1
Ćwiczenie 7
Mechanizmy bakteryjnej oporności na antybiotyki i chemioterapeutyki
1. Typy oporności
Bakterie mogą być oporne na antybiotyki i chemioterapeutyki w sposób:
·ð naturalny
·ð nabyty
Oporność naturalna  jest stałą cechą gatunku, rodzaju, rodziny drobnoustrojów i może ona wynikać:
- z braku lub niskiego powinowactwa do struktury będącej celem działania leku
przeciwbakteryjnego, np. antybiotyki ²-laktamowe nie dziaÅ‚ajÄ… na Mycoplasma pneumoniae,
Chlamydia pneumoniae (brak struktury ściany komórkowej); cefalosporyny i penicyliny
izoksazolowe nie działają na Enterococcus spp.
- z braku lub niskiej penetracji/transportu antybiotyku przez ścianę komórkową, np. makrolidy,
glikopeptydy nie działają na Enterobacteriaceae, aminoglikozydy nie działają na Enterococcus spp.
- z wytwarzania enzymu inaktywujÄ…cego antybiotyk, np. ²-laktamaza o aktywnoÅ›ci karbapenemazy u
Stenotrophomonas maltophilia powoduje rozkład karbapenemów.
Oporność nabyta  rozwija się w wyniku wielu procesów genetycznych, które zachodzą u bakterii w wyniku
presji selekcyjnej, związanej z powszechnym stosowaniem antybiotyków. Oporność drobnoustrojów na
antybiotyki i chemioterapeutyki może być determinowana informacją genetyczną zawartą w chromosomie
i/lub elementach ruchomych jak: plazmidy, transpozony, integrony.
W obrębie oporności nabytej wyróżnia się więc oporność chromosomalną i oporność plazmidową.
Oporność chromosomalna powstaje w wyniku:
- mutacji  spontanicznej zmiany fragmentu sekwencji DNA genomu bakteryjnego, np. mutacje w
genie gyrazy i wynikająca z tego oporność na chinolony szczepów Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa
- nabycia genu oporności, np. w wyniku procesu transformacji obcogatunkowego DNA  nabycie
genu oporności na penicyliny przez Streptococcus pneumoniae na drodze transformacji od szczepów
paciorkowca zieleniÄ…cego jamy ustnej.
Oporność plazmidowa powstaje w wyniku przeniesienia plazmidów (lub mniejszych ruchomych
fragmentów DNA  transpozony, integrony) z komórki na komórkę tego samego lub odrębnego
taksonomicznie gatunku drobnoustrojów na drodze:
- koniugacji  bezpośrednie przeniesienie genów oporności przez kontakt komórka-komórka
- transdukcji  przeniesienie genów oporności przez wirus bakteryjny (bakteriofag)
- transformacji  bezpośrednie wnikanie DNA komórki dawcy ulegającej lizie na komórkę biorcy.
Plazmidy sÄ… to dodatkowe, ruchome fragmenty kolistego DNA, zlokalizowane poza chromosomem,
charakteryzujące się niezależną od chromosomu replikacją oraz zdolnością do przenikania do innych
komórek. Informacja zawarta w plazmidach związana jest najczęściej z syntezą czynników zjadliwości lub
opornością na antybiotyki. Transpozony, mniejsze od plazmidów nośniki genów oporności, mogą się
przemieszczać z chromosomem na plazmid, stanowiąc z nim część integralną. Jeśli lokalizują się na
plazmidzie koniugacyjnym mogą być przenoszone razem z nim na inne komórki. Transpozony mogą być
przenoszone również odwrotnie, tj. z plazmidu na chromosomalne DNA.
