Medycyna Wet. 2007, 63 (3) 261
Artyk rz g d y
Produkcja biofarmaceutyków
z wykorzystaniem transgenicznych zwierząt
DANiEL LiPiC
SKi*, JOANNA ZEYLAND**/***, RYSZARD SA
OMSKi*/**
*instytut Genetyki Człowieka PAN, uI. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań
**Katedra Biochemii i BiotechnoIogii Wydziału RoIniczego AR, uI. Wołyńska 35, 60-637 Poznań
***Stypendystka w ramach Działania 2.6 Zintegrowanego Programu Operacyjnego Rozwoju RegionaInego
finansowanego z Europejskiego Funduszu Społecznego Unii Europejskiej i z budżetu państwa
Lipiński D., ZeyIand J., Słomski R.
Biopharmaceutical production in transgenic animals
Summary
Two discoveries reported in the mid 1970s  in hybridoma technology and genetic engineering techniques 
have enabled overcoming the difficulties related to the generation of pharmaceuticals from their natural
resources, such as blood or human tissues, and in 1982 led to the introduction of the first product of the
modern biotechnology, a recombinant insulin, opening the biopharmaceutical era. Among the registered
biopharmaceuticals in the 1980s and the early 1990s the majority of the products were identical to the natural
forms of the proteins and their amino acid sequences. Currently, the rapid growth of the contribution of the
second generation biopharmaceuticals with genetically introduced modifications is observed. All of the
biopharmaceuticals registered on the market until 2005 were generated with the application of E. coli bacte-
ria, yeast, or animal cell lines (CHO, BHK). With the possible registration on the market of the recombinant
antithrombin, in 2006 the first therapeutic protein produced in milk of the transgenic goats will appear as
a new alternative, cheaper and more effective system enabling the production of complex proteins. The
biopharmaceuticals can be generated in blood, milk, urine, semen, egg white of the transgenic animals, and
the silk glands of silkworms. At present, several dozens of the protein products which are produced in milk of
almost all species of farm animals and in the egg white of the hens are subjected to studies at the clinical phase.
Keywords: biopharmaceuticals, transgenic animals
Naturalne z
ródło wielu leków stanowią krew oraz czyniło się odkrycie restryktaz i ligaz  enzymów nie-
tkanki człowieka. Pozyskiwanie farmaceutyków z or- zbędnych do klonowania DNA. Enzymy restrykcyjne
ganizmu człowieka niesie jednak ze sobą ryzyko zaka- hydrolizują DNA każdego organizmu na powtarzalny
żenia patogenami. W 1985 r. odkryto związek pomię- układ fragmentów. Ligazy mogą natomiast trwale łączyć
dzy stosowanym w leczeniu karłowatości hormonem fragmenty DNA z samoreplikującymi cząsteczkami
wzrostu, oczyszczanym z przysadki mózgowej człowie- DNA  wektorami. Uzyskany w ten sposób rekombino-
ka a występowaniem choroby Creutzfeldta-Jacoba. wany DNA może być wprowadzany do komórek gos-
Mimo że dawcy są obecnie szczegółowo badani, a pre- podarza  najczęściej komórek bakterii, ale równie częs-
paraty poddaje się rutynowo procedurom inaktywują- to stosuje się komórki drożdży, owadów czy ssaków.
cym wirusy, zagrożenie ze strony niektórych patogenów Techniki inżynierii genetycznej umożliwiły również wpro-
nadal występuje. Poważnym ograniczeniem pozyskiwa- wadzanie precyzyjnych zmian w sekwencji aminokwa-
nia farmaceutyków bezpośrednio od dawców jest wy- sowej białka w celu modyfikacji jego właściwości.
stępowanie terapeutycznych białek w bardzo małych Era biofarmaceutyków rozpoczęła się od pojawienia
ilościach, co utrudnia izolację i podnosi koszty produk- się na rynku w 1982 r. pierwszego produktu nowoczes-
cji. Wysoka cena wyklucza lub bardzo ogranicza możli- nej biotechnologii  rekombinowanej insuliny. W 2004 r.
