Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii
Katedra Biologii Molekularnej
Przedmiot: Biologia Molekularna z BiotechnologiÄ… Biologia II rok
========================================================
Ćwiczenie 4
Klonowanie DNA
Prowadzący: mgr Katarzyna Kozłowska i mgr Joanna Tymecka
Klonowanie DNA - technika ta polega na umiejętności otrzymywania zrekombinowanych
cząsteczek DNA i ich wprowadzania do organizmu, który zapewnia ich amplifikację i
ekspresjÄ™. Polega na Å‚Ä…czeniu czÄ…steczki wektora z badanym fragmentem DNA tzw.
 wstawką i wprowadzeniu takiej hybrydowej cząsteczki DNA do organizmu, w którym
ulegnie ona amplifikacji. Fragmenty DNA będące przedmiotem klonowania uzyskuje się
m.in. przy użyciu metody PCR. Zarówno otrzymane fragmenty DNA jak i wektor trawi się
tymi samymi enzymami restrykcyjnymi, następnie łączy się obydwie składowe za pomocą
ligazy DNA. Powstałe zrekombinowane cząsteczki DNA wprowadza się metodą
transformacji do odpowiednio przygotowanych komórek biorcy.
 wstawka
Ligacja plazmidu ze  wstawką (ćwiczenie 3)
plazmid ze  wstawkÄ… gotowy do
wprowadzenia do bakterii
1
1. Ligacja
Ligaza DNA - enzym łączący wolne końce cząsteczek DNA. A
ączenie DNA następuje
poprzez wytworzenie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy końcem hydroksylowym 3` a
końcem fosforowym 5` w reakcji zależnej od adenozynotrójfosforanu (ATP). Reakcja
katalizowana przez ligazÄ™ to ligacja.
Przykład działania ligazy (łączenie fragmentów DNA z lepkimi końcami):
5'-AGTCTGATCTGACT-3' 5'-GATGCGTATGCTAGTGCT-3'
3'-TCAGACTAGACTGACTACG-5' 3'-CATACGATCACGA-5'
Powstaje:
5'-AGTCTGATCTGACTGATGCGTATGCTAGTGCT-3'
3'-TCAGACTAGACTGACTACGCATACGATCACGA-5'
W tej reakcji tworzą się dwa rodzaje wiązań - wodorowe pomiędzy nukleotydami
komplementarnymi w obrębie lepkich końców (a właściwie ich zasadami azotowymi) i
fosfodiestrowe pomiędzy pierwszym i ostatnim nukleotydem łączących się łańcuchów (a
właściwie ich cząsteczkami deoksyrybozy). Wiązania wodorowe tworzą się spontanicznie,
natomiast tworzenie wiązań fosfodiestrowych katalizuje właśnie ligaza DNA. Możliwa (choć
mniej wydajna) jest też ligacja fragmentów zakończonych tępymi końcami. W tej reakcji
powstają tylko nowe wiązania fosfodiestrowe. Ligacja lepkich końców DNA jest znacznie
wydajniejsza ponieważ tworzące się wiązania wodorowe przytrzymują razem oba końce, co
ułatwia reakcję.
2. Transformacja
Transformacja komórek bakteryjnych to proces aktywnego pobierania wolnego DNA ze
środowiska. Transformacja komórek bakteryjnych, obok koniugacji i transdukcji, jest
jednym z mechanizmów horyzontalnego transferu genów. Opisał go Griffith w 1928 roku u
Streptococcus pneumoniae. W eksperymencie tym dowiedziono, że żywe, niezjadliwe,
bezotoczkowe szczepy nabyły właściwości patogenne od chorobotwórczego, martwego
szczepu z otoczkÄ… polisacharydowÄ…. Transformacja jest procesem raczej korzystnym dla
biorców, ponieważ pobrany DNA może być składnikiem pokarmowym, brać udział w
naprawie uszkodzeń DNA biorcy i prowadzić do nabycia nowych cech dających przewagę
transformantowi w środowisku.
Stan kompetencji to zdolność komórek bakteryjnych do pobierania DNA w procesie
transformacji. Niektóre bakterie posiadają naturalny stan kompetencji, są nimi
na przykład organizmy z rodzaju Bacillus, Haemophilus, Staphylococcus, czy też
Streptococcus. W przypadku komórek Escherichia coli niezbędne jest wprowadzenie stanu
kompetencji poprzez działanie czynnikami chemicznymi bądz
fizycznymi. Czynnikami
takimi mogą być bufory zawierające dwuwartościowe kationy (np. Ca2+, Mn2+, Rb2+), które
destabilizują błonę komórkową (mechanizm nie jest dobrze poznany). Wejście DNA do
komórek, bezpośrednio z otaczającego je roztworu, ma miejsce dzięki szokowi termicznemu.
