) nakładanie aminokwasu c) sposób odczytu Rf
Krążek bibuły umieścić między dwoma częściami szalki, tak, aby koniec zgiętego paska
zanurzył się w rozpuszczalniku, a brzegi wystawały poza szalkę (Rys. 20 a). Tym paskiem
rozpuszczalnik będzie podsiąkał i stopniowo rozprowadzał aminokwas ku brzegom krążka. Po
około godzinie, gdy czoło rozpuszczalnika zbliży się do brzegu bibuły, wyjąć chromatogram i
zaznaczyć ołówkiem front rozpuszczalnika. CaÅ‚ość wysuszyć w 110°ðC i spryskać 0,1%
roztworem ninhydryny w 95% etanolu. Wysuszyć ponownie w 110°ðC i obrysować ołówkiem
barwny krążek. Obliczyć współczynnik migracji Rf dla każdego wzorcowego i badanego
A
aminokwasu wedÅ‚ug wzoru: Rf =ð (Rys. 20 c). Zidentyfikować nieznany aminokwas
B
porównując wartości Rf nieznanego aminokwasu z Rf wzorców.
5. Oznaczanie zawartości proliny
Zasada:
Prolina jest aminokwasem syntetyzowanym często w reakcji obronnej rośliny na stresy
powodujące odwodnienie cytoplazmy, przykładowo w czasie suszy czy w trakcie wzrostu
rośliny w zasolonym podłożu. Główną rolą proliny jest obniżenie potencjału osmotycznego
komórki dla wyrównania stężeń jonów pomiędzy wakuolą, gdzie są akumulowane sole, a
cytoplazmą. Ponadto, prolina chroni strukturę białek i błon cytoplazmatycznych przed ujemnymi
skutkami zbyt dużego stężenia jonów soli.
Wykonanie:
Ilościową analizę zawartości wolnej proliny wykonuje się najczęściej metodą kolorymetryczną
(Bates i in. 1973). Tkankę roślinną o masie 250 mg homogenizować w 3% kwasie
sulfosalicylowym, a następnie odwirować przy 14 000 obr./min. Do 2 cm3 supernatantu dodać 2
cm3 lodowatego kwasu octowego i 2 cm3 kwaśnej ninhydryny (1,25 g ninhydryny rozpuścić w
30 cm3 lodowatego kwasu octowego i 20 cm3 6 M kwasu ortofosforowego). Całość zmieszać na
wstrzÄ…sarce, a nastÄ™pnie inkubować przez 1 godzinÄ™ w 100ºC. Po zatrzymaniu reakcji w lodzie
do próbek dodać 4 cm3 toluenu i ponownie wytrząsać. Toluen zawierający barwnik odessać
znad fazy wodnej i po osiągnięciu temperatury pokojowej zmierzyć jego absorbancję przy
lð=520 nm wzglÄ™dem Å›lepej próby, którÄ… stanowiÅ‚ toluen. Stężenie aminokwasu obliczyć na
podstawie równania regresji liniowej dopasowanego do punktów krzywej kalibracyjnej
wykonanej dla roztworów proliny w 3% kwasie sulfosalicylowym o stężeniu: 3,62; 7,25; 12,5;
25 i 100 źg/cm3.
Piśmiennictwo:
Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D., 1973. Rapid determination of free proline for water stress
studies. Plant and Soil 39: 205-207.
BIAA
KA
Najczęściej stosowane metody oznaczania białek
Elektroforeza SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis),
Elektroforeza to przemieszczanie się obdarzonych ładunkiem cząstek (jonów) w polu
elektrycznym, np. cząsteczek białek lub kwasów nukleinowych. Większość metod
elektroforetycznych wykorzystuje specyficzne nośniki, tj. żele poliakrylamidowe lub agarozowe,
lub bibułę. Przemieszczanie się jonów w polu elektrycznym zależy od ich ładunku, wielkości i
kształtu. Im większy jon lub bardziej rozbudowany jego kształt, tym wolniej porusza się w polu
elektrycznym, a im bardziej naładowany  tym porusza się szybciej. Jony naładowane ujemnie
migrują do anody, a naładowane dodatnio  do katody. W przypadku cząstek zawierających w
swym składzie ugrupowania naładowane dodatnio i ujemnie (np. białka), o kierunku migracji
decyduje ich Å‚adunek wypadkowy.
