Konferencja  Nowe metody w neurobiologii 15 grudnia 2004 21-26
Zwierzęta transgeniczne w neurobiologii
Witold Konopka
Zakład Neurobiologii Molekularnej i Komórkowej, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN
ul.Pasteura 3, 02-093 Warszawa
Streszczenie
Zwierzęta transgeniczne w ciągu ostatnich 20 lat stały się ważnym narzędziem badawczym w wielu naukach biologicznych
w tym także w neurobiologii. Istnieją cztery główne sposoby otrzymywania zwierząt transgenicznych: 1 - mikroinjekcja
DNA do zygoty, 2 - transfer DNA przy pomocy wirusów, 3 - modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych ES (ang.
Embryonic Stem Cells), 4 - transplantacja jąder komórkowych. Pierwsze dwie metody wykorzystywane są do otrzymywania
zwierząt głównie z nadekspresją określonych konstrukcji genetycznych. Natomiast technologia ES pozwala na wyłączenie
wybranego genu tzw.  knock-out . Jak dotąd technikę delecji genów można było zastosować jedynie u myszy. Alternatywną
metodą tworzenia zwierząt typu  knock-out dla innych gatunków jest technika transplantacji jąder komórkowych.
Obecnie intensywnie rozwijane są metody indukowalnej/warunkowej ekspresji genów. Spowodowane jest to potrzebą uzy-
skania zwierząt, w których ekspresja lub  knock-out wybranego genu obecne są tylko w określonych komórkach ciała
lub w czasie zależnym od badacza. Głównymi systemami tego typu są: system Cre/lox  umożliwiający  knock-out genu
ograniczony tylko do pewnego typu komórek oraz system tetracyklinowy  umożliwiający włączanie i wyłączanie ekspresji
wprowadzanego genu w dowolnym czasie.
Wstęp Sposoby otrzymywania zwierząt
transgenicznych
Pierwsze próby otrzymania transgenicznych myszy
pojawily się już w na początku lat 80-siątych XX wieku Można wyróżnić kilka podstawowych metod wyko-
(Gordon i Ruddle 1980, 1981, Costantini i Lacy 1981). rzystywanych do transgenizacji zwierzÄ…t laboratoryj-
Zwierzęta transgeniczne powstały w wyniku połączenia nych oraz hodowlanych:
dwóch dziedzin naukowych: embriologii doświadczal- " mikroinjekcja DNA do zygoty
nej oraz biologii molekularnej. Embriologowie opano- " transfer DNA przy pomocy wirusów
wali umiejętność hodowania zarodków poza ustrojem " modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych
oraz rozwinęli techniki manipulacji nimi. Natomiast ES (ang. Embryonic Stem Cells)
w wyniku postępów biologii molekularnej stało się " transplantacja jąder komórkowych
możliwe niemal dowolne konstruowanie fragmentów
DNA, wprowadzanych następnie do genomu zwierząt Mikroinjekcja DNA do zygoty
transgenicznych. Pierwsza z metod polega na mikroinjekcji DNA
Terminem zwierzę transgeniczne określa się takie (liniowego lub w postaci sztucznych chromosomów)
zwierzę, które w swoim genomie posiada egzogenny do jednego z przedjądrzy jednokomórkowego zarod-
DNA w postaci: ka  zygoty przy pomocy mikrochirurgicznej szkla-
" losowo zintegrowanego fragmentu liniowego nej pipety. Przedjądrza posiadają materiał genetyczny
DNA pochodzący od ojca i matki tuż przed połączeniem się
" zmodyfikowanego własnego genu w wyniku w jedno jądro komórkowe, które pokieruje rozwojem
wprowadzenia egzogennego DNA (technologia  knock zarodka w póz
niejszym okresie. Roztwór DNA wstrzy-
out oraz  knock-in ) kiwany jest do dowolnie wybranego przedjÄ…drza,
" wprowadzonej całej sztucznej jednostki genetycz- a następnie nastrzyknięte zygoty hodowane są in vitro
nej np. sztucznego chromosomu bakteryjnego BAC do stadium dwukomórkowego. Brak jest możliwości
(ang. Bacterial Artificial Chromosome) lub sztucznego dokładnego kontrolowania objętości wstrzykiwanego
chromosomu drożdżowego YAC (ang. Yeast Artificial roztworu DNA. Mikroinjekcję DNA przeżywa około
Chromosome) 50% zarodków, które następnie przeszczepiane są do
22 W. Konopka
jajowodu samic  matek zastępczych. Po okresie cią- uniemożliwi wyprowadzenie linii transgenicznej oraz
ży trwającej u gryzoni około 3 tygodni rodzi się około przeprowadzenie badań.
