Ćwiczenie 3
Metody oznaczania stÄ™\
enia białka
WyciÄ…g z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych
" Kwas ortofosforowy  C
" Wodorotlenek sodu  C
" Miedzi (II) siarczan kryst. 5 hydrat  Xn, N
" Etanol 96% - F
SPEKTROFOTOMETRIA ABSORPCYJNA
W metodach spektrofotometrycznych wykorzystuje się zjawisko pochłaniania (selektywnej absorpcji)
promieniowania przez badane substancje w celu ich wykrycia, identyfikacji lub ilościowego oznaczenia, gdy\

cechÄ… charakterystycznÄ… ka\
dej substancji chemicznej jest zdolność do absorpcji ściśle określonych kwantów
promieniowania z zakresu widma elektromagnetycznego. Ze względu na wykorzystywany zakres widma (Tab. 1)
dokonuje się podziału na spektrofotometrię absorpcyjną w świetle widzialnym, zwaną kolorymetrią
i absorpcjometrię w nadfiolecie i podczerwieni. W badaniach analitycznych zastosowanie znalazła
absorpcjometria w zakresie światła widzialnego (VIS) oraz bliskiego ultrafioletu (UV). Absorpcja promieniowania
z tych przedziałów długości fal zale\
y głównie od ilości i rozmieszczenia elektronów w badanej cząsteczce, oraz
powoduje wzbudzenie cząsteczki danego związku polegające na przeniesieniu elektronów na wy\
szy poziom
energetyczny.
Rodzaj promieniowania Długość fali
promienie Å‚ poni\
ej 10 pm
promienie X 10 pm-10 nm
ultrafiolet daleki 10-200 nm
ultrafiolet bliski 200-390 nm
światło widzialne 390-800 nm
podczerwień 800 nm-1 mm
Mikrofale 1 mm-30 cm
Tabela 1 Widmo promieniowania elektromagnetycznego.
Ilościową miarą charakteryzującą zdolność pochłaniania promieniowania przez dany związek jest absorbancja
oznaczana literÄ… A (Uwaga: absorbancja zwana jest te\
ekstynkcjÄ… i oznaczana literÄ… E). Pomiar absorbancji
oparty jest na prawie Lamberta-Beera, które określa zale\
ność pomiędzy natę\
eniem promieniowania
padającego na roztwór danego związku (I ) a natę\
eniem promieniowania przechodzÄ…cego (I) przez warstwÄ™
o
badanej próbki zgodnie z poni\
szym wzorem:
A = log (Io / I) = kcl
1
A  absorbancja (ekstynkcja)
Io  natÄ™\
enie światła monochromatycznego o określonej długości fali padającego na roztwór
I  natÄ™\
enie światła po przejściu przez roztwór
k  współczynnik absorbancji właściwej dla danej długości fali, wielkość charakterystyczna dla danej
substancji (niezale\
na od jej stÄ™\
enia) i rozpuszczalnika dla danej długości fali, liczbowo równa
absorbancji roztworu o stÄ™\
eniu 1 mol/l i grubości warstwy l = 1 cm
c  stÄ™\
enie danego zwiÄ…zku (mol/l)
l  grubość warstwy absorbującej, standardowo l = 1 cm, gdy\
w badaniach biochemicznych grubość
stosowanych kuwet wynosi zwykle 1 cm
Badanie selektywnego pochłaniania promieniowania przez dany związek w zale\
ności od długości fali  pozwala
na wyznaczenie jego widma absorpcyjnego. Rozkład maksimów i minimów w widmie zale\
y od właściwości
barwnych związku (maksimum absorbancji określa barwę). Gdy zakres długości fal promieniowania
absorbowanego przez dany związek jest dostatecznie wąski, to związek ten ma barwę dopełniającą do barwy
absorbowanego promieniowania. Jeśli dany związek absorbuje promieniowanie o kilku barwach, to jego
ostateczna barwa jest kombinacją barw dopełniających do tych absorbowanych. Związki bezbarwne nie
pochłaniają fal w widzialnym obszarze widma, a z kolei związki czarne pochłaniają wszystkie długości fal. Dzięki
znajomości widma absorpcyjnego badanego związku mo\
liwe jest oznaczenie jego stÄ™\
enia (ilości) w roztworze,
gdy\
mo\
na wybrać światło monochromatyczne o takiej długości fali, która jest maksymalnie absorbowana przez
dany zwiÄ…zek. Do oznaczania stÄ™\
enia bezbarwnych związków stosuje się specjalne odczynniki, z którymi tworzą
one barwne pochodne.