Białka najczęściej rozdzielamy metodą elektroforezy w żelach poliakryloamidowych w
obecności SDS (dodecylosiarczan sodu), w której ich rozdział jest zależny tylko od ich
wielkości. SDS jest detergentem anionowym denaturującym i  spłaszczającym białko, w
wyniku czego łańcuch polipeptydowy a) traci struktury wyższego rzędu, b) staje się anionem.
Dodatkowo, przeprowadza się redukcję wiązań dwusiarczkowych białka i w wyniku tego jego
poszczególne łańcuchy polipeptydowe funkcjonują w roztworze niezależnie od siebie. W
efekcie, wszystkie białka (łańcuchy polipeptydowe) mają taki sam liniowy kształt oraz ładunek
ujemny, a szybkość ich migracji w żelu zależy wyłącznie od ich wielkości. Białka na ogół są
bezbarwne, w związku z tym po przeprowadzonym rozdziale żel trzeba zabarwić, aby
uwidocznić obecne w nim białka. W tym celu najczęściej stosuje się barwienie błękitem
kumasyny lub zwiÄ…zkami srebra.
SDS-PAGE wykorzystuje się także do wyznaczania masy cząsteczkowej analizowanego białka
(przez porównanie z wielkością białek wzorcowych) oraz do określania liczby jego podjednostek
polipeptydowych.
Rys. 21. Zestaw do elektroforezy żelowej
Rys. 22. Schemat nanoszenia próbek do studzienek zawierających żel oraz zasada rozdziału
białek
Rys. 23. Przykładowy żel poliakrylamidowy ujawniający obecność enzymu SOD (białe prążki).
Elektroforeza kapilarna (CE - capillary electrophoresis)
Elektroforeza kapilarna to nowa metoda analityczna, wykorzystujÄ…ca efekt elektroforezy do
separacji jonów oraz naładowanych makrocząsteczek i agregatów cząsteczek, zachodzący w
cienkiej kapilarze kwarcowej. Pomimo odmiennego mechanizmu rozdziału, wykazuje ona wiele
podobieństw do metod chromatograficznych. Istnieją różne typy sorbentów, przeznaczonych do
oczyszczania wielu różnych rodzajów próbek. Rurki zawierające sorbenty SPE przypominają
plastikowe strzykawki. Specjalne akcesoria umożliwiają jednoczesną pracę z kilkunastoma
próbkami. Metoda SPE jest prosta, szybka i tania, nie wymaga zaawansowanych umiejętności
ani stosowania skomplikowanej aparatury. W porównaniu z innymi metodami znacznie
ogranicza zużycie rozpuszczalników.
Rys. 24. Przykładowy aparat do elektroforezy kapilarnej
Rys. 25. Zasada wykrywania białek przy użyciu elektroforezy kapilarnej
Ćwiczenia
1. Wykrywanie wiązań peptydowych (reakcja biuretowa - Piotrowskiego)
Zasada:
Reakcja biuretowa polega na tworzeniu kompleksu miedzi z atomami tlenu i azotu z wiązań
peptydowych -CO-NH- o charakterystycznej fioletowej barwie. Warunkiem koniecznym
zachodzenia reakcji jest by w cząsteczce związku występowały przynajmniej dwa takie wiązania.
Stąd nazwa reakcji  biuretowa", ponieważ najprostszym związkiem spełniającym ten warunek jest
dwumocznik, czyli biuret NH2-CO-NH-CO-NH2 (produkt powstały w wyniku ogrzania mocznika).
W białkach występuje wiele wiązań peptydowych, których enolowe formy tautomeryczne HO-
C=N- dajÄ… reakcjÄ™ biuretowÄ…. Kompleks z jonem miedzi tworzÄ… dwa atomy tlenu (wiÄ…zania atomo-
we) i cztery atomy azotu (wiÄ…zania koordynacyjne).
Wykonanie:
Do trzech probówek wlać po 2 cm3 roztworu białka z jaja kurzego, kazeiny i glicyny (do każdej
probówki po jednym roztworze), a następnie do każdej z nich dodać po 2 cm3 10% NaOH i parę
kropel 0,5% CuSO4. W obecności wiązań peptydowych pojawia się fioletowa barwa.
Uwaga! nie stosować zbyt dużej objętości CuSO4, ponieważ jego niebieska barwa może maskować
pozytywny wynik reakcji biuretowej.
