1
EFEKT FOTODYNAMICZNY
Zagadnienia do przygotowania:
stany wzbudzone cząsteczek, multipletowość, stan singletowy, stan tripletowy,
zjawisko fluorescencji, zjawisko fosforescencji, wolne rodniki, reaktywne formy tlenu,
wzory chemiczne aminokwasów, zasad purynowych i pirymidynowych, peroksydacja
lipidów.
Wprowadzenie
Efekt fotodynamiczny (FD) to zespół zjawisk indukowanych światłem
w obecności uczulacza i tlenu prowadzących do trwałego uszkodzenia struktur
i zaburzenia funkcji układów biologicznych. U podstaw efektu leżą reakcje
fotouczulane (RF), w których energia promieniowania pochłonięta przez odpowiedni
chromofor (uczulacz) jest wykorzystywana do przemian chemicznych substratu
takich jak utlenianie, redukcja, izomeryzacja, przyłączanie pewnych grup lub
degradacja.
Gdy w RF bierze udział tlen cząsteczkowy to określamy je mianem reakcji
fotouczulanego utleniania (FU). Końcowy efekt działania światła w obecności tlenu
i uczulacza jest wynikiem nie tylko reakcji fotoutleniania ale również wielu procesów
wtórnych, często nie związanych bezpośrednio z samym fotoutlenieniem.
Zatem do końcowych skutków feakcji fotouczulanych należą:
 peroksydacja lipidów i zmiana płynności błon komórkowych
 powstawanie wiązań krzyżowych pomiędzy cząsteczkami białek, białek
i lipidów oraz białek i DNA
 anomalie i zatrzymanie podziałów komórkowych
 zanik zdolności naprawy DNA
 mutacje
 śmierć komórki
U zwierząt wyższych obserwuje się zaczerwienienia skóry, opuchliznę,
nekrozę tkanki i ogólne zatrucie organizmu, jeżeli produkty reakcji fotouczulanej
przedostaną się do krwioobiegu lub gdy nastąpi tworzenie fotouczulacza
w organizmie (np. synteza nietypowej dla organizmu porfiryny).
2
Molekularne tarcze efektów fotodynamicznych
W celu ustalenia najbardziej prawdopodobnej tarczy uczulanego
fotoutleniania i poznania mechanizmów molekularnych prowadzących do
uszkodzenia lub śmierci komórki badano fotolabilność składników komórkowych,
takich jak: białka strukturalne i enzymatyczne, kwasy nukleinowe, lipidy błon.
Białka
Wykazano, że fotouczulane utlenianie białek powoduje utratę ich
biologicznych funkcji. Fotouczulana inaktywacja enzymów wynika z destrukcji
ważnych reszt aminokwasowych w miejscu aktywnym lub w bliskim otoczeniu
miejsca aktywnego. Działanie fotodynamiczne niszczy właściwości antygenowe
białek i pozbawia je zdolności oddziaływania z przeciwciałem.
Wyraz
nym modyfikacjom ulegają głównie reszty aminokwasów aromatycznych
(histydyna, tyrozyna, tryptofan) oraz siarkowych (metionina, cysteina).
Modyfikacje konformacyjne białek wpływają na zmiany :
 rozpraszania światła
 ruchliwości elektroforetycznej
 rozpuszczalności
 lepkości
 własności sedymentacyjnych
 wrażliwości na temperaturę i enzymy proteolityczne
 liczby grup -SH
Lipidy
Ważną grupę związków podatnych na fotoutlenianie stanowią nienasycone
lipidy (kwasy tłuszczowe, trójglicerydy, fosfolipidy) oraz związki rozpuszczalne
w nienasyconych lipidach (cholesterol, �-karoten, sterole, tokoferole, witamina D).
W wyniku fotouczulanego utleniania następuje peroksydacja lipidów, której efektem
jest:
 wzrost przepuszczalności błony dla jonów
3
 utrata płynności błony
 utworzenie wiązań krzyżowych między cząsteczkami lipidów i białek
 inaktywacja enzymów i receptorów błonowych
Procesy te prowadzą do destrukcji błon biologicznych i mogą być z
ródłem
kancerogenezy.