wość stosowania ich jako leków. w Stanach Zjednoczonych i Unii Europejskiej zarejes-
Dwa odkrycia z połowy lat 70. pozwoliły na uzyski- trowano już 160 biofarmaceutyków, a ponad 500 prze-
wanie biofarmaceutyków wytwarzanych przez organizm chodziło próby kliniczne. Wartość rynkowa produko-
człowieka. Technologia komórek hybrydoma umożli- wanych biofarmaceutyków osiągnęła 34 mld dolarów,
wia produkcję przeciwciał monoklonalnych, a inżynie- a z ich terapeutrycznych właściwości skorzystało 250 mln
ria genetyczna produkcję określonych białek. Techniki pacjentów. Rośnie również udział biofarmaceutyków
inżynierii genetycznej stosowane do celów biotechno- w ogólnej puli produkowanych lekarstw. W latach 90.
logicznych umożliwiają izolację, charakterystykę oraz w Stanach Zjednoczonych zarejestrowano 370 nowych
modyfikację określonych genów. Do ich rozwoju przy- leków, wśród których 49 (13%) stanowiły biofarma-
262 Medycyna Wet. 2007, 63 (3)
Tab. 1. Główne kierunki modyfikacji biofarmaceutyków
.
Ryc. 1. Główne kategorie biofarmaceutyków dostępnych na
rynkach Unii Europejskiej i Stanów Zjednoczonych. Ponad się w fazie badań klinicznych biofarmaceutyków nale-
połowa produkowanych biofarmaceutyków skierowana jest
ży do grupy leków, które mogłyby znalez
ć zastosowa-
do walki z sześcioma głównymi chorobami człowieka
nie w terapii nowotworów. Liczna grupa leków może
znalez
ć zastosowanie w terapii chorób zakaz
nych, au-
ceutyki. W latach 1995-2000 Europejska Agencja Oce- toimmunologicznych, neurologicznych oraz związanych
ny Medycznej (EMEA; http://www.emea.eu.int) zare- z zakażeniem wirusem HIV.
jestrowała 127 nowych leków, z których 44 (34%) sta- W latach 80. oraz wczesnych latach 90. większość
nowiły biofarmaceutyki (około 25% produkowanych
zarejestrowanych biofarmaceutyków stanowiły mysie
leków). Ponad połowa dopuszczonych do rynku pro- przeciwciała monoklonalne oraz białka terapeutyczne
duktów przeznaczona jest do walki z hemofilią, cukrzy- o identycznej w porównaniu z naturalną formą białka
cą, zapaleniem wątroby, zawałem mięśnia sercowego,
sekwencji aminokwasowej. W latach 90. pojawiło się
nowotworami czy chorobami związanymi z niedobo- kilka produktów drugiej generacji o właściwościach
rem hormonu wzrostu (ryc. 1). Obejmują one przeciw- zmodyfikowanych metodami inżynierii genetycznej. Ta
ciała monoklonalne, szczepionki, cytokiny, czynniki
tendencja uległa w latach 2000-2004 znacznemu przy-
krwi, antykoagulanty, hormony oraz krwiotwórcze czyn- spieszeniu. W tym czasie 29 z 65 (44%) zarejestrowa-
niki wzrostowe (ryc. 2).
nych produktów było w pewnym zakresie poddanych
Systematycznie rośnie liczba biofarmaceutyków znaj- zabiegom inżynierii genetycznej. Tego typu modyfika-
dujących się w różnych fazach badań klinicznych. We- cje mogą polegać na zmianie sekwencji aminokwaso-
dług organizacji Badania Farmaceutyczne i Producenci
wej, kowalencyjnym przyłączaniu grup chemicznych czy
Ameryki (PhRMA; http://www.phrma.org) w 1988 r.
zmianie w obrębie oligosacharydowej struktury łańcu-
w fazie badań klinicznych było 81 produktów, w 1993 r.
chów bocznych białek podlegających procesowi gliko-
 143, w 1996 r.  369, a w 2000 r. liczba badań klinicz- zylacji. Wprowadzane zmiany umożliwiają tworzenie
nych przekroczyła 500. Niemal połowa ze znajdujących
chimerycznych lub humanizowanych przeciwciał mo-
noklonalnych o obniżonej immunogennoś-
ci, tworzenie białek o szerokim profilu far-
makokinetycznym, białek hybrydowych
łączących w sobie cechy tworzących je po-
jedynczych polipeptydów czy białek o wy-
dłużonym okresie półtrwania (tab. 1).