30% przetransferowanych zarodków, wśród których Główną zaletą metody mikroinjekcji DNA jest
około 15% posiada w swoim genomie zintegrowany brak ograniczenia rozmiaru wstrzykiwanego DNA.
transgen (Ryc. 1). W metodzie mikroinjekcji integracja Dokonuje siÄ™ injekcji DNA pochodzÄ…cego z plazmi-
wstrzykniętego transgenu do genomu jest losowa i nie dów (ok. 10 kpz), kosmidów (ok. 45 kpz) a także DNA
ma możliwości wyboru miejsca wbudowania. Ponadto sztucznych chromosomów BAC, YAC (długość frag-
nie można kontrolować liczby kopii transgenu wbudo- mentu DNA siegająca milionów par zasad).
wanych w genom, które często układają się tandemowo.
Otrzymany osobnik transgeniczny może posiadać Transfer DNA przy pomocy wirusów
transgen we wszystkich komórkach swojego ciała lub Kolejną metodą wykorzystywaną do otrzymywania
może być chimerą. Chimerą nazywamy taki organizm, zwierząt transgenicznych jest infekcja przy pomocy
którego komórki ciała nie są identyczne pod względem retrowirusów i lentiwirusów. Główną przewagą tej me-
genetycznym. W przypadku zwierząt transgenicznych tody nad innymi jest jej wyjątkowo duża wydajność,
oznacza to, że niektóre komórki posiadają transgen, na- sięgająca nawet 80% transgenicznego potomstwa.
tomiast inne nie. Taka sytuacja może się zdarzyć, gdy Ponadto retrowirusy i lentiwirusy posiadają zdol-
integracja transgenu do genomu nastąpiła po pierw- ność integracji do genomu po wniknięciu do komórki.
szym podziale komórkowym i tylko w jednej z komó- W przypadku retrowirusów głównym ograniczeniem
rek potomnych zwanych blastomerami. W przypadku stało się wyciszanie ekspresji genów (obecnych w
gdy transgen nie znajduje się w komórkach płciowych sekwencji wbudowanego do genomu retrowirusa)
założycielskiego osobnika transgenicznego, wtedy nie podczas rozwoju zarodka. Prawdopodobnie wady tej
będzie on przekazywany następnym pokoleniom, co pozbawione są lentiwirusy, stanowiące jedną z klas
retrowirusów. Lentiwirusy są zdolne do infekcji dzie-
lących się oraz nie dzielących się komórek. Z tego po-
wodu znalazły szerokie zastosowanie jako wektory w
terapiach genowych. Do otrzymania zwierzÄ…t transge-
nicznych z zastosowaniem lentiwirusów wykorzystano
dwie metody: infekcje jednokomórkowych zarodków
(Lois i wsp. 2002) oraz infekcje pierwotnych komórek
zarodkowych ES (Pfeifer i wsp. 2002).
Modyfikacja pierwotnych komórek
zarodkowych ES
Metoda otrzymywania zwierzÄ…t transgenicznych z
wykorzystaniem pierwotnych komórek zarodkowych
ES (ang. embryo stem cells) pozwala na precyzyj-
nÄ… modyfikacjÄ™ badanego genu lub miejsca w geno-
mie (Ryc. 2). Komórki ES izolowane są z blastocysty
(wczesny etap rozwoju zarodka), dzięki czemu otrzy-
muje się komórki niezróżnicowane, które posiadają
zdolność wbudowywania się do tkanek rozwijającego
siÄ™ zarodka po ponownym wprowadzeniu do blastocy-
sty (Evans i Kaufman, 1981; Martin, 1981).
W metodzie tej komórki ES modyfikowane są in vi-
tro w bardzo precyzyjny sposób. Podstawową techniką
wprowadzania genów do komórek ES jest elektropora-
cja, ale także wykorzystuje się lipofekcję oraz metodę
wapniową. Aby uzyskać pożądane miejsce integracji
Ryc. 1. Transgenizacja przy pomocy mikroinjekcji DNA do przed-
wprowadzany fragment DNA zawiera sekwencjÄ™ genu
jÄ…drza zygoty.