Kwasy nukleinowe
Utrata aktywności biologicznej kwasów nukleinowych pod wpływem działania
fotodynamicznego jest wynikiem fotoutlenianej destrukcji guaniny. Wykazano, że
reakcje wtórne zachodzące już po samym fotoutlenieniu mogą prowadzić do
kowalencyjnego sprzęgania cząsteczek kwasów nukleinowych i białek.
Uczulane fotoutlenianie kwasów nukleinowych powoduje utratę zdolności
zakaz
nych wirusowego RNA i DNA, utratę aktywności transformującej DNA,
hamowanie aktywności translacyjnej oraz zmianę właściwości antygenowych.
Obserwuje się również zmiany:
 lepkości
 temperatury topnienia DNA
 zachowania polarograficznego
 wrażliwości na enzymy proteolityczne
Ze względu na swą lokalizację, kwasy nukleinowe w układach komórkowych
są jednak mało prawdopodobnym celem dla promieniowania widzialnego .
Dla każdego uczulacza i obiektu poddanego promieniowaniu pierwotne
uszkodzenia mogą być różne. Czy wcześniejsze są modyfikacje białek
strukturalnych czy funkcjonalnych, lipidów błon, DNA czy RNA, oraz jakie funkcje
komórek najłatwiej zaburzyć  to wszystko zależy od natury uczulacza, jego
mikrotopografii w komórce, od przepuszczalności błon i od efektywności
komórkowych mechanizmów ochronnych.
4
Mechanizm efektu fotodynamicznego
Schemat reakcji fotouczulanych można przedstawić następująco:
3
O2
R* Aox Typ 1
3
O2
1
SS* O2 Aox Typ 2
A
B Typ 3
gdzie:
S i S*  stan podstawowy i wzbudzony uczulacza
A  substrat reakcji fotouczulanych
3
O2 i 1O2  stan podstawowy (tripletowy  spiny elektronów równoległe)
i elektronowo wzbudzony (singletowy  spiny elektronów
antyrównoległe) tlenu cząsteczkowego
RŁ  rodnikowa forma substratu
Aox  produkt fotoutleniania
B  produkt reakcji fotoutleniania bez udziału tlenu
W reakcjach fotouczulanych typu 1 produkt powstaje w wyniku oddziaływania
rodnikowych form substratu z tlenem cząsteczkowym w stanie podstawowym. Formy
rodnikowe substratu powstają w reakcji substratu ze wzbudzonym uczulaczem.
W reakcjach typu 2 energia wzbudzenia uczulacza jest wykorzystywana do
aktywacji tlenu cząsteczkowego, czyli do tworzenia wysoce reaktywnych form tlenu
singletowego. W reakcjach typu 3 elektronowo wzbudzony uczulacz indukuje
przeniesienie elektronu (lub wodoru) między cząsteczkami substratu i uczulacza lub
przyłączenie uczulacza do substratu  wytworzenie adduktów.
Promieniowanie pochłonięte przez uczulacz wzbudza jego cząsteczki przenosząc
5
elektrony walencyjne na wyższe poziomy energetyczne:
1
S + h� 6 S* przejście w stan singletowy wzbudzony
Czas życia tego stanu jest rzędu piko-, nanosekund i zależy od efektywności
procesów dezaktywacji:
1
1. S* v S + h�F emisja promieniowania w postaci
fluorescencji
1
2. S* v S + ciepłowewnętrzna konwersja, czyli
bezpromienista dyssypacja energii
1 3
3. S* v S* interkombinacyjna konwersja, czyli
przejście bezpromieniste ze stanu
singletowego w tripletowy
1
4. S* v S + hvP emisja promieniowania w postaci
fosforescencji
Czas życia wzbudzonego stanu tripletowego jest stosunkowo długi  rzędu mikro-,
milisekund. Z uwagi na to prawdopodobieństwo wykorzystania energii wzbudzenia
jest znacznie większe niż dla stanu singletowego. Ponadto stan tripletowy umożliwia
efektywny transfer energii na cząsteczki tlenu, które w stanie podstawowym są
tripletami.
Mechanizmy wykorzystania energii wzbudzenia uczulacza mogą być różne.
