Temat: Szybkie metody kontroli:
Możliwość szybkiego sprawdzenia poprawności
KONTROLA SKUTECZNOÅšCI
wykonywanej pracy
MYCIA I DEZYNFEKCJI działa mobilizująco na pracowników
produkcyjnych i wykonujÄ…cych
zabiegi mycia i dezynfekcji.
Szybkie metody kontroli
Zasada luminometrii:
W każdej żywej komórce oraz materiałach pochodzenia
biologicznego obecny jest adenozynotrifosforan (ATP).
Luminometria
Wzór:
C10H13N5O13P3Na3
Masa czÄ…steczkowa:
573,1 (acid form: 507,2)
Zasada luminometrii: Zasada luminometrii:
Podczas hydrolizy ATP do ADP i ortofosforanu lub do
AMP i pirofosforanu uwalniana jest pewna ilość energii
swobodnej, którą można zmierzyć jako emisję kwantów
światła.
Zjawisko to nosi nazwÄ™ chemiluminescencji,
a w przypadku katalizowania jej przez enzym -
bioluminescencji.
1
Zasada luminometrii: Zasada luminometrii:
Intensywność wydzielanego światła jest proporcjonalna Obecność ATP wskazuje na istnienie zanieczyszczeń
do ilości ATP obecnego w środowisku. organicznych na badanej powierzchni.
ATP + lucyferyna + lucyferaza + Mg2+ Pomiar ATP informuje o ilości obecnego materiału
biologicznego poprzez liczbową wartość tzw.
“!
umownych jednostek luminescencyjnych (RLU).
Oksy-lucyferyna + AMP + CO2 + światło
Luminometria: Luminometria:
Zawartość ATP w materiale organicznym jest różna:
Typowe wartości krytyczne (progowe) określane są
indywidualnie dla danego zakładu
1 gram mięsa i poszczególnych miejsc pomiarowych.
lub soku pomarańczowego 10-7 g
1 gram mleka 10-9 g
1 gram lodów lub piwa 10-8 g
1 komórka bakteryjna
10-16 - 10-18 g
1 komórka drożdży 10-12 g
Luminometria: Luminometria:
Przykłady wartości krytycznych [RLU]:
Luminometr HY-LiTE® (firmy MERCK)
UrzÄ…dzenie
Wartość Wartość
do szybkiej kontroli
bez zastrzeżeń do zaakceptowania
warunków higienicznych,
Mleko < 100 < 250 - 300
do kontrolowania
powierzchni i popłuczyn.
Mięso, < 300 < 1 000
ryby
Warzywa, < 500 < 1 500
owoce
2
Luminometria: Luminometria:
Luminometr HY-LiTE® (firmy MERCK) Luminometr Uni-Lite (np. firmy NOACK POLEN):
Obsługa aparatu i wykonanie
Jest to przenośne urządzenie służące do badania
testu nie wymagajÄ…
skuteczności mycia i dezynfekcji urządzeń
specjalistycznej wiedzy
i linii technologicznych.
i są na tyle proste, że nawet
pracownik wykonujÄ…cy zabiegi
mycia i dezynfekcji może sam
sprawdzić skuteczność
wykonywanych czynności.
Wyniki sÄ… powtarzalne
i Å‚atwe do interpretacji.
Luminometria: Luminometria:
Luminometr Uni-Lite:
Luminometr Uni-Lite:
Aparat cechuje prostota obsługi, dokładność
Pozwala na jednoznaczne potwierdzenie skuteczności
i precyzja pomiaru oraz możliwość dokumentowania
mycia i dezynfekcji, a tym samym na natychmiastowe
wyników badań.
podjęcie decyzji, co do kontynuowania produkcji.
