lipidy

Instytut Dietetyki

Ćwiczenie 2

SPORZĄDZANIE ROZTWORÓW O ZADANYM STĘŻENIU

1. Wprowadzenie

Wszystkie substancje, zarówno stałe, jak i ciecze oraz gazy wykazują zdolność wzajemnego rozpuszczania się w większym lub mniejszym stopniu.

W zależności od stanu skupienia rozpuszczalnika i rozpuszczanych substancji rozróżniamy roztwory stałe (mosiądz - roztwór cynku w miedzi), roztwory ciekłe (olej w benzynie) i roztwory gazowe (powietrze, roztwór tlenu i innych gazów w azocie).

W analizie chemicznej spotykamy najczęściej roztwory wodne (rozpuszczalnikiem jest woda), np.:

a) ciało stałe + woda: NaCl + H₂O; KOH + H₂O;

b) ciecz + woda: alkohol etylowy C₂H₅OH + H₂O; aceton (CH₃)₂ CO + H₂O;

c) gaz + woda: HCl + H₂O; NH₃ + H₂O; CO₂ + H₂O.

Równocześnie z procesem rozpuszczania niektórych gazów zachodzi reakcja chemiczna, czyli proces rozpuszczania gazów ma często charakter nie tylko fizyczny, ale również chemiczny.

NH₃ + H₂O = NH₄OH

CO₂ + H₂O = H₂CO₃

SO₃ + H₂O = H₂SO₃

Inne gazy, np. N₂, O₂, Ar rozpuszczają się w wodzie typowo fizycznie, bez wchodzenia w reakcję chemiczną.

Odczynniki chemiczne stosowane w laboratoriach biochemicznych w postaci roztworów można podzielić na roztwory o dokładnie ustalonym stężeniu (roztwory mianowane) oraz roztwory pomocnicze, których stosowanie wymaga tylko znajomości ich przybliżonego stężenia. Przybliżone stężenie to stopień rozcieńczenia stężonej substancji ciekłej (najczęściej kwasu) wodą. Wyraża się je podając obok wzoru kwasu liczb w nawiasie, np.: HCl (1+1) lub HCl (1:1) - ozn. kwas solny otrzymany przez rozcieńczenie 1 objętości stężonego kwasu solnego z 1 objętością wody; H₂SO₄ (1+4) lub H₂SO₄ (1:4) - ozn. kwas siarkowy otrzymany przez zmieszanie 1 objętości stężonego kwasu siarkowego z 4 objętościami wody.

Każdej substancji możemy przypisać określone właściwości:

a) Rozpuszczalność

Rozpuszczalność najprościej określa się jako stężenie roztworu nasyconego w określonej temperaturze i przy określonym ciśnieniu. Stężenie to wyrażane jest w % mas. lub w g substancji w 100 g roztworu.

b) Ciepło rozpuszczania

W trakcie sporządzania roztworów czy to przez rozpuszczanie substancji stałej czy przez rozcieńczanie substancji ciekłej możemy zaobserwować wydzielanie się ciepła (roztwór ogrzewa się) lub pochłanianie ciepła (roztwór oziębia się). Wiąże się to z ciepłem rozpuszczania (Q_r) danego związku chemicznego.

c) Gęstość

Gęstość, tj. masa jednostki objętości, dla substancji jednorodnych określana jest jako stosunek masy (m) do objętości (V): m

d = ---- [kg/m³; g/cm³]

V

wzrasta ze wzrostem stężenia i maleje ze wzrostem temperatury.

Związki chemiczne charakteryzują się różnymi gęstościami. Gęstość roztworu danego związku chemicznego jest zależna od jego stężenia i od temperatury;

d) Odczyn pH

Każdy roztwór ma określony odczyn. Roztwory mogą mieć odczyn kwaśny, obojętny i zasadowy.

e) Przewodnictwo elektryczne

Roztwory będące elektrolitami przewodzą prąd elektryczny. Im mocniejszy elektrolit tym wartość przewodnictwa elektrycznego w danych warunkach jest większa. Ze wzrostem temperatury przewodnictwo wzrasta.

2. Część doświadczalna

Należy sporządzić roztwory zadane przez prowadzącego oraz przeprowadzić obserwacje i pomiary wg poniższego planu:

1. Wykonanie obliczeń.

2. Odważenie i odmierzenie potrzebnych składników.

3. Sporządzanie roztworu.

4. Zaobserwowanie czy w trakcie sporządzania roztworu ciepło jest wydzielane (roztwór ogrzewa się) czy pochłaniane (roztwór oziębia się).

5. Pomiar gęstości roztworu przy pomocy areometru.

6. Obliczenie gęstości ze wzoru znając masę jednostki objętości (odważenie w naczyńku wagowym dokładnie odmierzonej porcji roztworu w temperaturze otoczenia).