Wszystkie biofarmaceutyki dopuszczo-
ne do sprzedaży do 2005 r. produkowane
są z wykorzystaniem bakterii E. coli,
drożdży lub linii komórek zwierzęcych,
z których najczęściej stosuje się komórki
jajnika chomika chińskiego (CHO) oraz ko-
mórki nerki młodych chomików (BHK). Na
początku 2006 r. oczekuje się dopuszcze-
nia do sprzedaży pierwszego produktu
uzyskanego z wykorzystaniem zwierząt
transgenicznych  antytrombiny człowieka
wytwarzanej w mleku transgenicznych kóz
Ryc. 2. Główne kategorie biofarmaceutyków dostępnych na rynkach Unii
Europejskiej i Stanów Zjednoczonych. Produkowane biofarmaceutyki nale- (http://www.transgenics.com). Oczekuje
żą do siedmiu grup białek się, że taki sposób produkcji biofarmaceu-
Medycyna Wet. 2007, 63 (3) 263
tyków będzie dużo wydajniejszy i tańszy w porówna- Tab. 2. Biofarmaceutyki uzyskiwane w jajach transgenicz-
nych kur
niu z obecnie stosowanymi systemami.
Wybór systemu biologicznego jest w dużym stopniu
uzależniony od rodzaju modyfikacji, którym podlega
l .
określone białko. Wiele białek, aby mogło być w pełni
funkcjonalnych i stabilnych in vivo musi ulec np. gliko-
l .
zylacji. Wydaje się, że jedynie zastosowanie hodowli
komórek in vitro oraz zwierząt jako bioreaktorów, które
potrafią dokładnie przeprowadzić skomplikowane mo-
l .
dyfikacje potranslacyjne, umożliwia uzyskanie białka
w formie normalnie występującej w organizmie czło-
l .
wieka. Pomimo wielu zalet zastosowanie hodowli ko- l
mórkowych ograniczone jest względnie wysokimi kosz-
tami oraz trudnościami związanymi z utrzymaniem
w hodowli dużej liczby komórek. Pozbawione takich kowanych w jajach transgenicznych kur znajduje się już
ograniczeń zwierzęta transgeniczne wydają się idealny- w fazie badań przedklinicznych (tab. 2).
mi bioreaktorami. Biofarmaceutyki można wytwarzać Obecnie najlepszym z
ródłem biofarmaceutyków po-
u transgenicznych zwierząt w krwi, mleku, moczu, na- zostaje mleko. Wykorzystanie mleka do uzyskiwania
sieniu, białku jaj oraz z zastosowaniem jedwabników. biofarmaceutyków rozważano od chwili urodzenia się
Krew jest łatwo dostępnym i stosunkowo tanim z
ród- pierwszego transgenicznego ssaka. Po raz pierwszy uda-
łem białek, jednakże większość białek wydzielanych ło się to zastosować u transgenicznych myszy, które z po-
przez komórki do krwi wykorzystywanych w celach te- wodzeniem wydzielały w mleku -laktoglobulinę owcy
rapeutycznych jest nietrwała i szybko usuwana z krwio- (7). Głównymi białkami mleka są -, -, - i -kaze-
S1 S2
biegu. Czas półtrwania hormonu wzrostu człowieka ina, występujące u większości gatunków w różnym stę-
wynosi około 15 minut. Z tego względu u transgenicz- żeniu, -laktoglobulina obecna szczególnie w mleku
nych zwierząt stężenie hormonu rzadko przekracza kil- przeżuwaczy, -laktoalbumina syntetyzowana u więk-
ka �g/ml nawet przy wysokim poziomie ekspresji genu szości gatunków oraz kwaśne białko serwatki (WAP 
znajdującego się pod kontrolą silnego promotora genu whey acidic protein) występujące szczególnie w mleku
metalotioneiny. W związku z tym ilość zgromadzonych gryzoni. Ekspresja genów kodujących białka mleka
we krwi białek jest często niewystarczająca, aby mogła występuje tylko w gruczołach mlekowych zwierząt
stać się ważnym z
ródłem biofarmaceutyków. Ponadto w okresie laktacji. Zastosowanie regionów regulatoro-
w większości przypadków obecne w krwi zwierząt trans- wych tych genów pozwala ograniczyć ekspresję trans-
genicznych białka człowieka, ze względu na bliskie genu do komórek gruczołu mlekowego. W związku
ewolucyjnie pokrewieństwo są aktywne, a co za tym z tym obecność obcych białek w mleku nie powinna
idzie, mają wpływ na ich fizjologię. Obecność hormo- wpływać na organizm zwierzęcia.