2. Ekspresja fenotypowa oporności na antybiotyki
Komórka bakteryjna po nabyciu genu oporności na antybiotyki bądz
grupę antybiotyków manifestuje nowo
nabytÄ… cechÄ™ przez:
·ð syntezÄ™ enzymu, który inaktywuje lub modyfikuje lek przed lub po jego przedostaniu siÄ™ do
komórki bakteryjnej, np.
enzym rozkÅ‚adajÄ…cy antybiotyk - ²-laktamaza rozkÅ‚adajÄ…ca ²-laktamy
enzym modyfikujÄ…cy antybiotyk  acetylotransferaza, adenylotransferaza, fosfotransferaza 
modyfikujÄ…ce aminoglikozydy
 2
·ð antybiotyk wnika do komórki; najczęściej dotyczy caÅ‚ej grupy antybiotyków, np. oporność
Pseudomonas aeruginosa na aminoglikozydy
·ð modyfikacja miejsca docelowego dziaÅ‚ania antybiotyków (receptora wiążącego antybiotyk),
np. białek wiążących penicyliny PBP u Streptococcus pneumoniae, warunkująca oporność na
²-laktamy
·ð synteza nowego biaÅ‚ka wiążącego penicyliny PBP, które nie ma powinowactwa i nie wiąże
antybiotyku  oporność na metycylinę Staphylococcus aureus.
·ð ominiÄ™cie ogniwa zablokowanego przez chemioterapeutyk (sulfonamidy)
·ð aktywne usuwanie antybiotyku z komórki na zasadzie  pompy (active efflux)  oporność
niskiego stopnia na chinolony
3. Przykłady oporności
a) Oporność enzymatyczna
- oporność na antybiotyki ²-laktamowe
Jest wynikiem syntezy przez bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie enzymu ²-laktamazy
odpowiedzialnej za oporność na penicyliny i cefalosporyny
CH2 S CH2 S
R R
CH3 CH3
N C HN
CH3 ²-laktamaza O
CH3
COOH H2O OH COOH
pierÅ›cieÅ„ ²-laktamowy
wiÄ…zanie amidowe
·ð ²-laktamazy bakterii Gram-dodatnich sÄ… najczęściej kodowanymi plazmidowo enzymami o
profilu penicylinaz. Są wytwarzane przez gronkowce, znacznie rzadziej przez enterokoki. Oporność
ta zwiÄ…zana jest z syntezÄ… ²-laktamazy, która niszczy antybiotyk ²-laktamowy w Å›rodowisku
zewnątrzkomórkowym, czego konsekwencją jest spadek stężenia aktywnej postaci leku w tym
środowisku. Oporność ta jest zjawiskiem populacyjnym  liczna populacja jest znacznie bardziej
oporna niż mała, a gen odpowiedzialny za syntezę enzymu jest indukcyjny, co oznacza, że w
obecności leku ilość wytwarzanego enzymu znacznie wzrasta.
Wykrywanie penicylinazy gronkowcowej przeprowadzić można testem cefinazowym z krążkiem wysyconym
nitrocefiną. Umieścić na szkiełku podstawowym zwilżony jałową wodą destylowaną krążek z nitrocefiną.
Rozetrzeć następnie na krążku kilka kolonii zebranych ze świeżej 18-24 godzinnej hodowli badanego szczepu
(z podłoża stałego lub z obrzeża strefy zahamowania wzrostu szczepu w metodzie dyfuzyjno-krążkowej z
penicyliną 1U). Szkiełko umieścić w pustej płytce Petriego i pozostawić w temperaturze pokojowej do 30
minut. Powstanie różowoczerwonego zabarwienia na krążku Å›wiadczy o wytwarzaniu penicylinazy (²-
laktamazy) przez badany szczep.
W metodzie dyfuzyjno-krążkowej z penicyliną 1U: S e" 26 mm R d" 26 mm.
Gronkowce penicylinazo-dodatnie sÄ… oporne na: penicyliny naturalne, amino-, karboksy- i ureidopenicyliny.
·ð ²-laktamazy bakterii Gram-ujemnych podzielono na kilka grup w zależnoÅ›ci od wielu różnych
cech. Niektóre są aktywne tylko wobec penicylin, inne wobec cefalosporyn, a jeszcze inne oddziałują
na obydwie grupy leków. Zewnętrzna warstwa ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych opóz
nia
wnikanie antybiotyków do komórki, a ²-laktamaza pozostaje w przestrzeni okoÅ‚oplazmatycznej,
każda więc komórka jest odpowiedzialna za swoją własną ochronę. Niewielka ilość bakterii może
być więc tak samo oporna jak duża. Geny odpowiedzialne za ich syntezę mogą znajdować się na
plazmidach (plazmidowe ²-laktamazy) lub w chromosomie bakterii (chromosomalne
cefalosporynazy).
