Mateusz Sturgulewski gr. 3
Izolacja kwasów nukleinowych z materiału ludzkiego
Izolacja DNA genomowego z krwi metodÄ… fenol-chloroform:
·ð 200 µl krwi wykorzystano z wczeÅ›niej rozporcjonowanej próbki 200 µl w 1,5 ml probówce typu Eppendorf.
·ð Liza komórek zostaÅ‚a przeprowadzona metodÄ… z użyciem 5x stężonego buforu NH4Cl. Jony NH4+, a także K+
(również znajdujące się w buforze dzięki obecności 10 mM KHCO3) neutralizują ujemny ładunek błony
komórkowej co doprowadza do jej destabilizacji i lizy komórek znajdujących się we krwi (głównie
erytrocytów). Tris  HCl utrzymuje fizjologiczne pH, tak aby nie doszło do denaturacji genomowego DNA
podczas lizy. Następnie komórki inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zwirowano według
protokołu.
·ð 1x stężony bufor TAE przygotowano z 50x stężonego roztworu stock. FrakcjÄ™ jÄ…drowÄ… przemyto buforem PBS i
wirowano, nastÄ™pnie osad zawieszono w 750 µl buforu TAE  tak przygotowana próbka jest gotowa do
zamrożenia i może byd wykorzystana w póz
niejszych analizach.
·ð NastÄ™pnie dokonano ekstrakcji mieszaninÄ… fenol:chloroform. Jest to standardowa procedura oczyszczania
DNA z zanieczyszczeo białkowych. Po kilkuminutowej inkubacji DNA przechodzi do fazy górnej  wodnej.
Natomiast zanieczyszczenia białkowe przechodzą do fazy dolnej  fazy fenol:choloroform. Podczas dwiczeo
inkubacja z mieszaniną trwała 10 minut, następnie rozdzielono fazy poprzez łagodne wirowanie.
Rozdzielono obie fazy i fazÄ™ wodnÄ… ponownie ekstrahowano mieszaninÄ… fenol:choloroform. Fazy ponownie
rozdzielono poprzez wirowanie w warunkach podanych w protokole.
·ð Dodano mieszaninÄ™ octanu amonu i izopropanolu (odpowiednio 0,1 objÄ™toÅ›ci i 1 objÄ™toÅ›d) do ponownie
zebranej fazy wodnej w celu wytrÄ…cenia genomowego DNA. PrecypitacjÄ™ prowadzono przez 20 minut.
Odwirowano w warunkach podanych w sprawozdaniu.
·ð PróbkÄ™ DNA zagÄ™szczono dodajÄ…c 75% etanol. Etap ten pozwala również na pozbycie siÄ™ soli oraz wolnych
nukleotydów z próbki. Po odwirowaniu i wysuszeniu osad zawieszono w buforze TAE.
Izolacja ludzkiego DNA genomowego z krwi obwodowej (Blood Mini Kit, A&A Biotechnology)
·ð 100 µl krwi byÅ‚o już rozporcjonowane przed rozpoczÄ™ciem dwiczeo. Dodano 200 µl uniwersalnego buforu
lizującego LT którego zadaniem była liza komórek  uwolnienie DNA genomowego. Do reakcji dodano również
20 µl Proteinazy K  proteinaza miaÅ‚a za zadanie oczyszczenie preparatu z biaÅ‚ek oraz ochronÄ™ DNA przed
degradacjÄ… (niszczenie DNAz).
·ð PróbkÄ™ wirowano i naniesiono na kolumnÄ™, dodano nastÄ™pnie 500 µl roztworu pÅ‚uczÄ…cego A1 (roztwór ten
ma za zadanie wypłukanie niespecyficznie związanych związków z kolumny); próbkę zwirowano, przeniesiono
kolumnÄ™ do nowej probówki 2 ml i ponowiono pÅ‚ukanie 400 µl roztworu A1. Zwirowano wg protokoÅ‚u.
Przeniesiono kolumnę do probówki 1,5 ml.
·ð Dokonano elucji genomowego DNA z kolumny przy pomocy buforu Tris  HCL o pH 8,5. Bufor ten zmienia
warunki panujące na złożu  DNA traci powinowactwo do złoża na kolumnie i wypływa z eluentem. Próbkę
następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut i zwirowano. DNA zachowano do dalszej
analizy.
Obserwacje i wyniki:
Analiza Nano-drop:
·ð izolacja FC: 238,2 ng/µl 260/280 nm: 1,54 260/230 nm: 29,78
·ð izolacja KIT: 6,6 ng/µl 260/280 nm: 0,58 260/230 nm: 0,37
Analiza elektroforetyczna (rozdział prowadzono w 1% żelu agarozowym przy 100 V przez 30 minut, na żel
naÅ‚ożono po 9 µl DNA w 4 µl buforu obciążajÄ…cego, zajÄ™to 10 i 11 studzienkÄ™ w kolejnoÅ›ci):
 M FC KIT M
5 µl 5 µl
DNA
Wnioski:
W oparciu o wyniki metody Nano-drop izolacja DNA genomowego metodą fenol:choloroform okazała się byd bardzo
skuteczna. Osiągnięto preparat o znacznej czystości wg stosunku absorbancji DNA do zanieczyszczeo białkowych
(260/280 nm) oraz innych drobnoczÄ…steczkowych zanieczyszczeo (260/230 nm). Niestety, elektroforeza agarozowa
nie ujawniła obecności DNA w tym przypadku. Możliwe iż ilośd DNA naniesiona na żel była niewystarczająca do
prawidłowej detekcji lub obecne zanieczyszczenia białkowe (np. DNAzy) zdegradowały DNA.
Izolacja DNA gotowym zestawem Blood Mini Kit nie powiodła się. Możliwe iż zestaw nie jest odpowiednio
wystandaryzowany do analizy maÅ‚ej objÄ™toÅ›ci krwi (100 µl). KolejnÄ… możliwoÅ›ciÄ… może byd zÅ‚y stan buforów lub
kolumny w zestawie  DNA mogło wcale nie związad się ze złożem lub związad się częściowo i wyeluowad już na
etapie płukania.