Luminometria: Luminometria:
Luminometr LUM-T:  pióra do luminometrów:
(oferta firmy Bentley)
novaLUM:
3
Luminometria: Luminometria:
Wady bioluminescencji:
Zalety bioluminescencji:
DðJest testem niespecyficznym, tzn. nie rozróżnia
Jðszybkość pomiaru od kilku do kilkudziesiÄ™ciu sekund,
rodzajów materiału biologicznego
Jðwykonanie analizy poza laboratorium, prawie
w każdych warunkach (aparatu są małe, przenośne),
DðWykorzystanie metody do oznaczania zawartoÅ›ci ATP
JðdostÄ™pność gotowych zestawów,
mikrobiologicznego w żywności wymaga
przygotowania próbki, tzn. usunięcia z niej ATP
JðporÄ™czne narzÄ™dzie monitoringu w ramach systemu
komórek eukariotycznych, które zawierają nawet do
HACCP - bezpośrednia interpretacja wartości w danych
tysiąca razy więcej ATP niż komórki prokariotyczne
punkcie pomiaru.
Luminometria: Luminometria:
Zależność między wynikami metody płytkowej [j.t.k./cm3]
i Xcel [Relative Light Units], wykonane w wodzie chłodzącej.
Wady bioluminescencji:
Uwaga !!!
W około 5% przypadków oznaczeń, przy niskich
odczytach poziomu ATP, w porównywalnych
posiewach metodą płytkową wyrasta stosunkowo duża
liczba kolonii.
Może to być to spowodowane obecnością na badanej
powierzchni przetrwalników lub spor, które nie
zawierajÄ… ATP i w zwiÄ…zku z tym dajÄ… wynik negatywny
w luminometrze.
Luminometria: Luminometria:
Zastosowanie bioluminescencji w praktyce:
Zastosowanie bioluminescencji w praktyce:
&ð ocena procesów fermentacyjnych (browarnictwo,
&ð kontrola czystoÅ›ci powierzchni produkcyjnych,
przemysł spirytusowy, mleczarski)
urządzeń i rąk pracowników
&ð kontrola skutecznoÅ›ci Å›rodków myjÄ…cych
&ð ocena skutecznoÅ›ci przeprowadzanych procesów
i dezynfekujÄ…cych
mycia - o skuteczności mycia decyduje nie tylko brak
&ð przeprowadzanie szybkiej oceny wzrostu
bakterii, ale także brak pozostałości materiału
drobnoustrojów oraz badanie wpływu czynników
biologicznego
chemicznych i fizycznych na dynamikÄ™ hamowania
wzrostu drobnoustrojów
&ð badanie mrożonej żywnoÅ›ci, soków i napojów
&ð badanie wody pitnej
4
Luminometria: Luminometria:
Schemat postępowania przy ocenie stanu
higienicznego powierzchni:
Wymaz z badanej powierzchni
“!
Dodatek ekstrahentu
(który powoduje lizę komórek i ułatwia
wydzielenie na zewnÄ…trz ATP)
“!
Dodatek kompleksu lucyferyna-lucyferaza
“!
Odczyt wyniku
Luminometria:
Oparte na luminometrii:
Inne
vð AccuPoint
nowoczesne metody
vð Biotrace Uni-Lite XCEL
vð Charm Lum-T / Firefly
vð BioControl Lightning MVP
VERIcleen: VERIcleen:
VERIcleen (oferta firmy Bentley Polska):
Szybki test do oceny umycia, czuły na pozostałości
żywności.
5
VERIcleen: VERIcleen:
Zanieczyszczona Jest czuły na obecność
powierzchnia powoduje cukru, ale nie białka.
zabarwienie paska na
różowo po 10-60s.
HY-RiSE®: HY-RiSE®:
HY-RiSE® Colour Hygiene Test Strip HY-RiSE® Colour Hygiene Test Strip:
(oferta firmy MERCK):
Jest czuły na obecność NAD, NADH, NADP, NADPH.
To wskaz
nik czystości
JeÅ›li sÄ… one obecne, Glukono-DH® przeksztaÅ‚ca ²-D-
powierzchni, wykrywa
glukozę w D-glukonolakton, który potem jest
resztki żywności.
przemieniany w barwny zwiÄ…zek.