Proponuje się kilka schematów:
1. S* + A v S + A gaszenie
3 1
2. S* + O2 v O2* + S międzycząsteczkowy transfer
1
O2* + A v Aox energii, aktywacja O2, powstanie
1
O2, który jest odpowiedzialny za reakcje
typu 2
6
3. S* + O2 v ŁS+ + OŻ
Ł
2
4. S* + A v SŻ + A+Ł powstawanie rodników
Ł
SŻ + O2 v S + OŻ
Ł Ł
2
Tlen singletowy, z uwagi na swą wysoką reaktywność, odgrywa dużą rolę
w procesach FD. Ponieważ energia wyższego stanu wzbudzonego wynosi zaledwie
37 kcal/mol, czyli mniej niż jednego mola fotonów o  = 700 nm, to teoretycznie
każdy uczulacz pochłaniający światło może generować cząsteczki tlenu
singletowego.
Tlen singletowy może reagować wprost z nienasyconymi resztami lipidów, a także
z cholesterolem, dając hydronadtlenki (LOOH).
Wydajność I przebieg reakcji fotodynamicznych
Przebieg reakcji fotodynamicznych modyfikują czynniki fizykochemiczne: lokalne
stężenie i ruchliwość tlenu, donorów i akceptorów, jonów wodoru (pH), metali
ciężkich i niesparowanych elektronów, jak też temperatura, stężenie i stopień
agregacji barwnika.
Zjawiska związane z reakcjami fotodynamicznymi powodują bardzo poważne
następstwa, efekt jest często silniejszy niż przy bezpośrednim działaniu
promieniowania wysokoenergetycznego, mimo, że kwanty promieniowania
widzialnego niosą stosunkowo mało energii: od 41 ( = 700 nm) do 82 ( = 350 nm)
kcal/mol.
Wydajność fotouczulanego utleniania zależy w dużej mierze od efektywności
obsadzenia stanu tripletowego, która z kolei jest uzależniona od struktury
elektronowo-atomowej uczulacza. Cząsteczka w stanie tripletowym może mieć
dłuższy czas życia, ponieważ kwantowo-mechaniczne reguły wyboru nie zezwalają
na przejścia interkombinacyjne. Nie znaczy to jednak, że są one niemożliwe.
Niezerowe prawdopodobieństwo takich przejść można tłumaczyć w ramach teorii
zaburzeń, która przewiduje, że w wyniku spin-orbitalnego oddziaływania (S-L)
następuje mieszanie stanów singletowych i tripletowych. Wielkość oddziaływania S-
L zależy od struktury atomowej cząstek oraz od obecności w ich otoczeniu układów
7
zawierających atomy ciężkie lub niesparowane elektrony. Przebieg i wydajność
procesów fotodynamicznych zależy też od wstępnego oddziaływania substratu i
uczulacza. Kompleksowanie cząsteczek tych dwóch związków ogranicza giętkość
i swobodę ruchów uczulacza, co może wpływać na procesy dezaktywacji
wzbudzenia elektronowego. Przestrzenne zbliżenie donora i akceptora energii
ułatwia ponadto jej przekazywanie i transformację w dalszych etapach FD.
Istotny wpływ na wydajność fotoutleniania ma też efektywność pochłaniania światła
przez uczulacz, której miarą jest współczynnik absorpcji g.
Znaczenie procesów fotodynamicznych
Zainteresowanie badaczy problematyką FD wynika zarówno z poważnych
następstw tych efektów, jak również z powszechnego występowania wielu
uczulaczy. Zaliczamy do nich m.in.: ksantyny, tiazyny, akrydyny, antybiotyki,
antracykliny, związki tiofenowe, a także barwniki endogenne występujące
w organizmach roślinnych i zwierzęcych  protoporfiryna, retinal, chlorofil, bilirubina.
W pewnych warunkach barwniki endogenne są zdolne do wywołania zjawisk
fotodynamicznych in vivo. Dzia łanie fotodynamiczne może towarzyszyć
chemioterapii. Znanym lekom psychotropowym (chloropromazyna i chlorochinina)
przypisuje się działanie uboczne w przypadku długotrwałego ich podawania, przy
czym efekty te nasilają się pod wpływem światła słonecznego.