2. Miareczkowanie białka
Zasada:
Krzywa zmian pH podczas miareczkowania mocnego kwasu mocnÄ… zasadÄ… ma charakterystyczny,
esowaty kształt z bardzo stromym przebiegiem przy pH około 7. Miareczkowanie aminokwasu daje
przebieg z dwoma skokami pH przy zobojętnianiu grup aminowych i karboksylowych. W
przypadku miareczkowania białka składającego się z różnych aminokwasów krzywa
miareczkowania ma przebieg łagodny, pozwalający wyznaczyć ich pojemność buforową (ilość
kwasu lub zasady powodującą określoną zmianę pH). Własności buforujące białek w komórkach
łagodzą zmiany pH spowodowane np. wymianą jonową, tworzeniem i rozkładem różnych kwasów,
spożyciem kwaśnych pokarmów, zmianą równowagi pomiędzy jonami węglanowymi i
wodorowęglanowymi itp.
Wykonanie:
Do 2 zlewek o pojemności 100 cm3 wlać po 40 cm3 wody, a do dwóch następnych po 40 cm3 1%
kazeiny. Zlewki ustawić na mieszadle magnetycznym, wrzucić do środka  myszkę (element
mieszający), uruchomić mieszadło i umieścić w zlewce elektrodę pH-metru w sposób
uniemożliwiający jej rozbicie. Zapisać wartość pH. Następnie jedną parę roztworów (woda,
białko) miareczkować 0,5 M HCl (do osiągnięcia pH < 4), a drugą parę miareczkować 0,5 M NaOH
(do pH > 10). Kwas solny i wodorotlenek sodu dodawać porcjami (po 1 cm3 za pomocą pipety
automatycznej). Każdorazowo, po ustabilizowaniu się odczytu pH zapisywać jego wartość.
Sprawozdanie
Narysować krzywą miareczkowania: na osi x wartości pH, na osi y ilość dodanego HCl
(wartości dodatnie) i NaOH (wartości ujemne). Odczytać z wykresu wartość punktu
izoelektrycznego (odczyt pH przed miareczkowaniem), oraz pKa i pKb (punkty przegięcia
krzywej) oraz wyjaśnić jej charakterystyczny przebieg.
3. Właściwości ochronne koloidów hydrofilnych
Zasada:
Białka są cząsteczkami wykazującymi ładunek dodatni lub ujemny, w zależności od przewagi
budujących je aminokwasów kwaśnych lub zasadowych. Białka mają zatem wybitnie charakter
hydrofilny i są w roztworach otoczone dipolami wody, tworzącymi tzw. otoczkę wodną wokół
każdej cząsteczki. Koloidy hydrofilne, same trwałe w środowisku wodnym i nie ulegające
samorzutnej koagulacji, mogą osadzać się na powierzchni innych nietrwałych koloidów, i
wówczas oddziałują jako czynnik zwiększający ich trwałość, wytwarzając na ich powierzchni
wspólną otoczkę wodną. W ten sposób białka np. spowolniają proces łączenia się micelli
tłuszczu, bądz
też nie dopuszczają do reakcji poszczególnych jonów ze sobą.
Rys. 26. Cząsteczka białka z otoczką wodną
Wykonanie:
Do 2 probówek wlać po 2 cm3 0,01 mol·dm-3 roztworu AgNO3 i kilka kropel rozcieÅ„czonego
HNO3. Następnie do pierwszej probówki dodać 2 cm3 0,5-proc. roztworu albuminy lub białka z
jaja kurzego, a do drugiej 2 cm3 wody. Po zmieszaniu do obydwu probówek wlać kroplami 4
cm3 0,01 mol·dm-3 NaCl. W probówce z biaÅ‚kiem nie wytrÄ…ca siÄ™ charakterystyczny osad AgCl.
4. Wysalanie białek
Zasada:
Białka ulegają wysoleniu z roztworu wodnego pod wpływem wysokiego stężenia soli, takich jak
MgSO4, NaCl, Na2SO4 oraz przede wszystkim (NH4)2SO4. Mechanizm procesu polega na
konkurencji o wodę i w konsekwencji  na niszczeniu otoczki wodnej miceli białkowych. Proces
ten jest odwracalny, tzn. osad białkowy rozpuszcza się ponownie po zmniejszeniu stężenia soli.