A
Rys. 1 Widmo absorpcyjne
StÄ™\
enie badanej substancji w roztworze mo\
na obliczyć:
1. korzystając bezpośrednio z prawa Lamberta-Beera dokonując pomiaru absorbancji próby badanej (Ab)
i absorbancji próby wzorcowej o znanym stę\
eniu (Aw):
Ab/Aw = kcbl/kcwl = cb/cw Ò! cb = (Ab/Aw)cw
Ò!
Ò!
Ò!
Uwaga: Powy\
szÄ… zale\
ność mo\
na stosować tylko wtedy, gdy obserwuje się prostoliniową zale\
ność
między stę\
eniem danego zwiÄ…zku a mierzonÄ… absorbancjÄ….
2. stosujÄ…c krzywÄ… kalibracyjnÄ… (wzorcowÄ…, standardowÄ…)
Dokonuje się pomiaru absorbancji próby badanej (Ab) i absorbancji kilku prób wzorcowych o znanym
stÄ™\
eniu (Aw1...Awn), a po wykreśleniu zale\
ności absorbancji próbek wzorcowych (Aw) od ich stę\
enia
(cw) otrzymuje się prostą przechodząca przez początek układu współrzędnych. Znając absorbancję badanej
próby z krzywej wzorcowej odczytuje się stę\
enie zawartego w niej zwiÄ…zku, ale jedynie w jej prostoliniowym
zakresie.
Uwaga 1: Na osi odciętych odkłada się wartości stę\
eń, a na osi rzędnych  uzyskane wartości absorbancji.
Uwaga 2: Przyjmuje siÄ™, \
e absorbancja czystego rozpuszczalnika (w którym rozpuszczony się dany
związek) i względem, którego wykonuje się pomiary spektrofotometryczne wynosi zero. Ślepa odczynnikowa
2
(ślepa, próbka kontrolna) składa się ze wszystkich odczynników dodawanych w takiej samej ilości oraz takiej
samej kolejności jak miało to miejsce w przypadku próbki właściwej.
a
Absorbancja
b
StÄ™\
enie [mg/ml]
Rys. 2 Krzywe wzorcowe dla: a  roztworu stosujÄ…cego siÄ™ do prawa Lamberta-Beera, b  roztworu
wykazujÄ…cego przy du\
ych stÄ™\
eniach odchylania od praw absorpcji.
1. Oznaczanie zawartości białka metodą pomiaru w nadfiolecie
Aminokwasy nie absorbują światła widzialnego (tj. są one bezbarwne) i z wyjątkiem aminokwasów
aromatycznych (Trp, Tyr, Phe, His) nie absorbują równie\
światła nadfioletowego o długości powy\
ej 240 nm.
Białka natomiast absorbują światło nadfioletowe w paśmie 260-290 nm, ze względu na obecność w ich
łańcuchach aminokwasów aromatycznych (głównie reszt Trp i Tyr odpowiedzialnych za pochłanianie większości
światła ultrafioletowego). Zwykle odczytu absorbancji białek dokonuje się przy długości fali 280 nm, gdy\
Trp i Tyr
wykazują maksimum absorbancji właśnie przy tej długości fali. Przyjmuje się, \
e ilość zaabsorbowanego światła
jest proporcjonalna do ilości białka, ale ró\
ne ilości Trp i Tyr w poszczególnych białkach powodują utrudnienie
w ilościowej ocenie stę\
enia białka w roztworze tą metodą. Dodatkowo w tym samym zakresie światła UV
absorbują równie\
kwasy nukleinowe i nukleotydy, których maksimum pochłaniania jest przy długości fali 260 nm.