Zjawiska fotodynamiczne znalazły zastosowanie w terapii nowotworów i innych
schorzeń skóry. Metoda ta polega na lokalnym naświetlaniu chorego miejsca po
uprzednim wprowadzeniu do układu uczulacza. Do najczęściej stosowanych
w terapii nowotworów uczulaczy należą pochodne hematoporfiryny, które wykazują
dobre właściwości absorpcyjne w obszarze widzialnym i znaczne powinowactwo do
komórek nowotworowych.
Wykonanie ćwiczenia (wersja ze skryptu)
I.Fotoutlenianie NADH
Odczynniki:
bufor fosforanowy pH 7,2;
8
1 mM roztwór Różu Bengalskiego (RB);
10 mM roztwór NADH.
Przyrządy:
z
ródło silnego światła o widmie ciągłym (lampa Xe lub lampa rzutnika);
filtry szerokopasmowe zielone i niebieskie wraz z widmami transmisji
spektrofotometr
1 cm kwarcowa kuweta spektrofotometryczna
5 probówek
stoper
folia aluminowa
pipety i końcówki, cylindry miarowe o pojemności 10 ml i 25 ml.
Kolejne czynności:
1. Do kuwety spektrofotometrycznej nalać 3 ml buforu fosforanowego (pH 7,4)
i wykonać pomiar absorpcji odnośnika.
2. W cylindrze 25 ml przygotować 15 ml roztworu Różu Bengalskiego (RB)
o stężeniu 10 �M.
3. Zmierzyć widmo absorpcji przygotowanego roztworu RB. Zanotować
absorbancję przy 340 nm i 548 nm. Na podstawie otrzymanych danych
oznaczyć współczynnik ekstynkcji RB odpowiednio przy 340 nm i 548 nm. Po
pomiarze roztwór z kuwety spektrofometrycznej przelać z powrotem do
naczynia z resztą próbki.
4. W cylindrze 10 ml przygotować 10 ml 0,1 mM roztworu NADH.
5. Zmierzyć widmo absorpcji przygotowanego roztworu NADH. Zanotować
absorbancję przy 340 nm i 548 nm. Na podstawie otrzymanych danych
oznaczyć współczynnik ekstynkcji NADH przy 340 nm. Po pomiarze roztwór z
kuwety spektrofometrycznej przelać z powrotem do naczynia z resztą próbki.
9
6. Do próbki zawierającej RB wstrzyknąć odpowiednią ilość NADH tak, aby jego
stężenie w próbce wynosiło 0,1 mM.
7. Zmierzyć widmo absorpcji przygotowanego roztworu NADH. Zanotować
absorbancję przy 340 nm i 548 nm. Po pomiarze roztwór z kuwety
spektrofometrycznej przelać z powrotem do naczynia z resztą próbki.
8. Przygotowane roztwory rozdzielić do odpowiednich naczyń (po 5 ml)
i naczynia podpisać.
9. Jedną z próbek zawierającą RB i NADH zawinąć w folię i w miarę możliwości
chronić przed dostępem światła. Zanotować czas rozpoczęcia inkubacji
w ciemności.
10 Dwie próbki zawierające NADH i RB naświetlać, odpowiednio przez filtr
niebieski i zielony, przez 15 s. Następnie przerwać naświetlanie i zmierzyć
widma absorpcji (za każdym razem po pomiarze roztwór z powrotem
wprowadzamy do próbki). Monitorować zmiany absorbancji próbek
w zależności od czasu naświetlania (np. co 15 s). Wyniki wpisywać do tabelki.
11. To samo powtórzyć dla próbek zawierających tylko NADH.
12. Zmierzyć absorbancję próbki NADH+ RB inkubowanej w ciemności.
13. Sporządzić wykresy zależności stężenia NADH od czasu naświetlania lub
inkubacji w ciemności dla wszystkich mierzonych próbek.