nu wzrostu człowieka w krwi transgenicznych myszy, Transgeniczne zwie-
świń i owiec może prowadzić do gigantyzmu, cukrzycy Tab. 3. Wybór gatunku zwierząt rzęta produkujące
w zależności od wielkości zapo- w mleku biofarmaceu-
i wielu innych objawów chorobowych. Krew może być
trzebowania na określony pro-
jednak wartościowym z
ródłem niektórych białek tyki uzyskano u prawie
dukt
(3, 6). wszystkich gatunków
Doskonałym z
ródłem rekombinowanych białek jest zwierząt gospodarskich
białko jaj (5). Kura domowa znosi rocznie do 300 jaj, (tab. 3). Wybór gatunku
z których każde zawiera 6,5 g białka. Silny promotor zależy od wielkości za-

genu owoalbuminy, zdolny wydajnie kierować eks- potrzebowania na okreś-
presją transgenu w jajowodach transgenicznych kur od- lone białko (tab. 4).
powiada za produkcję około 2 g białka. Zaletą systemu y
ródłem białek tera-

w porównaniu z innymi grupami zwierząt hodowlanych peutycznych, na które
są możliwości reprodukcyjne (kilkaset sztuk potomstwa zapotrzebowanie nie
rocznie), krótki odstęp międzypokoleniowy (około 7-8 przekracza 1 kg rocznie mogą być transgeniczne króli-
miesięcy) oraz niskie koszty hodowli drobiu. Jednak ze ki, które w okresie laktacji dostarczają potomstwu po-
względu na problemy techniczne związane z przygoto- nad 200 ml mleka dziennie o stężeniu białka trzy razy
waniem transgenicznych ptaków system ten przez wie- wyższym w porównaniu z mlekiem krowy. W ciągu roku
le lat nie spełniał pokładanych w nim oczekiwań. Obec- samica królika może mieć do 8 laktacji trwających 4-5
nie stał się drugim po mleku z
ródłem biofarmaceuty- tygodni. W praktyce podczas jednego okresu laktacji od
ków znajdujących się w zaawansowanej fazie badań. samicy królika można uzyskać 1 litr mleka, dlatego te
Wykorzystaniem tego systemu do produkcji biofarma- zwierzęta mogą być z
ródłem względnie dużej ilości bio-
ceutyków zainteresowanych jest obecnie kilka firm ame- farmaceutyków. Większe ilości biofarmaceutyków moż-
rykańskich, a kilka produktów firmy Avigenics (http:// na uzyskiwać, wykorzystując zwierzęta gospodarskie,
www.avigenics.com)  erytropoetyna, G-CFS, humani- takie jak: świnia, owca i koza produkujące 300-900 lit-
zowane przeciwciała poliklonalne, interferon  produ- rów mleka rocznie albo krowę, której wydajność może
264 Medycyna Wet. 2007, 63 (3)
Tab. 4. Biofarmaceutyki uzyskiwane w mleku transgenicznych zwierząt
.