Zwierzęta transgeniczne w neurobiologii 23
selekcyjnego otoczoną przez sekwencje homologiczne Potomstwo osobników chimerowych jest heterozygo-
do modyfikowanego genu. W jądrze komórki następuje tyczne i dopiero po skrzyżowaniu dwóch heterozygot
rozpoznanie sekwencji otaczających i wymiana geno- można otrzymać osobnika homozygotycznego z całko-
mowej sekwencji na sekwencję wprowadzaną przez wicie wyłączonym genem (knock-out) na obu chromo-
badacza. Wprowadzenie  obcego DNA wyłącza pra- somach homologicznych (Ryc. 2). Opisane wyłączanie
widłowe funkcjonowanie tego genu w komórce, dzięki genów stosuje się w celu zbadania funkcji danego genu,
czemu uzyskuje się komórkę z wyłączonym genem tzw. poprzez analizę nieprawidłowości powstałych u homo-
knock-out. Ekspresja genu selekcyjnego (znajdująca się zygotycznych osobników typu knock-out.
na wprowadzonym DNA) pozwala wybrać tylko te ko-
mórki-klony, w których nastąpiła właściwa wymiana Transplantacja jąder komórkowych
(homologiczna rekombinacja). Wcześniej opisana metoda możliwa jest do zastoso-
Komórkę, w której nastąpiła wymiana i wyłączenie wania jedynie u myszy, natomiast dla pozostałych ga-
interesującego nas genu namnaża się w odpowiednich tunków istnieje inna droga otrzymywania osobników z
warunkach selekcyjnych. Komórki potomne następnie wyłączonym genem typu knock-out. Wykorzystuje ona
transferuje się do blastocysty, w której zmodyfikowane technikę transplantacji jąder komórkowych. Technika
komórki ES łączą się z niezmodyfikowanymi komórka- taka określana jako klonowanie somatyczne została
mi zarodka tworzÄ…c jeden organizm. Otrzymana chime- wykorzystana do otrzymania owcy Dolly (Wilmut i
ra posiada część komórek ze zmienionym genotypem, wsp. 1997). W metodzie tej można wykorzystać wie-
czyli z wyłączonym genem  knock-out. Jeżeli komórki le rodzajów komórek somatycznych, które w hodowli
ES-knock-out zasiedlą tzw. sznury płciowe, czyli ko- mogą być modyfikowane w podobny sposób jak mysie
mórki z których w życiu dorosłym powstaną komór- komórki ES. Po otrzymaniu komórek zmodyfikowa-
ki rozrodcze, to taki osobnik będzie mógł przekazać nych np. typu knock-out, jedną z nich umieszcza się w
nową cechę - knock-out genu następnemu pokoleniu. pobliżu oocytu, z którego wcześniej mikrochirurgicz-
Ryc. 2. Transgenizacja przy pomocy pierwotnych komórek zarodkowych ES.
24 W. Konopka
nie usunięto jądro komórkowe. Następnie łączy się promotora. Przykłady takich systemów oraz ich wyko-
obie komórki w procesie elektrofuzji, poddając je dzia- rzystania w neurobiologii podano poniżej.