Białka z grupy globulin wysalają się już przy 50% nasycenia siarczanem amonowym, podczas
gdy albuminy tracą trudniej otoczkę wodną i wysalają się dopiero przy całkowitym wysyceniu
roztworu siarczanem amonowym. Ta właściwość globulin i albumin pozwala rozdzielić te grupy
białek podczas stopniowego zwiększania stężenia siarczanu amonowego. Stosowana jest też
często do oczyszczania innych białek, gdyż poszczególne białka ulegają wytrącaniu przy
właściwym im stopniu wysycenia roztworu siarczanu amonowego.
Wykonanie:
Do 100 cm3 kolby stożkowej wlać 20 cm3 roztworu białka jaja kurzego i następnie równą
objętość nasyconego roztworu (NH4)2SO4. Wymieszać i odstawić na kilka minut dla wytrącenia
osadu globulin. Osad oddzielić poprzez filtrowanie lub wirowanie. Następnie do roztworu dosy-
pywać małymi porcjami krystaliczny siarczan amonowy mieszając roztwór intensywnie. Kiedy
pierwsza porcja soli nie rozpuści się, przerwać proces i odstawić roztwór na kilka minut. W tych
warunkach wytrącają się albuminy. Osad oddzielić poprzez filtrowanie lub wirowanie. Obydwa
osady białkowe rozpuścić w wodzie.
5. Wyznaczanie wartości punktu izoelektrycznego białka
Zasada:
Wiele właściwości białek jest związanych z ich strukturą pierwszorzędową, wynikającą z sekwencji
(kolejności) aminokwasów, między którymi powstają wiązania peptydowe. Większość aminokwasów
posiada jednÄ… grupÄ™ aminowÄ… (o charakterze zasadowym) i jednÄ… grupÄ™ karboksylowÄ… (o charakterze
kwasowym). Grupy te Å‚Ä…czÄ…c siÄ™ ze sobÄ… tworzÄ… wiÄ…zania peptydowe i w zwiÄ…zku z tym tracÄ…
dotychczasowe właściwości. W powstających łańcuchach polipeptydowych zbudowanych z reszt
aminokwasowych takiego typu występowałaby tylko jedna wolna grupa aminowa na N-końcu i jedna
grupa karboksylowa na C-końcu łańcucha peptydowego. Ponieważ w skład cząsteczek białek wchodzą
również reszty aminokwasów jednoamino-dwukarboksylowych (kwas asparaginowy, kwas
glutaminowy) oraz (diamino?) dwuamino-jednokarboksylowych (lizyna, arginina, histydyna), w białku
pozostaje pewna liczba wolnych grup aminowych i karboksylowych. Gdy więcej jest wolnych grup kar-
boksylowych niż aminowych, wówczas cząsteczki dysocjując w środowisku o odczynie obojętnym
wykazują właściwości kwasów: w obrębie cząsteczek występuje w takich warunkach więcej ładunków
ujemnych niż dodatnich. W cząsteczkach białek zasadowych natomiast, znajdujących się w środowisku o
odczynie obojętnym, występuje więcej ładunków dodatnich niż ujemnych. Przewaga ładunków
jednoimiennych (dodatnich lub ujemnych) sprzyja wiązaniu wody przez cząsteczki białka na zasadzie
oddziaływania elektrostatycznego na dipole wody. Prowadzi to do tworzenia się otoczek wodnych wokół
cząsteczek białka. Roztwór koloidowy białka jest wówczas trwały, gdyż poszczególne cząsteczki nie
łączą się w agregaty, które mogłyby tworzyć zawiesinę wytrącającą się z roztworu (koagulacja).
Zwiększanie stężenia jonów wodorowych (pH maleje) w środowisku powoduje cofanie dysocjacji grup
karboksylowych i ułatwianie dysocjacji grup aminowych, a obniżenie stężenia H+ (pH rośnie) wywołuje
efekt odwrotny. Dla każdego białka można dobrać taki odczyn środowiska, przy którym jest ono w
jednakowym stopniu zdysocjowane jako kwas i jako zasada. Wartość takiego odczynu (w jednostkach
pH) jest określana mianem punktu izoelektrycznego. Dla białek kwaśnych wartości punktu
izoelektrycznego są niższe od 7, a dla białek zasadowych wyższe. W punkcie izoelektrycznym liczby
ładunków ujemnych i dodatnich w obrębie cząsteczek białka są jednakowe, wskutek czego wypadkowy
ładunek jest równy zero. Z tego powodu zanika oddziaływanie elektrostatyczne cząsteczek białka na
cząsteczki wody. Cząsteczki białka w takich warunkach z łatwością tracą otoczki wodne, co sprzyja ko-
agulacji. Białka w punkcie izoelektrycznym wykazują zatem zmniejszone powinowactwo do wody i
dlatego odczyn środowiska może również wpływać na pęcznienie koloidów białkowych. W układach
biologicznych skutki tego oddziaływania zazwyczaj nie są wyraz
nie widoczne w związku z dużą różno-
rodnością białek posiadających różne wartości punktu izoelektrycznego.