HY-RiSE®: HY-RiSE®:
HY-RiSE® - procedura: HY-RiSE® - procedura:
1. otwarcie opakowania z paskiem 3. pobranie próbki z gładkiej powierzchni
o długości ok. 10 cm lub z 10 miejsc powierzchni
szorstkiej
2. dodanie Reagentu A
na pasek
6
HY-RiSE®: HY-RiSE®:
HY-RiSE® - procedura: HY-RiSE® - procedura:
4. w przypadku próbki popłuczyn nie trzeba stosować 6. włożyć pasek testu z powrotem do foliowego
Reagentu A opakowania, pozostawić na 4-5 minuty
w ciemnoÅ›ci w temperaturze od +15°C
do +30°C od chwili dodania Reagentu C.
Wynik:
barwa żółta - czysto!
5. dodać po 1 kropli Reagentów B i C
Inne testy oparte na wykrywaniu cukrów prostych: Inne testy oparte na wykrywaniu białek:
þð Pro-Tect (cukry redukujÄ…ce) þð Pro-Tect (Biotrace)
þð Spot check (glukoza) þð Flash (BioControl)
þð Spot check+ (glukoza / laktoza)
ELISA SANDWICH ELISA
Testy oparte na reakcjach immunologicznych. 1. Reakcja
immunologiczna
Dwa rodzaje testów:
þð SANDWICH ELISA
2. Reakcja
enzymatyczna
þð COMPETITIVE ELISA
7
COMPETITIVE ELISA
Testy ELISA
1. Reakcja immunologiczna Testy ELISA wykrywajÄ…ce patogeny lub ich metabolity:
Listeria
Campylobacter
2. Reakcja E. coli O157:H7
enzymatyczna
Salmonella
Legionella
enterotoksyczny B. cereus
werotoksyny
Testy ELISA Podobne testy
Testy ELISA wykrywajÄ…ce Listeria: testy oparte na wykrywaniu substancji hamujÄ…cych
(mięso, miód, mleko):
wynik po 30 minutach
Porównanie metod:
Podobne testy
testy oparte na wykrywaniu alergenów:
þð ATP  szybki wynik, ogólna informacja
þð Testy na cukry / biaÅ‚ka - 10 minut, bardziej specyficzne
þð Testy na alergeny - 10-60 minut, bardziej specyficzne,
dotyczą wybranych białek
þð Posiewy agarowe - 24-72 godzin, bardziej specyficzne,
dotyczą wybranych mikroorganizmów
8
Bezpośrednia Bezpośrednia
epifluorescencja (DEFT) epifluorescencja (DEFT)
Jest to stosunkowo szybka (25 - 30 minut) i czuła metoda Jest od dawna stosowana do badania mleka surowego
stosowana do określania liczby drobnoustrojów: (aparat BACTOSCAN).
bakterii, pleśni i drożdży, zarówno żywych jak
Wykorzystuje się w niej liczenie komórek za pomocą
i martwych.
mikroskopu.
Bezpośrednia Bezpośrednie barwienie
epifluorescencja (DEFT) komórek za pomocą INT
Schemat badania:
trawienie trypsyną Oparta jest na barwieniu przyżyciowym komórek
drobnoustrojów z wykorzystaniem chlorku 2-p-
filtracja przez filtr membranowy poliwęglanowy
jodofenylo-5-fenylo-tetrazolu (INT) i oznaczeniu jego
i barwienie oranżem akrydynowym (ten fluorescencyjny
zawartości na podstawie powstania czarno-fioletowych
barwnik ma silne powinowactwo do jÄ…der
kryształów formazanu wewnątrz komórek aktywnych
komórkowych mikroorganizmów, tworzenie
metabolicznie.
kompleksów z DNA i RNA)
Do przeprowadzenia badań jest wymagany barwnik INT,
uzyskanie zabarwienia - żywe komórki fluoryzują
mikroskop oraz aparatura do przeprowadzenia filtracji
pomarańczowo do czerwonego, martwe - zielono
membranowej.
badanie powierzchni filtra pod mikroskopem
Czas testu wynosi około 15 minut.
fluorescencyjnym
Biochipy Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA) (chipy DNA, sondy DNA)
ZawierajÄ… oligonukleotydy odpowiadajÄ…ce tysiÄ…com Zasada metody z zastosowaniem sondy DNA polega
genów na wykorzystaniu jej właściwości do przyłączania się
do komplementarnych fragmentów DNA występujących
w komórkach drobnoustrojów.