=
=
ll
ll
l
lll lll

l
l 
lll
l
l
l lll
l


l
l l
l ll lll
Medycyna Wet. 2007, 63 (3) 265
sięgać nawet 10 000 litrów. Ponieważ ekspresja rekom- Obecnie do biofarmaceutyków zalicza się niemal
binowanych białek możliwa jest na poziomie 1 g/L, nie- wyłącznie rekombinowane białka terapeutyczne i prze-
wielka liczba transgenicznych zwierząt jest w stanie ciwciała monoklonalne. Przynajmniej do końca obec-
zaspokoić potrzeby pacjentów na poszczególne leki. nej dekady nie powinno się pod tym względem wiele
zmienić. O ile jednak w latach 80. oraz wczesnych la-
Alternatywą dla pozyskiwania biofarmaceutyków
w mleku zwierząt gospodarskich jest wykorzystanie mo- tach 90. zdecydowaną większość zarejestrowanych bio-
czu lub płynu nasiennego. Z mleka białka terapeutycz- farmaceutyków stanowiły produkty o identycznej w po-
równaniu z naturalną formą białka sekwencji aminokwa-
ne można uzyskać tylko od samic w okresie laktacji,
podczas gdy w przypadku moczu białka można produ- sowej, o tyle obecnie gwałtownie rośnie udział biofar-
maceutyków drugiej generacji o zmodyfikowanych
kować u wszystkich osobników przez cały okres życia.
Pozyskiwanie białek byłoby również łatwiejsze technicz- metodami inżynierii genetycznej właściwościach.
W 2004 r. w Stanach Zjednoczonych i Unii Europej-
nie i znacznie obniżyło koszty. Zastosowanie specyficz-
skiej dostępnych było 160 biofarmaceutyków o war-
nych dla komórek nabłonka pęcherza moczowego sek-
tości rynkowej przekraczającej 34 mld dolarów. Anali-
wencji regulatorowych genu uroplakiny oraz uromodu-
tycy rynkowi przewidują, że w 2010 r. biofarmaceutyki
liny pozwoliło uzyskać w moczu transgenicznych my-
stanowić będą 50% rejestrowanych leków, a ich war-
szy względnie niewielkie ilości hormonu wzrostu (100-
tość rynkowa sięgnie 52 mld dolarów. Największy
-500 ng/ml) (2), erytropoetyny (6 ng/ml) (9) oraz -
1
wpływ na rynek biofarmaceutyczny w nadchodzących
-antytrypsyny człowieka (65 �g/ml) (10).
latach będzie miało pojawienie się w 2006 r. rekombi-
Od niedawna jako z
ródło biofarmaceutyków brane
nowanej antytrombiny, pierwszego produktu uzyskiwa-
jest pod uwagę nasienie. System ten ma niewątpliwe
nego w mleku transgenicznych kóz  dużo wydajniej-
zalety: obfitość i łatwość pozyskiwania u niektórych
szego, tańszego i umożliwiającego produkcję złożonych
gatunków zwierząt, np. świń. Od knura można uzyskać
białek, alternatywnego dla obecnie stosowanych, syste-
2-3 razy w tygodniu, 200-300 ml ejakulatu, zawierają-
mu wykorzystującego do produkcji biofarmaceutyków
cego 30 mg/ml białka. W ciągu roku od transgenicznej
transgeniczne zwierzęta (4). Obecnie w fazie badań kli-
świni produkującej rekombinowane białko w ilości
nicznych znajduje się już kilkadziesiąt produktów biał-
1 mg/ml można uzyskać 22,4 g produktu. Dotychczaso-
kowych produkowanych w mleku niemal wszystkich ga-
we badania, ograniczone do zwierząt laboratoryjnych
tunków zwierząt gospodarskich oraz w białku kurzych
dały bardzo obiecujące wyniki. W nasieniu transgenicz-
jaj. W nieco dłuższej perspektywie czasu należy ocze-
nych myszy udało się uzyskać hormon wzrostu czło-
kiwać pojawienia się na rynku zupełnie nowych kate-
wieka w ilości około 0,5 mg/ml (1). Jest to ilość wielo-
gorii produktów związanych z prowadzonymi obecnie
krotnie wyższa niż ilość hormonu wzrostu produkowa-
intensywnymi badaniami w dziedzinie terapii genowej,
nego w moczu transgenicznych myszy (100-500 ng/ml)
technologii wykorzystujących antysensowe lub interfe-
(2). Dyck i wsp. zastosowali sekwencję regulatorową
rujące RNA czy terapii komórkowej.
genu P12 myszy, którego ekspresja jest ograniczona do
komórek gruczołów płciowych samców. Ponieważ nie
PiS
miennictwo
poznano jeszcze wszystkich białek występujących
1. Dyck M. K., Gagne D., Ouellet M., Senechal J. F., Belanger E., Lacroix D.,
w nasieniu, istnieje możliwość odkrycia innych specy-
Sirard M. A., Pothier F.: Seminal vesicle production and secretion of growth
ficznych dla nasienia sekwencji regulatorowych, za po- hormone into seminal fluid. Nat. Biotechnol. 1999, 17, 1087-1090.