Wykonanie:
Do 8 probówek odmierzyć wodę destylowaną i kwas octowy o stężeniu w ilościach podanych w
tabeli 2, zmierzyć pH w probówkach i zanotować w tabeli. Następnie dodać po 1 cm3 roztworu
kazeiny rozpuszczonej w octanie sodowym. Zawartość probówek wymieszać i po około 5 minutach
ocenić stopień zmętnienia płynów w poszczególnych probówkach.
Substancje Nr probówki
[cm3] 1 2 3 4 5 6 7 8
woda destylowana 8,9 8,8 8,5 8,0 7,0 5,0 1,0 0,0
kwas octowy 0,05 mol dm-3 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0 9,0
roztwór kazeiny w octanie 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
sodowym
pH roztworu
stopień zmętnienia
5. Spektrofotometryczne oznaczanie zawartości białka w materiale roślinnym
Wykonanie:
Pobrać 1 g świeżej masy liścia badanej rośliny i utrzeć w moz
dzierzu w ciekłym azocie. Po
odparowaniu azotu, podczas ucierania, dodawać stopniowo 3 cm3 buforu ekstrahującego Tris-
HCl (0,0625 mol×ðdm-3, pH 6,8). Homogenat przenieść do probówki wirówkowej, moz
dzierz
przepłukać kolejnymi 3 cm3 buforu, które należy dodać do homogenatu. Następnie próbki
odwirować przez 10 minut przy 13 000 obr./min.
SporzÄ…dzanie krzywej kalibracyjnej
Przygotować wyjÅ›ciowy roztwór BSA (albuminy woÅ‚owej) o stężeniu 10 mg×ðcm-3 w buforze
ekstrahującym (rozpuścić 100 mg BSA w 10 cm3 wody destylowanej). Do probówki pobrać 2
cm3 roztworu wyjściowego i dopełnić 8 cm3 wody destylowanej uzyskując w ten sposób stężenie
2 mg w 1 cm3. Z roztworu tego pobrać 5 cm3 do następnej probówki i dopełnić 5 cm3 wody
uzyskując roztwór o stężeniu 1 mg białka w 1 cm3. W ten sposób, metodą kolejnych rozcieńczeń
przygotować roztwory zawierające dalsze stężenia tj. 0,5; 0,25 i 0,125 mg BSA w 1 cm3.
Przygotować odczynnik Bradford: 60 mg odczynnika Coomassie Brilliant Blue G-250 rozpuścić
w 1 litrze 3% kwasu nadchlorowego i przefiltrować przez bibułę filtracyjną. Absorbancja
uzyskanego roztworu powinna mieścić się w przedziale 1,3-1,5 przy długości fali 465 nm.
Do każdej z kuwetek spektrofotometrycznych o objętości 3 cm3 dodać po 0,5 cm3 wody
destylowanej, 0,5 cm3 odczynnika Bradford oraz 0,18 cm3 buforu ekstrakcyjnego (Tris-HCl) a
następnie po 0,02 cm3 z każdego z roztworów wzorcowych oraz z supernatantu uzyskanego po
odwirowaniu próbek roślinnych. Po zmieszaniu na wstrząsarce laboratoryjnej kuwety odstawić
na 5 minut, po czym zmierzyć wartość absorbancji przy lð = 595 nm wzglÄ™dem Å›lepej próby
sporzÄ…dzonej z 200 mðl buforu i 1 cm3 odczynnika Bradford.
Sprawozdanie
Za pomocą arkusza kalkulacyjnego MS Excel wykreślić krzywą kalibracyjną i wyznaczyć
równanie regresji liniowej zależności absorbancji od stężenia BSA (wzorca). Z równania regresji
odczytać zawartość białka w badanej próbce (mg/cm3). Wartość tą należy przemnożyć przez 7
(można założyć, że 6 cm3 buforu ekstrahującego + 1g świeżej tkanki daje około 7 cm3
mieszaniny) otrzymując zawartość białka w 1 g świeżej masy.