7. Określenie odczynu roztworu (pH) przy pomocy papierków uniwersalnych.

Instytut Dietetyki

Ćwiczenie 4

WYBRANE METODY OZNACZANIA BIAŁKA - ANALIZA JAKOŚCIOWA.

OZNACZANIE STĘŻENIA BIAŁKA METODĄ BIURETOWĄ.

1. Wprowadzenie

Białka są związkami wielkocząsteczkowymi zbudowanymi z aminokwasów i występują w każdym żywym organizmie. Budowa, funkcja i specyficzne właściwości białek określone są przez skład i sekwencję aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym oraz przez przestrzenne ukształtowanie cząsteczki. Białka tworzą połączenia z różnymi substancjami niebiałkowymi, są to tzw. białka złożone, np. hemoproteiny, nukleoproteidy, metaloproteiny, glikoproteiny, lipoproteiny. Wszystkie białka wykazują zdolność m.in. do wiązania jonów, wędrują w polu elektrycznym dzięki ładunkowi elektrycznemu cząsteczek, ulegają wysalaniu pod wpływem soli (silnych elektrolitów), są wrażliwe na podwyższoną temperaturę i inne czynniki denaturujące.

Denaturacja białek obejmuje zmiany w konformacji łańcucha polipeptydowego, wskutek których białko traci swoje właściwości. Czynniki denaturujące działają na wiązania (wodorowe, jonowe, hydrofobowe, dwusiarczkowe, koordynacyjne), które stabilizują przestrzenną strukturę białek. Pod wpływem tych czynników ulega zniekształceniu lub zniszczeniu struktura IV, III lub II rzędowa białka. Denaturację białka wywołują niektóre czynniki fizyczne, takie jak: ogrzewanie, wysychanie, ultradźwięki oraz czynniki chemiczne. Do chemicznych czynników denaturujących zaliczamy m.in.: kwasy, zasady, jony metali ciężkich, mocznik, detergenty, alkohol, aceton.

Odczyny barwne białek

Ze względu na złożoną budowę i zawartość aminokwasów o różnych rodnikach białka wykazują reakcje barwne z różnymi odczynnikami chemicznymi, np. z ninhydryną, gdyż mają wolną grupę α-aminową. Reagują także z kwasem azotowym (odczyn ksantoproteinowy). O obecności wiązań peptydowych świadczy dodatni odczyn biuretowy (zabarwienie niebiesko-fioletowe).

Kolorymetryczne oznaczanie białek

Metoda biuretowa to jedna z najczęściej wykonywanych reakcji w analizie białek, pozwalająca wykryć białko i oznaczyć je ilościowo - spektrofotometrycznie.

Białka i peptydy zawierające co najmniej dwa wiązania peptydowe tworzą w środowisku zasadowym z jonami Cu²⁺ barwne kompleksy. Intensywność powstałego niebiesko-fioletowego zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia białka.

Nazwa reakcji pochodzi stąd, że biuret (produkt kondensacji dwóch cząsteczek mocznika H₂N - CO - HN - CO - NH₂) również daje podobny odczyn z jonami Cu²⁺. Metoda biuretowa nie nadaje się do oznaczenia stężenia białka w obecności soli amonowych i siarczanu magnezu, gdyż sole te przeszkadzają w ilościowym wiązaniu jonów Cu²⁺.

2. Część doświadczalna

Doświadczenie 1. Wykrywanie białka metodą denaturacji termicznej

Odczynniki:

1). 1% roztwór glicyny

2) Roztwór białka jaja kurzego: rozpuścić białko jednego jaja w 100 ml 2% NaCl

3). 70% roztwór kwasu octowego.

Wykonanie:

Odmierzyć do dwóch probówek po 2 ml: do pierwszej - roztworu glicyny, do drugiej - roztworu białka jaja. Ogrzać probówki nad palnikiem. Dodać kilka kropli roztworu kwasu octowego (aby doszło do denaturacji roztwór musi mieć odczyn słabo kwaśny) i zagotować. Białko wytrąca się w postaci białego kłaczkowatego osadu. Zależnie od ilości białka osad może przybierać różną postać - od delikatnego zmętnienia, w przypadku małej ilości, do zupełnego ścięcia się badanej próby, gdy białka jest bardzo dużo.

Badany roztwór	Ilość badanego roztworu (ml)	Kwas octowy (ml)	Wynik
glicyna białko jaja	2 2	0,5 0,5

Doświadczenie 2. Odczyny barwne białek - reakcja z ninhydryną.

NINHYDRYNA (wodzian triketohydrindenu)

Zasada metody:

Wszystkie wolne aminokwasy oraz aminokwasy białek z wolną grupą α-aminową reagują z ninhydryną, tworząc niebiesko-różowawy barwnik.

Odczynniki:

1). 1% roztwór glicyny

2) Roztwór białka jaja kurzego: rozpuścić białko jednego jaja w 100 ml 2% NaCl

3). 0,1% roztwór ninhydryny w acetonie.