2. Kerr D. E., Liang F., Bondioli K. R., Zhao H., Kreibich G., Wall R. J., Sun T. T.:
mocą których udałoby się uzyskać jeszcze większą ilość
The bladder as a bioreactor: urothelium production and secretion of growth
biofarmaceutyków.
hormone into urine. Nat. Biotechnol. 1998, 16, 75-79.
3. Massoud M., Bischoff R., Dalemans W., Pointu H., Attal J., Schultz H., Clesse D.,
Biofarmaceutyki mogą być również produkowane
Stinnakre M. G., Pavirani A., Houdebine L. M.: Expression of active recombi-
przez jedwabniki, naturalnego producenta jedwabiu dla
nant human alpha 1-antitrypsin in transgenic rabbits. J. Biotechnol. 1991, 18,
przemysłu włókienniczego. Jedwabnik morwowy (Bom- 193-203.
4. Pavlou A. K., Reichert J. M.: Recombinant protein therapeutics  success rates,
byx mori) wytwarza duże ilości białek kokonu, zbudo-
market trends and values to 2010. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 1513-1519.
wanego z niewielu rodzajów białek, potencjalnego z
ród-
5. Rapp J. C., Harvey A. J., Speksnijder G. L., Hu W., Ivarie R.: Biologically active
human interferon alpha-2b produced in the egg white of transgenic hens. Trans-
ła rekombinowanych białek, dzięki czemu łatwo wyod-
genic Res. 2003, 12, 569-575.
rębnić egzogenne białko. Dwa gruczoły jedwabne sta-
6. Sharma A., Martin M. J., Okabe J. F., Truglio R. A., Dhanjal N. K., Logan J. S.,
nowiące około 25% masy ciała produkują płynny jed- Kumar R.: An isologous porcine promoter permits high level expression of
human hemoglobin in transgenic swine. Biotechnology 1994, 12, 55-59.
wab składający się z włókienek fibroinowych sklejo-
7. Simons J. P., McClenaghan M., Clark A. J.: Alteration of the quality of milk by
nych serycyną. Wyspecjalizowane komórki gruczołu expression of sheep beta-lactoglobulin in transgenic mice. Nature 1987, 328,
530-532.
jedwabnego 85% mocy produkcyjnych przeznaczają na
8. Tomita M., Munetsuna H., Sato T., Adachi T., Hino R., Hayashi M., Shimizu K.,
produkcję jedwabiu. Każda z około 1000 komórek gru-
Nakamura N., Tamura T., Yoshizato K.: Transgenic silkworms produce recom-
binant human type III procollagen in cocoons. Nat. Biotechnol. 2003, 21, 52-56.
czołu produkuje dziennie 80 �g białka. Dla porówna-
9. Zbikowska H. M., Soukhareva N., Behnam R., Chang R., Drews R., Lubon H.,
nia: najbardziej wydajne pod względem produkcji re-
Hammond D., Soukharev S.: The use of the uromodulin promoter to target
kombinowanych białek komórki zwierzęce wytwarzają production of recombinant proteins into urine of transgenic animals. Trans-
genic Res. 2002, 11, 425-435.
około 50 pg białka dziennie. Dodatkowo w krótkim cza-
10.Zbikowska H. M., Soukhareva N., Behnam R., Lubon H., Hammond D.,
sie można osiągnąć dowolną liczebność jedwabnika.
Soukharev S.: Uromodulin promoter directs high-level expression of biologically
active human alpha1-antitrypsin into mouse urine. Biochem. J. 2002, 365, 7-11.
Wiele laboratoriów rozpoczęło już prace nad wykorzys-
taniem jedwabnika morwowego do ekspresji obcych
Adres autora: dr Daniel Lipiński, ul. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań;
genów (8). e-mail: [e-mail]