Wprowadzany DNA jest w formie dwuniciowego i koliście zamkniętego plazmidu. Liniowy
DNA nie utrzymuje się w komórce i jest szybko degradowany. DNA może także zostać
wprowadzony do elektrokompetentnych komórek poprzez elektroporację. Proces ten także
polega na destabilizacji błony komórkowej: silne pole elektryczne (krótki impuls prądu
2
elektrycznego o napięciu ok. 1,6-2,5 kV) powoduje powstanie przejściowych porów
w błonie, przez które mogą przenikać cząsteczki DNA.
Wydajnością procesu transformacji nazywamy ilość transformantów (kolonii powstałych na
podłożu selekcyjnym) na mikrogram DNA użytego do transformacji (jednostka: cfu/źg
DNA).
3. Zagadnienia
·ð Ligacja (warunki reakcji; ligazy  mechanizm dziaÅ‚ania, fosfataza alkaliczna)
·ð Komórki kompetentne (stan kompetencji)
·ð Transformacja (warunki i mechanizm procesu; selekcja klonów; wydajność procesu;
przeszukiwanie transformantów)
·ð Antybiotyki (mechanizm dziaÅ‚ania; mechanizm antybiotykoopornoÅ›ci)
3
4. Literatura
·ð  Krótkie wykÅ‚ady  biologia molekularna P.C. Turner, A.G. McLennan, A.D. Bates,
M.R.H. White
·ð  Genetyka molekularna Piotr WÄ™gleÅ„ski
·ð  Biochemia Stryer Lubert
·ð  Podstawowe techniki inżynierii genetycznej T. Kaczorowski
5. Protokół do ćwiczeń
Przygotowanie mieszaniny ligacyjnej
1. Do jałowej probówki Eppendorfa dodać kolejno:
·ð 2 źl DNA plazmidu przeciÄ™tego dwoma enzymami restrykcyjnymi
·ð 6 źl tzw.  wstawki czyli fragmentu DNA amplifikowanego na poprzednich
zajęciach i trawionego tymi samymi enzymami co plazmid
·ð 1 źl buforu ligacyjnego stężonego 10x (bufor zawiera już 5mM ATP)
·ð 1 źl ligazy DNA faga T4 (1 jednostka)
2. Zawartość probówki dokładnie wymieszać
3. ProbówkÄ™ inkubować w temperaturze 22°C przez godzinÄ™
4. Inaktywacja 10 min. w 65ÚC - opcjonalnie
Przygotowanie komórek kompetentnych metodą chlorkową
1. Pojedynczą kolonią bakteryjną zaszczepić 2 ml pożywki LB i hodować przez noc z
wytrzÄ…saniem
2. Odmłodzić hodowlę przez przeniesienie 100 źl hodowli nocnej do 10 ml świeżej
pożywki LB
3. Hodować z wytrząsaniem do OD575 = 0,2
4. Wirować 4000 obr/min. przez 10 min. w temperaturze 4°C
Osad bakteryjny zawiesić w 5 ml schłodzonego w lodzie 100mM roztworu CaCl2
5.
6. Inkubować zawiesinę bakterii w lodzie przez 30 min.
7. Wirować 4000 obr/min. przez 10 min. w temperaturze 4°C
8. Osad zawiesić w 1 ml schłodzonego w lodzie 100mM roztworu CaCl2 i inkubować w
temperaturze 4°C przez minimum 60 minut a najlepiej przez noc
Transformacja bakterii zrekombinowanym DNA
1. Na lodzie przygotować 3 probówki Eppenorfa zawierające po 50 źl komórek
kompetentnych. Dodać do nich kolejno:
- 1-2 źl mieszaniny ligacyjnej
- 1-2 źl niepotrawionego plazmidu będącego próbą dodatnią eksperymentu
- w trzeciej probówce pozostawić tylko komórki kompetentne będące próbą negatywną
eksperymentu
Delikatnie przepipetować.
2. Inkubować próbki w lodzie przez minimum 30 minut
3. Przenieść próbki na 60-90 sekund do 43°C  szok temperaturowy
4
4. Przenieść próbki na 2 minuty do lodu  cold shock
5. Dodać 500 źl pożywki LB (bez antybiotyku) i hodować z wytrząsaniem
w temperaturze 37°C przez minimum 40 minut (max. 60 minut)
6. Zwirować próbki - 2 min. przy 2-3 tyś. obr./min.
7. Na wysuszone płytki LA z antybiotykiem przenieść ok. 100źl hodowli
8. Zawiesinę rozetrzeć jałową głaszczką po całej powierzchni podłoża
9. PÅ‚ytki inkubować przez noc w temperaturze 37°C
10. Policzyć wydajność transformacji.
5