14. Porównać ilość zużytego w trakcie naświetlania NADH i RB.
15. Krótko przedyskutować otrzymane wyniki.
10
Czas Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka Próbka 5
naś- RB+NADH RB+NADH NADH 4 RB+NADH
wiet- Filtr niebieski Filtr zielony Filtr NADH ciemność
Czas
lania (s)
niebieski Filtr
(s)
zielony
A340 A548 A340 A548 A340 A340 A340 A548
II.Wpływ reakcji fotouczulanych Różem Bengalskim na żywotność pantofelków
(Paramecium caudatum)
Odczynniki:
Zawiesina pantofelków Paramecium caudatum
1 mM roztwór Różu Bengalskiego (RB);
Przyrządy:
z
ródło silnego światła o widmie ciągłym (lampa Xe lub lampa rzutnika);
filtry szerokopasmowe wraz z widmami transmisji
mikroskop lub lupa
5 probówek
stoper
folia aluminowa
pipety i końcówki
Kolejne czynności:
11
1. Przygotować 5 szalek zawierających po 3 ml zawiesiny pantofelków.
Zaobserwować pod mikroskopem ich wygląd oraz ruchliwość. Do trzech
szalek dodać po 20 �l 1 mM RB, po czym jedną z nich owinąć szczelnie folią i
w miarę możliwości chronić przed światłem.
2. Dwie szalki zawierające panofelki i RB naświetlać, odpowiednio przez filtr
niebieski i zielony, przez 15 s. Następnie przerwać naświetlanie i sprawdzić
pod mikroskopem wygląd i zachowanie pantofelków. Monitorować zmiany
zachowania oraz wyglądu w zależności od czasu naświetlania (np. co 15 s).
3. Po czasie potrzebnym na zaobserwowanie wyraz
nych zmian w naświetlanej
próbce zawierającej pantofelki oraz RB, porównać pantofelki inkubowane z
fotouczulaczem w ciemności.
4. Przeprowadzić naświetlanie pantofelków pod nieobecność RB jak w p. 2.
5. Zapisać i krótko przedyskutować obserwacje.
Literatura:
S. Paszyc  Podstawy fotochemii PWN, Warszawa 1992.
G. Bartosz  Druga twarz tlenu PWN, Warszawa 1995.
 Zarys fotodynamicznej diagnostyki i terapii nowotworów  praca zbiorowa pod red.
A. Sieronia, L medica Press 1997.
12
Wykonanie ćwiczenia - wersja obecnie realizowana 2003-2006 (modyfikacja -
Tomasz. Panz)
Na podstawie wiadomości zawartych w skrypcie należy zaprojektować i wykonać
doświadczenia, które sprawdzałyby następujące hipotezy na temat dostarczonej
substancji X:
1. Substancja X pochłania światło w zakresie widzialnym
a. w jaki sposób zmierzyć widmo substancji X?
b. w którym miejscu widma najlepiej mierzyć pochłanianie światła przez
substancję X?
c. jaki jest molowy współczynnik ekstynkcji substancji X?
2. Światło pochłaniane przez substancję X jest zdolne do destrukcji
aromatycznych aminokwasów, np. tryptofanu (jak to sprawdzić?)
3. Światło pochłaniane przez substancję X jest zdolne do uszkodzenia komórek
pierwotniaków
4. Obok światła i substancji X także i tlen wydaje się mieć znaczenie
w procesach wspomnianych w punktach 2 i 3.
Podczas ćwiczeń należy zrealizować co najmniej dwa punkty z podanej listy.
Pracę należy rozpocząć od sporządzenia szczegółowego planu doświadczeń
i odpowiadającej temu planowi tabeli wyników. Przy planowaniu eksperymentów
trzeba dokładnie określić CO JEST WIELKOŚCI
OBSERWOWAN
, jaki parametr
kontrolujemy i zmieniamy; należy także starannie przeprowadzić pomiary kontrolne.
W razie potrzeby proszę zadawać pytania dodatkowe asystentowi.
Masz do dyspozycji:
Substancję X, zawiesinę pantofelków Paramecium caudatum, wodę, roztwór
tryptofanu, naczynia laboratoryjne, spektrofotometr, z
ródło światła widzialnego,
gazowy azot, pipety, końcówki do pipet, stoper.
13
UWAGI dla asystenta:
Dobre stężenia, które można użyć przy planowaniu doświadczeń:
błękit metylenowy 6*10-4 M, m.cz. 320 (3.84 mg/20 ml H2O)
czerwień fenolowa 1.8 * 10-3 M m. cz. 372, stęż. 1.8*10-3 M (14.9/20 ml)
Tryptofan (m.cz. 204.23) : stężenie 1.5 * 10-4 M (7.66 mg/250 ml)
Róż bengalski (m.cz. 1057): 1.0*10-3 M (5.285 mg/5 ml)