 3
- Chromosomalne cefalosporynazy mogą być wytwarzane przez wszystkie bakterie Gram-ujemne
za wyjątkiem szczepów Salmonella. Wyróżnia się dwa główne typy cefalosporynaz: konstytutywne 
synteza enzymu odbywa się na tym samym niskim poziomie i jest niezależna od obecności
antybiotyku w środowisku (często u Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae)
indukcyjne  typowe dla szczepów Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Proteus indolo (+). Synteza
enzymu ulega przyspieszeniu lub zwiększeniu w obecności antybiotyku  induktora. Po usunięciu
induktora synteza enzymu wraca do poziomu podstawowego z wyjątkiem szczepów, u których
doszło do trwałej derepresji genu chromosomalnej cefalosporynazy. Szczepy te są oporne na
wszystkie antybiotyki ²-laktamowe z wyjÄ…tkiem karbapenemów (chociaż opisano już tzw.
chromosomalne cefalosporynazy o rozszerzonym spektrum, zdolne także do inaktywacji
karbapenemów).
²-laktamazy
MBL
plazmidowe
penicylinazy cefalosporynazy ²-laktamazy
o szerokim spektrum KPC
plazmidowe
plazmidowe chromosomalne chromosomalne klasyczne enzymy o poszerzonym
(S. aureus) (Bacteroides (Pseudomonas (TEM, SHV) spektrum
Moraxella) Enterobacter substratowym
Serratia
Proteus indolo (+))
plazmidowe plazmidowe
(Haemophilus (Klebsiella
Enterobacteriaceae Escherichia coli)
Pseudomonas)
Rycina 1. Wykrywanie indukcyjnych cefalosporynaz chromosomalnych
- Plazmidowe ²-laktamazy to enzymy o szerokim spektrum substratowym, wytwarzane głównie
przez paÅ‚eczki Gram-ujemne, w niewielkim stopniu przez Gram-dodatnie. Plazmidowe ²-laktamazy
o szerokim spektrum substratowym dzielÄ… siÄ™ na klasyczne typu TEM-1, SHV-1, OXY-1 oraz na
enzymy o rozszerzonym spektrum substratowym ES²L (extender spectrum ²-lactamase), które sÄ…
zmutowanymi formami enzymów klasycznych.
 4
Øð Klasyczne ²-laktamazy TEM, SHV rozkÅ‚adajÄ… wszystkie antybiotyki ²-laktamowe z
grupy penicylin (penicylinę, ampicylinę  w wysokim stopniu, karbenicyliny  słabiej,
ureidopenicyliny: mezlocylinę, azlocylinę, piperacylinę  znacznie słabiej) i w mniejszym
stopniu z grupy cefalosporyn I generacji.
Aktywność wobec szczepów wytwarzających ten enzym wykazują: cefalosporyny II,III,IV generacji,
monobaktamy, karbapenemy, penicyliny z inhibitorami ²-laktamaz.
Ten typ enzymu spotyka się najczęściej u opornych na ampicylinę szczepów Escherichia coli,
Salmonella spp., Shigella spp., Proteus mirabilis a także u Haemophilus influenzae i Neisseria
gonorrhoeae.
Rycina 2. Wykrywanie klasycznych ²-laktamaz typu TEM, SHV. Charakterystyczna oporność na tikarcylinÄ™ (TIC), ale wrażliwość
na skojarzenie tikarcyliny z inhibitorem ²-laktamaz (kwas klawulanowy)- TIM
Tikarcylina (TIC)  penicylina o szerokim Tikarcylina + inhibitor (kw. klawulanowy = Timentin (TIM))
spektrum substratowym
oporny (O) TIC
wrażliwy (W)
TIM
C
Øð ²-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym ES²L wykazujÄ… oporność na
wszystkie penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy, przy zachowanej wrażliwości na
karbapenemy i blokujÄ…ce dziaÅ‚anie inhibitorów ²-laktamaz (wykorzystywane jako cecha
diagnostyczna).