łaniu pola elektrycznego. W ten sposób otrzymujemy
jednokomórkowy zarodek, którego rozwój kierowany System Cre/lox
jest na początku przez składniki zawarte w cytopla- W systemie tym komórki ES modyfikuje się w celu
zmie oocytu, a następnie funkcję rozwoju przejmuje wprowadzenia do badanego genu pewnych sekwencji
jądro komórki somatycznej. Jeżeli komórka ta została bez uszkodzenia funkcjonowania tego genu (tzw. tech-
wcześniej zmodyfikowana np. poprzez knock-out genu, nologia knock-in). W tym przypadku sekwencja bada-
zmiana ta obecna będzie w każdej komórce powstałego nego genu jest zastępowana przez taką samą sekwencję
organizmu. otoczoną miejscami loxP. Sekwencje loxP to krótkie se-
kwencje rozpoznawane przez enzym rekombinazÄ™ Cre,
Systemy warunkowej/indukowalnej który usuwa sekwencję DNA zawartą miedzy nimi. Tak
ekspresji genów zmodyfikowane komórki ES wstrzykuje się do blasto-
cysty w celu otrzymania myszy ze zmienionym genoty-
W opisanych dotychczas metodach otrzymywania pem. Następnie takie myszy (tzn. posiadające gen, któ-
zwierząt transgenicznych wprowadzone zmiany w ge- ry chcemy usunąć, otoczony sekwencjami loxP) krzy-
nomie np. nadekspresja lub knock-out wybranego genu, żuje się z myszami posiadającymi gen rekombinazy
istnieją od początku życia organizmu i jak w przypadku Cre. W zależności od własności promotora kierującego
zwierząt  knock-out we wszystkich komórkach ciała. ekspresją Cre, wycięcie genu będzie następowało tylko
Czasem może to powodować problemy z interpretacją w tych komórkach, w których obecny będzie ten en-
wyników tj. u części myszy typu knock-out występu- zym (Ryc. 3). Przykładem promotora, który wykazuje
ją efekty kompensacji funkcji brakującego genu przez specyficzność do pewnego rodzaju komórek (neuronów
inne geny homologiczne lub pokrewne. Natomiast w pobudzających przodomózgowia) jest promotor genu ą
pewnych przypadkach, gdy badany gen odgrywa klu- podjednostki CaMKII. Fragment promotora Ä…CaMKII
czową rolę podczas rozwoju, jego usunięcie powoduje (o długości 8,5 kpz) zastosowano do otrzymania myszy
obumieranie zarodka, co uniemożliwia prowadzenie ąCaMKII-Cre (Tsien i wsp. 1996a). Otrzymano 14 linii
badań. Z tego powodu naukowcy pracują nad systema- myszy transgenicznych, które następnie skrzyżowano z
mi warunkowej/indukowalnej ekspresji genów, które myszami posiadajÄ…cymi gen ²-galaktozydazy pod pro-
pozwalajÄ… na ekspresjÄ™ bÄ…dz
 zknockoutowanie wy- motorem ²-aktyny, przy czym promotor i gen byÅ‚y roz-
branego genu tylko w pewnych typach komórek oraz dzielone sekwencją z kodonem  stop dla transkrypcji.
w czasie zależnym od badacza lub od specyficzności Sekwencja  stop była ponadto otoczona miejscami
Ryc. 3. System Cre/lox warunkowej ekspresji genów.
Zwierzęta transgeniczne w neurobiologii 25
loxP, wskutek czego ekspresja ²-galaktozydazy moż- brak jest antybiotyku w komórce) zwiÄ…zany z promoto-
liwa była tylko po usunięciu tej sekwencji rozdziela- rem represor blokuje ekspresję regulowanego przez nas
jącej przez rekombinazę Cre. W jednej z linii myszy genu. Natomiast po dodaniu doksycykliny zastępowa-
obserwowano ekspresjÄ™ ²-galaktozydazy (Å›wiadczÄ…cej ny jest on przez odwrotny aktywator, który z antybio-
o zaistniałej rekombinacji Cre-loxP) tylko w komór- tykiem zyskuje powinowactwo do promotora PCMV*-1
kach pola CA1 hipokampa w mózgu. Opisaną linię my- i włącza ekspresję (Ryc. 4). Za pomocą doksycykliny
szy ąCaMKII-Cre skrzyżowano ponadto z myszami możemy dokonywać wyboru czasu włączenia i wyłą-
posiadajÄ…cymi gen dla receptora NMDAR1 otoczony czenia ekspresji genu. Natomiast od wyboru promoto-
sekwencjami loxP. Uzyskano w ten sposób myszy z ra kierującego ekspresją represora i aktywatora zależy
 knock-outem receptora NMDA ograniczonym tylko to w jakich komórkach lub tkankach system będzie
do niewielkiego regionu mózgu i tylko do pewnych ko- działał. Przykładem zastosowania systemu tetracykli-
mórek  pole CA1 hipokampa (Tsien i wsp. 1996b). nowego do badania procesów uczenia się i pamięci w
zwierzętach transgenicznych jest praca, w której dzię-
System tetracyklinowy ki indukowalnej nadekspresji inhibitora calcyneuryny
Kolejnym systemem pozwalającym na indukowalną wykazano jej rolę w regulacji tych procesów (Malleret
ekspresję genów jest system tetracyklinowy (Gossen i i wsp. 2001). Otrzymano podwójnie transgeniczne my-
Bujard, 1992). W systemie tym gen, który chcemy re- szy, w których gen inhibitora calcyneuryny znajdował
gulować znajduje się pod kontrolą promotora tetracy- się pod kontrolą promotora tetracyklinowego, nato-
klinowego (PCMV*-1) złożonego z minimalnego promo- miast odwrotny transaktywator pod kontrolą promotora
tora CMV oraz z sekwencji operatora tetracyklinowego ąCaMKII. Doksycyklinę podawano w pożywieniu mi-
(TetO). W ulepszonej wersji tego systemu (Rossi i wsp. niumum tydzień przed wykonaniem eksperymentów.