Wystarczy znalez
ć specyficzną dla danego
mikroorganizmu sekwencję nukleotydów
i otrzymać komplementarną sondę.
9
Biochipy Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA) (chipy DNA, sondy DNA)
Budowa:
metoda o bardzo dużej dokładności i czułości.
metoda bardzo specyficzna, gdyż obecność
drobnoustrojów oznaczana jest na podstawie ich cech
genotypowych, co decyduje o dużej wybiórczości testu
Åšrednica pojedynczej sondy DNA nie przekracza 200
mikronów, zaś na 1 cm2 płytki może znajdować się
ponad 10 tysięcy sond.
Biochipy Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA) (chipy DNA, sondy DNA)
TrwajÄ… prace nad zastosowaniem w toksykologii i badaniu
jakości mikrobiologicznej wody.
To ostatnie zastosowanie ma za zadanie wykrywać
jednocześnie i z niezwykłą czułością wszystkie
spodziewane drobnoustroje chorobotwórcze podczas
jednego badania próbki wody.
Pozwoli to na oszczędność czasu i skrócenie procedury
badawczej z 4 dni do około 4 godzin. Byłaby to
jednocześnie analiza jakościowa i ilościowa skażeń
mikrobiologicznych wody.
Biochipy Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA) (chipy DNA, sondy DNA)
10
Biochipy Biochipy
(chipy DNA, sondy DNA) (chipy DNA, sondy DNA)
biochipy:
NUTRIChip: badanie mikroflory, białek
GMOChip: badanie GMO
http://www.gene-chips.com/
Skuteczność dezynfekcji:
þð PrawidÅ‚owo wykonana dezynfekcja powoduje redukcjÄ™
liczby drobnoustrojów o 5 cykli logarytmicznych.
Skuteczność dezynfekcji
þð Dla porównania - prawidÅ‚owy proces mycia zmniejsza
liczbę drobnoustrojów o ok. 3 cykle logarytmiczne
(np. z poziomu 106 do wartości 103 j.t.k.).
Interpretacja wyników
Skuteczność dezynfekcji: Skuteczność dezynfekcji:
Przy badaniu skuteczności dezynfekcji badanie
powierzchni przeprowadza siÄ™ przed i po zabiegu
dezynfekcji:
Po dezynfekcji nie może być drobnoustrojów
chorobotwórczych !
A - liczba drobnoustrojów na badanej powierzchni przed
procesem dezynfekcji
B - liczba drobnoustrojów na badanej powierzchni po
procesie dezynfekcji
11
Skuteczność dezynfekcji: Skuteczność dezynfekcji:
Zadowalająca czystość mikrobiologiczna powierzchni Zadowalająca czystość mikrobiologiczna opakowań
metodą szablonową: metodą popłuczyn:
þð brak bakterii Enterobacteriaceae þð brak bakterii Enterobacteriaceae
w 1 cm3 popłuczyn
þð liczba drobnoustrojów ogółem
< 50 j.t.k. na 1 cm2 powierzchni
Kontrola czystości rąk
pracowników:
þð metody mikrobiologiczne tradycyjne:
posiewy z popłuczyn, metody odciskowe
Kontrola czystoÅ›ci þð pomiar ATP
rąk pracowników
Kontrola czystości rąk Kontrola czystości rąk
pracowników: pracowników:
þð zmywka jaÅ‚owym tamponem wewnÄ™trznej powierzchni
dłoni (między palcami także) - osobno każdą rękę
kontrolowanego pracownika
þð wypÅ‚ukanie obydwu tamponów w 25 cm3
rozcieńczalnika mikrobiologicznego (np. płynu Ringera)
þð posiew popÅ‚uczyn do pożywek dla drobnoustrojów
ogółem i Enterobacteriaceae
þð po inkubacji pÅ‚ytek, liczbÄ™ mikroflory przeliczyć na 25
cm3 rozcieńczalnika
12
Nowe regulacje prawne: Inne testy:
þð rozporzÄ…dzenie UE nr 852/2004
Inne testy
þð rozporzÄ…dzenie UE nr 853/2004
ułatwiające kontrolę
w zakładzie
Oba obowiÄ…zujÄ… od 1 stycznia 2006 roku !!!