Enzymy te wytwarzają szczepy występujące przede wszystkim w środowisku szpitalnym, głównie
Klebsiella pneumoniae i Escherichia coli, ale należy rutynowo oznaczać wytwarzanie ES²L u
wszystkich pałeczek Enterobacteriaceae, wykonując przeglądowy test wstępny z antybiotykami
należącymi do III generacji cefalosporyn (ceftazydym, cefotaksym, ceftriakson) i monobaktamem
(aztreonam)  zmniejszenie strefy zahamowania wzrostu poza wyznaczonÄ… granicÄ™ zobowiÄ…zuje do
wykonania testów potwierdzajÄ…cych (test dwóch krążków, E-testy ES²L, testy automatyczne).
 5
- Test dwóch krążków jest klasycznÄ… metodÄ… wykrywania ²-laktamazy ES²L i polega na wykorzystaniu
zjawiska dyfuzji antybiotyku w żelu agarowym. Na podłożu Mueller-Hinton z posianym badanym
szczepem umieszcza siÄ™ w odlegÅ‚oÅ›ci 20 mm od penicyliny z inhibitorem ²-laktamaz
(amoksycylina/kwas klawulanowy) 2 krążki zawierające cefalosporyny III generacji: ceftazydym i
cefotaksym.
Pojawienie się dodatkowej strefy świadczącej o wzroście aktywności cefalosporyny od strony
dziaÅ‚ania inhibitora, pozwala wnioskować o wytwarzaniu przez szczep ²-laktamazy ES²L (ryc. 3).
- stosowane są także testy (tylko dla E.coli, Klebsiella spp.) wykorzystujące różnicę w strefie zahamowania
wzrostu wokół krążka z samą cefalosporyną III generacji (cefotaksym, ceftazydym) a krążkiem zawierającym
Å‚Ä…cznie cefalosporynÄ™ III generacji i inhibitor ² - laktamaz (ceftazydym + kw.klawuÅ‚anowy, cefotaksym + kw.
klawulanowy). Jeśli szczep wytwarza ESBL to średnica strefy wokół krążka zawierającego ceafalosporynę III gen +
inhibitor jest większa o 5mm od średnicy wokół krążka z samą cefalosporyną.
- E - testy pozwalajÄ…ce wykrywać ES²L
Pasek E-test ES²L jest noÅ›nikiem gradientu stężeÅ„ dwóch antybiotyków: ceftazydymu (TZ) (cefalosporyna III
generacji) i ceftazydymu z kwasem klawulanowym (TZL) oraz cefotaksymu (CT) (cefalosporyna III generacji) i
cefotaksymu z kwasem klawulanowym (CTL).
Przyjmuje się że:
ES²L jest ujemny (-) jeÅ›li stosunek MIC TZ/TZL<8 i CT/CTL<8
ES²L jest dodatni (+) jeÅ›li MIC dla CTe"0.5 i stosunek CT/CTL e"8 lub MIC dla TZe" 1 i
stosunek TZ/TZLe"8. Niewyraz
na strefa zahamowania wzrostu lub zniekształcenie elipsy CT
lub TZ wskazuje na produkcjÄ™ ESBL.
- metoda półautomatyczna  test ATB BLSE (bio Merieux)
- metoda automatyczna  test VITEK GNS-NT (bio Merieux), test Phoenix Panel Gram-negative NMIC/5
ID (Becton Dickinson)
DROBNOUSTROJE WYTWARZAJ
CE ²-LAKTAMAZY
-Gronkowce koagulazo (+) i koagulazo (-) - 80-85% szczepów
-Enterococcus faecalis
-Moraxella catarrhalis- 70-90% szczepów
-Neisseria gonorrhoeae (występowanie regionalnie zróżnicowane)
-Haemophilus influenzae 10-40 % szczepów
-Pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae - ok. 60% szczepów
Inhibitory ²-Iaktamaz (nazywane,, czÄ…steczkami samobójcy  )
Inhibitory ²-laktamaz majÄ… strukturÄ™ antybiotyków ²-laktamowych, nie wykazujÄ… aktywnoÅ›ci przeciwbakteryjnej,
potÄ™gujÄ… natomiast aktywność antybiotyków ²-laktamowych. Inhibitory ²-laktamaz majÄ… zdolność blokowania aktywnoÅ›ci
enzymów plazmidowych, w tym penicylinaz gronkowcowych i enterokokowych, natomiast nie hamują cefalosporynaz
chromosomalnych (z wyjątkiem wytwarzanych przez pałeczki beztlenowe Bacteroides fragilis). Skojarzone z
antybiotykiem ²-laktamowym chroniÄ… go przed hydrolizÄ… i sprawiajÄ…, że może być aktywny wobec szczepów opornych
wytwarzajÄ…cych ²-laktamazy plazmidowe. Do inhibitorów ²-laktamaz należy:
" kwas klawulanowy
" tazobaktam
" sulbaktam
Metaloenzymy - Karbapenemazy (MBL - metallo-²-lactamase).