1998) wykorzystano represor oraz odwrotny aktywator Ekspresję inhibitora wywołaną doksycyklinę obser-
tetracyklinowy. Oba białka wiążą się z promotorem te- wowano w korze mózgowej, hipokampie, prążkowiu,
tracyklinowym i regulują jego działanie w sposób za- opuszkach węchowych, a trakże w móżdżku. Indukcja
leżny od doksycykliny. W stanie podstawowym (gdy ekspresji genu inhibitora była odwracalna, a brak efektu
Ryc. 4. Tetracyklinowy system indukowalnej ekspresji genów. rtTA  odwrotny transaktywator tetracyklinowy; tTR  transrepresor tetra-
cyklinowy; TetP  promotor tetracyklinowy (PCMV*-1); X  regulowany gen; DOX  Doksycyklina.
26 W. Konopka
Lois C, Hong EJ, Pease S, Brown EJ, Baltimore D (2002) Germline
hamowania calcyneuryny (świadczącym o wyłączeniu
transmission and tissue-specific expression of transgenes deliv-
ekspresji inhibitora) obserwowano 12 dni po odstawie-
ered by lentiviral vectors. Science. 295:868-872.
niu doksycykliny.
Malleret G, Haditsch U, Genoux D, Jones MW, Bliss TV, Vanhoose
Na zakończenie warto podkreślić, że w najbliższym
AM, Weitlauf C, Kandel ER, Winder DG, Mansuy IM (2001)
czasie będziemy prawdopodobnie obserwować znaczący Inducible and reversible enhancement of learning, memory, and
long-term potentiation by genetic inhibition of calcineurin. Cell
rozwój technik kontroli ekspresji genów w zwierzętach
104:675-686.
transgenicznych, dzięki czemu możliwe będzie dokony-
Martin GR (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early
wanie coraz bardziej precyzyjnych zmian genomu.
mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarci-
noma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78:7634-7638.
Pfeifer A, Ikawa M, Dayn Y, Verma IM (2002) Transgenesis by len-
tiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic
Bibliografia
stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U
S A. 99:2140-2145.
Costantini F i Lacy E (1981) Introduction of a rabbit beta-globin
Rossi FM, Guicherit OM, Spicher A, Kringstein AM, Fatyol K,
gene into the mouse germ line. Nature. 294: 92-4
Blakely BT, Blau HM (1998) Tetracycline-regulatable factors
Evans MJ, Kaufman MH (1981) Establishment in culture of pluri- with distinct dimerization domains allow reversible growth inhi-
potential cells from mouse embryos. Nature. 292:154-156.
bition by p16. Nat. Genet. 20:389-393.
Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH
Tsien JZ, Chen DF, Gerber D, Tom C, Mercer EH, Anderson DJ,
(1980) Genetic transformation of mouse embryos by microinjec- Mayford M, Kandel ER, Tonegawa S (1996a) Subregion- and cell
tion of purified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 77:7380-4.
type-restricted gene knockout in mouse brain. Cell. 87:1317-26.
Gordon JW, Ruddle FH (1981) Integration and stable germ line
Tsien JZ, Huerta PT, Tonegawa S (1996b) The essential role of hip-
transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science.
pocampal CA1 NMDA receptor-dependent synaptic plasticity in
214: 1244-1246.
spatial memory. Cell. 87:1327-38.
Gossen M., and Bujard H (1992) Tight control of gene expression
Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH (1997)
in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc.
Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.
Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547 5551.
Nature. 385:810-813.