W zmodyfikowanej metodzie spektrofotometrycznej stÄ™\
enie białka w próbce określa się na podstawie
ró\
nicy absorbancji mierzonych przy długościach fal 260 i 280 nm stosując kuwetę kwarcową o grubości 1 cm,
a stÄ™\
enie białka wyra\
one w mg/ml oblicza siÄ™ wg wzoru podanego przez Layne a:
C = 1,55 A280  0,76 A260
białka * *
ZaletÄ… zmodyfikowanej metody spektrofotometrycznej jest mo\
liwość szybkiego określenia stę\
enia białka w
du\
ej ilości próbek bez konieczności korzystania z odnośnika białkowego i krzywej kalibracyjnej, równie\
przy
dokonywaniu pomiarów w małej ilości materiału w obecności du\
ych stÄ™\
eń NaCl czy (NH ) SO . Jest to metoda
4 2 4
wykorzystywana na przykład przy oznaczaniu stę\
enia białka we frakcjach uzyskiwanych podczas rozdziału
chromatograficznego na kolumnach. Ponadto metoda ta eliminuje wkład kwasów nukleinowych
w wartość mierzonej absorbancji, o ile ich zawartość w mieszaninie nie jest większa ni\
20%. Niemniej jednak
metoda ta jest obarczona du\
ym błędem i daje tylko przybli\
one wyniki, gdy\
zarówno białka, jak i kwasy
nukleinowe, nie dają identycznych wartości absorbancji maksymalnych przy jednakowych stę\
eniach. Ponadto,
równie\
inne związki małocząsteczkowe (puryny, pirymidyny, fenole) cechują się du\
a absorbancjÄ… przy 260 nm
i 280 nm.
Wykonanie
Zmierzyć wartość absorbancji próbki badanej przy długościach fal 260 i 280 nm wobec ślepej odczynnikowej tj.
roztworu/rozpuszczalnika, w którym jest rozpuszczone białko; w kuwecie kwarcowej o grubości 1 cm. Obliczyć
orientacyjną zawartość białka korzystając z podanego powy\
ej wzoru. Do kuwety odpipetować po 0,5 ml
roztworów próbek badanych P1, P2, P3 i P4.
2. Oznaczanie zawartości białka metodą mikrobiuretową
Zasada oznaczania  patrz metoda biuretowa Piotrowskiego (Ćwiczenie 2).
3
Dzięki zastosowaniu spektrofotometrycznego pomiaru absorbancji fiołkowego kompleksu powstającego na
skutek reakcji jonów miedzi w środowisku zasadowym z wiązaniami peptydowymi, przy długości fali 310 nm
uzyskuje się 50-krotny wzrost czułości oryginalnej metody biuretowej opracowanej przez Itzhaki i Gill (Itzhaki RF,
Gill DM (1964) Anal Biochem 9: 401-10). Dodatkowo, opcjonalne traktowanie oznaczanej próby 0,5 M roztworem
NaOH zamiast wody, umo\
liwia oznaczenie zawartości białka w płynach biologicznych, homogenatach
komórkowych czy frakcjach subkomórkowych. Rodzaj oznaczanego białka nie ma wpływu na wartość mierzonej
absorbancji.
Wykonanie
Przygotować próbki serii A i B wg Tabeli 1. Do ka\
dej probówki serii A dodać po 0,25 ml 0,21% roztworu
CuSO 5H O w 30% roztworze NaOH, a do probówek serii B  po 0,25 ml 30% roztworu NaOH. Zawartość
4* 2
eppendorfów wymieszać i po upływie 5 minut zmierzyć w spektrofotometrze UV-VIS absorbancję wszystkich
próbek przy długości fali 310 nm. Absorbancję próbek serii A odczytać wobec ślepej odczynnikowej Ao (parametr
A dla ka\
dej próbki serii A), natomiast absorbancję próbek serii B wobec ślepej odczynnikowej Bo (parametr B).