²-laktamzy o specyficznej strukturze, zawierajÄ…ce w swym miejscu aktywnym metal (najczęściej Zn2+).
Hydrolizują penicyliny, penicyliny z inhibitorami, cefalosporyny (niższa aktywność wobec IV generacji i cefsulodyny) i
karbapenemy. Produkcji karbapenemaz MBL możemy spodziewać się u opornych na karbapenemy szczepów
Pseudomona aeruginosa, innych szczepów pałeczek Gram - ujemnych za wyjątkiem Stenotrophomonas matophilia,
który syntetyzuje karbapenemazy naturalnie.
 6
Wykrywanie karbapenemaz
" metoda dyfuzyjno - krążkowa
Test wykonuje się na dwóch płytkach z podłożem Meuller-Hinton:
- na pierwszą z płytek z posianym szczepem badanym nakłada się dwa krążki: z ceftazydymem w odległości około 4 cm,
następnie w odległości około 2 cm od środków krążków nakładamy jałowy krążek bez antybiotyku, na który nakrapia się
2źl kwasu 2-merkaptopropionowego
- na drugą płytkę z posianym jak wyżej szczepem badanym nakłada się analogicznie dwa krążki z imipenemem, a
na jałowy krążek nakrapia się l0 źl 0,5 M roztworu EDTA
O produkcji MBL świadczy pojawienie się wyraz
nie powiększonej strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z
ceftazydymem/imipenemem od strony krążka zawierającego inhibitor karbapenemaz (kw. 2-merkaptopropionowy, 0,5 M
EDTA)
" E - testy MBL
Pasek E-test MBL jest nośnikiem gradientu stężeń dla impenemu IP (karbapenem) oraz imipenemu i stałego stężenia
EDTA (inhibitor karbapenemaz)  IPI . Wynik jest dodatni dla MBL kiedy stosunek MIC IP/IPI wynosi >8. Deformacja
elipsy IP również oznacza obecność MBL. E-test MBL jest akceptowaną metodą wykrywania MBL, jednakże wszystkie
pozytywne fenotypy MBL należy przesłać do laboratorium referencyjnego w celu potwierdzenia testem
genotypowym.
a) b)
Rycina 4. Wykrywanie ESBL przy pomocy E-testu: a) MIC IP IPI=16 <1= 16- >MBL(+)
b) deformacja elips dla IP świadczy o MBL(+)
·ð ²-laktamazy  karbapenemazy KPC  to enzymy hydrolizujÄ…ce wszystkie karbapenemy
(imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem), a więc antybiotyki uważane za leki ostatniej
szansy w leczeniu zakażeń wywoływanych przez pałeczki Gram-ujemne, a także wszystkie
pozostaÅ‚e antybiotyki ²-laktamowe (penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy). Enzymy te sÄ…
stosunkowo sÅ‚abo hamowane przez inhibitory ²-laktamaz (kwas klawulanowy, sulbaktam,
tazobaktam), dlatego poÅ‚Ä…czenia inhibitorów z ²-laktamami nie znajdujÄ… żadnego
zastosowania.
Enzymy te wytwarzane są najczęściej przez szczepy Klebsiella pneumoniae, ale zaobserwowano już
ich wytwarzanie przez szczepy Klebsiella oxytoca, Raoultella spp., Escherichia coli, Citrobacter
freundii, Enterobacter spp., Serratia marcescens, Salmonella enterica, a nawet Pseudomonas
aeruginosa i Pseudomonas putida. Szczepy Klebsiella pneumoniae KPC+ są zazwyczaj wrażliwe
jedynie na kolistynÄ™, tygecyklinÄ™, gentamycynÄ™ i niekiedy na amikacynÄ™. Brak jest jednak obecnie
badań klinicznych udowadniających skuteczność tych antybiotyków w leczeniu zakażeń wywołanych
przez szczepy KPC+ (sÄ… one stosowane z powodu braku innych opcji terapeutycznych).