þð ustawa o bezpieczeÅ„stwie żywnoÅ›ci i żywienia
Kontrola fosfatazy: Kontrola fosfatazy:
A Charm Lite Series Test (oferta firmy Bentley):
Końcówka pióra CHEF
Test zawiera tamponik, którym
THE CHEF (Cooking Heat EFficiency) - kontrola pobiera się badaną próbkę.
skuteczności ugotowania mięsa oraz reinfekcji opiera
się na ocenie aktywności enzymu fosfatazy, Po pobraniu wymazu,
powszechnie występującego w tkankach mięsnych, końcówka jest zanurzana w
drobiowych, rybnych, owoców morza. mieszaninie przygotowanych
reagentów zaś po 3-4 minutach
Fosfataza jest aktywna w mięsie surowym lub poddanym
następuje odczyt wyniku.
obróbce termicznej nie przekraczajÄ…cej 63-75°C,
lub w mięsie zanieczyszczonym po prawidłowo
wykonanej obróbce termicznej.
Kontrola fosfatazy: Kontrola fosfatazy:
CHEF Test wykorzystuje zjawisko Tempo termicznej inaktywacji fosfatazy
luminescencji substratu, który jest silnie skorelowane z termicznym niszczeniem
emituje kwant światła po reakcji bakterii E. coli.
katalizowanej przez aktywnÄ…
fosfatazÄ™.
Luminescencja jest mierzona na
podobnej zasadzie jak przy
pomiarze ATP.
13
Kontrola fosfatazy: Kontrola fosfatazy:
99% obniżenie aktywności fosfatazy może oznaczać
redukcję liczby E. coli o 6 cykli log w danej CHEF Test wykrywa obecność
temperaturze. poniżej 0.01% surowej tkanki
mięsnej w próbce gotowanego
produktu.
Z tego powodu, monitoring
aktywności fosfatazy może być
stosowany w HACCP.
Aktywność katalazy: Wskaz
niki laboratoryjne:
Sterikon® plus Bioindicator (firmy MERCK):
Może być skutecznie stosowany do kontroli procesów
technologicznych, w których wykorzystywany jest
Test umożliwiający kontrolę biologiczną
system HACCP i gdzie zagrożeniem są drobnoustroje
procesu sterylizacji parowej
katalazo-dodatnie.
w autoklawie.
Test ten od dawna służy do oceny skuteczności
Fiolki testu zawierajÄ… zawiesinÄ™
blanszowania warzyw. Użyteczny jest także do
przetrwalników Bacillus stearothermophilus.
ujawniania początkowych, nieznacznych zakażeń
Sterile = red-violet
mikrobiologicznych (głównie w mleczarstwie - do
(no growth)
wykrywania w mleku surowym drobnoustrojów i
leukocytów).
Non-sterile =
yellow, turbid
(growth)
Wskaz
niki laboratoryjne:
Taśmy do kontroli sterylizacji (firmy MERCK):
Są to samoprzylepne taśmy służące do kontroli
sterylizacji.
Zawierają termoczuły barwnik, który w temperaturze
121oC i 134oC zmienia kolor z białawego na brązowy.
14