Absorbancję właściwą wszystkich oznaczanych prób obliczyć z ró\
nicy A-B. Na podstawie otrzymanych wartości
absorbancji właściwej dla wzorcowych roztworów BSA uzupełnić Tabelę 1 i wykreślić krzywą kalibracyjną
zale\
ności zmierzonych absorbancji od stę\
enia białka. Z krzywej kalibracyjnej odczytać zawartość białka
w badanych próbkach P1, P2, P3 i P4.
Uwaga: wszystkie oznaczenia wykonywać w trzech równoległych powtórzeniach.
3. Oznaczanie zawartości białka metodą Bradforda
Bradford MM (1976) Anal Biochem 72: 248-54.
W metodzie Bradforda wykorzystywana jest zdolność wiązania się barwnika zwanego błekitem
kumazyny (ang. Coomassie Brilliant Blue G-250) z białkiem za pomocą wiązań jonowych i hydrofobowych.
Z barwnikiem reagują głównie reszty argininy, a w minimalnym stopniu reszty histydyny, lizyny, proliny, tryptofanu
i tyrozyny. W środowisku kwaśnym (w roztworze kwasu H PO ) błękit kumazyny przyjmuje zabarwienie brunatne.
3 4
Dodanie błękitu kumazyny do roztworu białka powoduje powstawanie kompleksu o intensywnie niebieskim
zabarwieniu i przesunięcie maksimum absorbancji barwnika z 465 nm do 595 nm. Efekt ten jest konsekwencją
występowania barwnika w dwóch ró\
nych formach  brunatnej i niebieskiej. Forma brunatna ulega konwersji do
niebieskiej po związaniu się barwnika z białkiem. Wiązanie to jest procesem bardzo szybkim (poni\
ej 2 minut), a
kompleks barwnik-białko pozostaje trwały i nie agreguje w roztworze przez stosunkowo długi czas (do 60 minut).
NatÄ™\
enie barwy niebieskiej jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze. Optymalny czas pomiaru
wynosi od 5 do 20 minut od dodania odczynnika Bradforda do próbki. Zaletami metody są prostota
i szybkość wykonania, oraz jej czułość (białko mo\
e być wykryte przy jego stę\
eniu w granicach 2-8 µg/ml).
Oznaczenie mo\
na wykonywać w obecności powszechnie stosowanych buforów, wersenianu sodu (EDTA),
jonów magnezu, sacharozy, glikolu i związków tiolowych. Wadą metody jest ró\
ne wiązanie barwnika przez ró\
ne
białka, a ponadto fakt, \
e aceton, siarczan dodecylu sodu (SDS) i Triton X-100 dają w połączeniu
z barwnikiem dodatkowy interferujący kolor, co zwiększa natę\
enie barwy niebieskiej i przeszkadza w uzyskaniu
wiarygodnych wyników.
Wykonanie
Przygotować ślepą odczynnikową, wzorce oraz próbki badane wg Tabeli 2. Do ka\
dej próbki dodać po 250 µl 5-
krotnie rozcieńczonego odczynnika Bradforda. Po upływie minimum 5 minut (a przed upływem 20 minut) od
momentu dodania odczynnika Bradforda, zmierzyć w czytniku do płytek titracyjnych wartości OD wszystkich
próbek przy długości fali 595 nm. Na podstawie otrzymanych wartości OD uzupełnić Tabelę 2. Od wartości
595
OD dla wzorców i próbek badanych odjąć wartość OD ślepej odczynnikowej. Wykreślić krzywą kalibracyjną
595 595
zale\
ności zmierzonych OD od stę\
enia białka. Z krzywej kalibracyjnej odczytać zawartość białka w badanych
595
próbkach P1, P2, P3 i P4.
Uwaga: wszystkie oznaczenia wykonywać w trzech równoległych powtórzeniach.
Odczynniki
wzorcowe roztwory BSA o stÄ™\
eniu 1mg/ml i 0,5 mg/ml; roztwory badanych próbek P1, P2, P3 i P4;
30% roztwór NaOH ; 0,21% roztwór CuSO 5H O w 30% NaOH; odczynnik Bradforda: 0,01% (w/v) błękit
4* 2
kumazyny, 4,7% (w/v) etanol, 8,5% (w/v) kwas ortofosforowy
4