- Oporność na aminoglikozydy wynikająca z enzymatycznej modyfikacji leku
Niektóre drobnoustroje mają zdolność wytwarzania enzymów: acetylotransferazy, fosforylazy, nukleotydazy,
które modyfikują aminoglikozydy, czyniąc je niezdolnymi do wiązania się z docelowym rybosomem. Enzymy
modyfikujące znajdują się na powierzchni błony cytoplazmatycznej, modyfikacji ulegają więc tylko te cząsteczki
leku, które są transportowane przez błonę cytoplazmatyczną.
 7
2. Oporność na antybiotyki ²-laktamowe zwiÄ…zana ze zmianÄ… powinowactwa miejsca docelowego
działania antybiotyku
Mechanizm dziaÅ‚ania antybiotyków ²-laktamowych polega na zahamowaniu syntezy Å›ciany komórkowej.
Enzymy, które biorą udział w syntezie (karboksypeptydazy, transpeptydazy) z uwagi na zdolność wiązania się z
antybiotykami ²-laktamowymi nazwano biaÅ‚kami wiążącymi penicyliny PBP. Liczba PBP w komórce jest różna i
charakterystyczna dla określonego gatunku, a poszczególne antybiotyki wykazują zróżnicowane do nich
powinowactwo. Oporność na antybiotyk może być skutkiem pojawienia się w komórce nowego białka PBP, o
niskim powinowactwie do antybiotyków ²-laktamowych, ale nadal zachowanej funkcji biologicznej w syntezie
ściany komórkowej. Białko takie (PBP 2a określne również PBP 2 ) występuje u tzw. metycylinoopornych
szczepów Staphylococcus aureus (MRSA - Methicillin Resistant S. aureus) i gronkowców koagulazo-
ujemnych (MRCNS - Methicillin Resistant Coagulase-Negative Staphylococci)
Szczepy gronkowców o takim mechanizmie oporności na metycylinę są oporne:
na wszystkie antybiotyki ²-laktamowe: penicyliny, cefalosporyny, cefamycyny, karbapenemy, penicyliny
skojarzone z inhibitorami
Szczepy te mogą być również krzyżowo oporne z:
" makrolidami, linkozamidami, aminoglikozydami, chinolonami
Wykrywanie gronkowców opornych na metycylinę
Metoda dyfuzyjno-krążkowa
" Przygotować zawiesinę badanego szczepu gronkowca o gęstości odpowiadającej 0,5 jednostek w skali Mc
Farlanda
" Nanieść na podłoże Mueller-Hinton (MHA) badany szczep (jałową wymazówką nanieść badany szczep na
caÅ‚Ä… powierzchnie pÅ‚ytki 3-krotnie obracajÄ…c jÄ… o 60° ). NaÅ‚ożyć krążek z cefoksytynÄ… (30ug)
" Po 24 godzinnej inkubacji zmierzyć strefę zahamowania wzrostu gronkowca (odczyt w przepuszczonym świetle w
świetle odbitym), którą należy porównać z podanymi kryteriami.
Wykazano, że cefoksytyna może być lepszym wskaz
nikiem oporności na metycylinę. Krążkiem z cefoksytyną mogą być
wykrywane również tzw. szczepy preMRSA, które posiadają gen mec A, natomiast są wrażliwe in vitro na metycylinę. Na
podstawie wyniku oznaczenia uzyskanego z zastosowaniem cefoksytyny (30ug) można identyfikować oporność na
metycylinę u wszystkich gatunków gronkowców.
Dla innych niż Staphylococcus epidermidis gronkowców koagulazo - ujemnych metoda dyfuzyjno-
krążkowa może dawać wyniki fałszywej oporności (pomimo braku obecności genu mec A szczep wykazuje
oporność na metycylinę). W związku z tym zalecane jest, aby dla szczepów MRCNS opornych na metycylinę
wykonywać identyfikacje genu mec A metodą PCR.
Metoda przeglÄ…dowa z oksacylinÄ… (tylko dla Staphylococcus aureus)
Na podłoże MHA z oksacyliną w stężeniu 6mg/l i dodatkiem 4% NaCl nanieść zawiesinę bakteryjną o gęstości 0,5
McFarlanda. Wzrost więcej niż jednej kolonii oznacza oporność na metycylinę. Odczytywać w świetle przechodzącym!
