Temat: Wyznaczenie stałej Michaelita-Menten i oznaczanie aktywności enzymów

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia jest poznanie kinetyki enzymów (stałej K_m i wpływu stężenia enzymu na szybkość reakcji) na przykładzie dwóch enzymów z różnych klas - hydrolazy i oksydoreduktazy.

Metoda:

Aktywność fosfataz oznacza się zazwyczaj używając sztucznych substratów takich jak: 2-glicerofosforan, fenylofosforan, fosforan fenoloftaleiny, 4-nitrofenylofosforan. Aktywność enzymu mierzy się ilością uwolnionego fosforanu lub części organicznej estru po inkubacji enzymu z substratem w ściśle określonych warunkach. Szczególnie dogodny jako substrat jest 4-nitrofenylofosforan, ponieważ jeden z produktów reakcji przechodzi w formę barwną już po zalkalizowaniu środowiska.

Odczynniki:

1. Wyciąg enzymu

2. 0,0075 - molowy 4-nitrofenylofosforanu

3. 10 % roztwór NaCO₃

4. bufor o pH = 5,3

Szkło i inne pomoce:

1. 1 pipeta chemicznej na 1 i 5 ml oraz serologicznej

2. 8 probówek chemicznych

Wykonanie:

Do 6 ponumerowanych probówek odmierzono kolejno 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 4-nitrofenylofosforanu. Następnie dodano po 1,5 ml buforu o pH = 5,3 i uzupełnić wodą do objętości 4 ml, a do próby kontrolnej odmierzono 1,5 ml buforu i 2,5 ml wody.

Roztwory umieszczono na pięć minut w łaźni wodnej o temp. 38˚C. Następnie do każdej probówki dodano 1,0 ml enzymu, wymieszano i inkubowano przez 10 minut w temp. 38˚C. Po upływie wyznaczonego czasu zahamowano reakcje dodając 5 ml roztworu NaCO₃.

Obserwacje:

Po dodaniu do 4-nitrofenylofosforanu buforu o pH=5,3 oraz wody i pierwszej inkubacji nie zaobserwowano żadnej zmiany barwy. Po dodaniu enzymu drugiej inkubacji i dodaniu następnego odczynnika (roztwór NaCO₃) można dostrzec jak roztwór zmienia barwę z bezbarwnej na odcień zieleni. W zależności od stężenia substratu barwa jest intensywniejsza (przy większym), bądź mało intensywna (przy mniejszym).

Wyniki:

Po ustawieniu fotometru na próbę zerową uzyskano wyniki dla poszczególnych prób, następnie przedstawiono je w tabelce:

S	A420	A420 / 0,002 [μg]	V = [μg] / 139	1 / V	[S]	1 / [s]
0,1	0,142	71	0,511	1,96	0,00015	6666
0,2	0,17	85	0,612	1,64	0,0003	3333
0,4	0,2	100	0,719	1,39	0,0006	1666
0,6	0,216	108	0,776	1,29	0,0009	1111
0,8	0,218	109	0,784	1,28	0,0012	833
1,0	0,248	124	0,892	1,12	0,0015	666

Schemat rozcieńczeń

A- Absorpcja

0,002 - molowy współczynnik 4-nitrofenylofosforanu

139 - masa molowa produkt

Aktywność Fosfatazy wynosi 41,29

Wyznaczenie Stałej K_m

Wnioski :

Wartości stałej K_m wahają się w granicach od 10^-1 do 10^-8 i zależą od rodzaju enzymu, substratu, temperatury, pH. W określonych warunkach stała K_m jest wskaźnikiem powinowactwa enzymu do substratu. Wartość 2,16*10^-4 jest wartością stosunkowo niską zatem wskazuje na duże powinowactwo i dużą szybkość procesu katalitycznego.

Oznaczanie zawartości kwasu askorbinowego w materiale roślinnym

Cel ćwiczenia:

Ćwiczenie poświęcone jest zapoznaniu się z jedną z metod oznaczania zawartości kwasu askorbinowego w materiale biologicznym, opartą na reakcji jego utleniania

2,6-dichlorofenoloindofenolem.

Metoda miareczkowania:

Oznaczanie kwasu askorbinowego polega na jego utlenianiu za pomocą mianowanego roztworu barwnika 2,6- dichlorofenoloindofenolu. Jest to metoda oksydymetryczna , ponieważ stosuje się mianowany roztwór utleniacza. Zawartość kwasu askorbinowego oblicza się z ilości zużytego mianowanego roztworu barwnika.

Używany niebieski barwnik w środowisku kwaśnym w formie utlenionej ma barwę różową, a redukowanej jest bezbarwny. Trwała różowa barwa podczas miareczkowania powstaje po całkowitym utlenieniu kwasu askorbinowego w momencie dodania pierwszej kropli nadmiaru barwnika.

Wykonanie:

Odczynniki:

1. 2-proc. Kwas szczawiowy.

2. 0,0005 - molowy 2,6-dichlorofenoloindofenol;

3. 0,0005 - molowy mianowany roztwór tiosiarczanu sodowego.;

4. 1-molowy mianowany roztwór siarczku sodowego(Na₂S * 2H₂O).

Obliczenie miana 2,6-dichlorofenoloindofenolu (DCIP)

Oznaczanie kwasu askorbinowego:

Z rozcieńczonego w kolbie miarowej na 50 ml wyciągu z kapusty (15 ml), po uprzednim uzupełnieniu do 2% kwasem szczawiowym (35 ml) i wymieszaniu, pobrano dokładnie pipetą próbki po 10 ml, przeniesiono do kolby stożkowej i szybko miareczkowano

2-6 dichlorofenoloindofenolem, aż do uzyskania jasnoróżowego zabarwienia utrzymującego się w ciągu 30 sekund. Miareczkowanie wykonano 3-krotnie aż do uzyskania zbliżonych wyników.

Następnie wykonano identyczne miareczkowanie 10 ml próbek soku z cytryny (15 ml) rozcieńczonego i wymieszanego w kolbie miarowej na 50 ml z 2% kwasem szczawiowym

Wyniki powtórzeń umieszczono w tabeli:

Wyciąg z kapusty		Sok z cytryny
próba	wynik [ml]	próba	wynik [ml]
I	5,7	I	14,4
II	5,0	II	14,3
III	5,7	III	14,3

a) obliczam % zawartość kw. askorbinowego w wyciągu z kapusty

b) obliczam % zawartość kw. askorbinowego w soku z cytryny

Wnioski:

Ilość kwasu askorbinowego zawarta w soku z cytryny jest ponad dwukrotnie większa od zawartości tego kwasu z wyciągu z kapusty.

---