- Testy polegające na wykrywaniu białka PBP 2A (PBP2') - testy pozwalają na wykrycie nowego
białka, produktu genu mec A, warunkującego oporność na metycylinę.
" MRSA - Screen - Denka Seiken (Innogenetics)
" Slidex MRSA Detection (bio Merieux)
" Oxoid PBP2' - DR900M (Oxoid)
- Metody automatyczne
" test ATB OXA lub ATB STAPH (bio Merieux)
" test Cristal MRSA ID
" test Phoenix Panel Gram Positive PMIC/5 ID(Becton Dickinson)
Oporność na glikopeptydy
Oprócz drobnoustrojów naturalnie opornych na glikopeptydy (Pałeczki Gram - ujemne, Pediococcus,
Lactobacillus, Neisseria) coraz częściej spotyka się szczepy Enterococcus oporne na glikopeptydy (VRE) oraz
szczepy gronkowców o obniżonej wrażliwości na wankomycynę VISA (vancomycin - intermediate
 8
Staphylococcus aureus). Geny oporności zlokalizowane są na chromosomie lub plazmidach, transpozonach i
wyróżniamy:
- Gen Van A - wysoka oporność indukowana na wankomycynę i oporność na teikoplaninę (gen
przenoszony na plazmidzie dotyczy enterokoków, gronkowców, paciorkowców, Listerii)
- Gen Van B - średnia oporność na wankomycynę i wrażliwość na teikoplaninę
- Gen Van C - oporność konstytuowana (wrodzona) na wankomycynę i wrażliwość na teikoplaninę
(E.gallinarum, E. casseliflavus, E. flavescens)
- Gen Van D - konstytutywna oporność na wankomycynę i oporność na małe stężenia teikoplaniny
- Gen Van E - niska oporność na wankomycynę i wrażliwość na teikoplaninę
Oporność ma makrolidy, linozamidy i streptograminy
Trzy grupy wymienionych antybiotyków, chociaż maja inną strukturę chemiczną, działają identycznie na
komórkę bakterii i mają wspólny mechanizm oporności. U bakterii Gram-dodatnich występują aż trzy odrębne
mechanizmy oporności oznaczające krzyżową oporność na makrolidy, linkozamidy, streptograminy. Oporność
MLS może być konstytuowana lub indukcyjna i składa się na nią:
- modyfikacja miejsca docelowego działania
- enzymatyczna modyfikacja antybiotyku
- aktywne usuwanie antybiotyku z komórki
Identyfikacja fenotypu oporności na makrolidy i linkozamidy
Erytromycyna W Erytromycyna O
Klindamycyna W Klindamycyna O Klindamycyna O Klindamycyna W KlindamycynaW
spłaszczenie strefy brak spłaszczenia trefy
zahamowania wzrostu
Szczep wrażliwy L-fenotyp lub błąd oznaczenia mechanizm oporności mechanizm oporności mechanizm oporności
(zalecane powtórzenie badania) MLSB konstytutywny MLSB indukcyjny MSB
nie stosować linkozamidów nie stosować makrolidów nie stosować makrolidów nie stosować
i linkozamidów i linkozamidów makrolidów
14 i 15-węglowych
 9
Wykrywanie MLSB
Metoda dyfuzyjno - krążkowa
Na posianą płytkę z badanym szczepem klinicznym nakłada się w odległości około 2 cm krążek z
erytromycyną (15źg) i klindamycyną (2źg). Jeżeli badany Gram-dodatni szczep jest oporny na
erytromycynę i widoczne jest ścięcie strefy zahamowania wzrostu dla klindamycyny od strony
erytromycyny, można przypuszczać oporność typu MLSB.
Coraz częściej stosuje się do wykrywania genu oporności sondy genetyczne. Ma to szczególne znaczenie u
drobnoustrojów wolno rosnących, u których w trakcie terapii pojawia się oporność (np. Mycobacterium tuberculosis -
prÄ…tki gruz
licy) lub u drobnoustrojów, u których mamy wątpliwości co do występującego mechanizmu oporności.
Warto pamiętać, że w komórce bakteryjnej mogą funkcjonować dwa lub trzy różne mechanizmy oporności na
antybiotyki z tej samej grupy
Rycina 5. Szczep Staphylococcus aureus wykazujący mechanizm oporności typu MLSB
Widoczne ścięcie strefy zahamowania
wzrostu dla linkomycycny
L  linkomycyna (linkozamid) E  erytromycyna (makrolid)
 10
Część praktyczna
1. Wykonaj test cefinazowy dla wykrycia penicylinazy gronkowcowej.
Nałóż na szkiełko podstawowe krążek z nitrocefną, zwilż go jałową wodą destylowaną, rozetrzyj kilka
kolonii z 18-24-godzinnej hodowli badanego szczepu. Szkiełko umieść w pustej płytce Petriego i
inkubuj w temperaturze pokojowej 10-30 minut. Powstanie różowo-czerwonego zabarwienia świadczy o
wytwarzaniu ²-laktamazy (penicylinazy). Wynik zapisz w tabeli punktu 2.
2. Wykonaj badanie wrażliwości gronkowców na metycylinę metodą dyfuzyjno-krążkową z cefoksytyną
(30 źg).
Przygotuj zawiesinę szczepu gronkowca o gęstości 0,5 jMcF w 0,9% jałowym roztworze NaCl (porównaj
zmętnienie z wzorcem). Jałową wymazówkę zanurz w zawiesinie, odciśnij nadmiar płynu o ściankę
probówki, a następnie wykonaj posiew drobnoustrojów na podłożu Mueller-Hinton (trzy razy obracając
płytkę o 60o). Odczekaj 15 minut i nanieś przy pomocy pęsety krążek z cefoksytyną. Po 15 minutowej
preinkubacji w temperaturze pokojowej, płytki włóż do cieplarki nastawionej na temperaturę 35oC.
Odczytaj średnicę strefy zahamowania wzrostu bakterii po 24- godzinnej inkubacji. Strefę zahamowania
wzrostu oglądaj w świetle odbitym.
Wpisz uzyskane średnice do tabeli i zinterpretuj wynik w oparciu o zamieszczone poniżej kryteria
Strefa Interpretacja* Obecność Wnioski
zahamowania penicylinazy
wzrostu w mm
Szczep 1
Szczep 2
* O  oporny (resistant) W  wrażliwy (susceptible)
 +  wytwarza penicylinazÄ™  -  nie wytwarza penicylinazy
Kryteria interpretacji dla szczepu badanego Staphylococcus aureus.
Antybiotyk/stężenie Średnica strefy zahamowania wzrostu w mm
Wrażliwy średnio Oporny
MSSA wrażliwy MRSA
Cefoksytyna 30 źg e" 22 - < 22
3. Odczytaj i zinterpretuj wyniki badania wrażliwości szczepu Staphylococcus aureus na
makrolidy, linkozamidy (podane antybiotyki wchodzą w skład antybiogramu
podstawowego dla Staphylococcus aureus).
Oporny (o) Wrażliwy (w) Wynik w mm Interpretacja*
Antybiotyk
Erytromycyna 15 źg < 18 e" 21
Klindamycyna 2 źg < 18 e" 21
* O  oporny (resistant) W  wrażliwy (susceptible)
Wynik oznaczenia wrażliwości na erytromycynę jest reprezentatywny dla roksytromycyny,
klarytromycyny, azytromycyny. Krążek z linkozamidem (klindamycyną 2 źg) należy układać
obok krążka z erytromycyną w celu identyfikacji indukowanej oporności na makrolidy, linkozamidy,
streptograminy MLSB.
 11
4. Odczytaj i zinterpretuj wynik testu dwóch krążków wykrywajÄ…cego ES²L u paÅ‚eczek z
rodziny Enterobacteriaceae.
Antybiotyk/stężenie Wynik Interpretacja
Amoksycylina/kw. Ceftazydym (CAZ)
klawulanowy (AMC)
Cefotaksym (CTX)
Aztreonam (ATM)
 +  wynik pozytywny  pojawienie się dodatkowej strefy zahamowania wzrostu przy krążku
CAZ, CTX, ATM od strony krążka z inhibitorem AMC wskazuje na aktywność ES²L
 -  wynik ujemny