Wykonanie:

Odmierzyć do dwóch probówek po 1 ml: do pierwszej - roztworu glicyny, do drugiej - roztworu białka jaja. Do obu dodać po 1 ml roztworu ninhydryny w acetonie i ogrzewać przez 1 min we wrzącej łaźni wodnej.

Badany roztwór	Ilość badanego roztworu (ml)	Ninhydryna (ml)	Wynik
glicyna białko jaja	1 1	1 1

Doświadczenie 3. Reakcja ksantoproteinowa, na obecność pierścieni aromatycznych

Zasada metody:

Żółta barwa powstająca w tej reakcji pochodzi od nitrowych pochodnych pierścieni benzenowych zawartych w takich aminokwasach, jak: fenyloalanina, tyrozyna, tryptofan. Dodatek zasady pogłębia zabarwienie pochodnych.

Odczynniki:

1). 1% roztwór glicyny.

2). Roztwór białka (roztwór białka jaja kurzego).

3). Stężony kwas azotowy.

4). 6 M roztwór NaOH

Wykonanie:

Do dwóch probówek zawierających po 1 ml roztworu glicyny i roztworu białek dodać po 1 ml stężonego kwasu azotowego, wymieszać i ogrzać przez 5 min. We wrzącej łaźni wodnej. Po schłodzeniu probówek dodać do obu stopniowo (ostrożnie!) po 3,5 ml wodorotlenku sodu.

Badany roztwór	Ilość badanego roztworu (ml)	Kwas azotowy (ml)	Wodorotlenek sodu (ml)	Wynik
glicyna białko jaja	1 1	1 1	3,5 3,5

Doświadczenie 4. Oznaczanie stężenia białka metodą biuretową

Odczynniki:

1). Odczynnik biuretowy.

2). Wzorcowy roztwór białka (1%). W kolbie miarowej o pojemności 100 cm³ rozpuścić w 50 cm³ 0,9% roztworu chlorku sodu 1 g preparatu albuminy wołowej i uzupełnić do kreski 0,9% roztworem chlorku sodu.

3). 0,9% roztwór chlorku sodu.

4). Roztwór białka o zakodowanym stężeniu.

Wykonanie:

1). Sporządzenie krzywej wzorcowej. Do 5 zlewek pobrać kolejno: 0,8, 1,6, 2,4, 3,6, i 4 cm³ roztworu wzorcowego. Uzupełnić do objętości 4 cm³ 0,9% roztworem chlorki sodu, a następnie do każdej zlewki dodać po 16 cm³ odczynnika biuretowego, dokładnie wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 minut. Zmierzyć wartość absorpcji prób (liczbowe wyrażenie - absorbancja, ekstynkcja) przy długości fali λ=540 nm. Próbą odniesienia jest próba przygotowana w identyczny sposób, lecz zawierająca zamiast białka 0,9% roztwór chlorku sodu.

Wykreślić krzywą wzorcową, odkładając na osi rzędnych wartości absorbancji, a na osi odciętych zawartość białka w mg/100 cm³.

2). Oznaczenie w badanej próbce. Kolbę miarową o poj. 25 cm³ zawierającą roztwór białka o zakodowanym stężeniu uzupełnić 0,9% roztworem NaCl do kreski. Z tak przygotowanego roztworu odmierzyć pipetą do zlewki 4 cm³ badanego roztworu białka (c białka < 1%), dodać 16 cm³ odczynnika biuretowego i postępować dalej tak, jak przy próbach wzorcowych. Zawartość białka odczytać z krzywej wzorcowej.

Doświadczenie 2. Badanie właściwości redukujących skrobi przed i po hydrolizie.

Zasada metody: Skrobia pod wpływem kwasów ulega stopniowej hydrolizie przez stadium dekstryn do maltozy i małej ilości glukozy. Pośrednimi produktami są: amylodekstryny (zabarwienie z jodem fioletowe), erytrodekstryny (czerwone), achro- i maladekstryny oraz maltoza (zabarwienie z jodem nie powstaje). W miarę hydrolizy wzrastają również stopniowo właściwości redukujące.

Odczynniki:

1) Odczynnik Benedicta.

2) 1% roztwór skrobi.

3) Stężony roztwór HCl lub H₂SO₄.

4) 1-2 M roztwór NaOH.

Wykonanie:

Do 10 ml roztworu skrobi dodać 1 ml stężonego roztworu HCl lub H₂SO₄ (końcowe stężenie kwasu powinno być 1-2 M) i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej. W statywie ustawić 2 szeregi probówek po 10 sztuk i co minutę przenosić po 0,5 ml do probówek pierwszego i drugiego szeregu. W pierwszym szeregu probówek zawierającym po 1 ml bardzo rozcieńczonego roztworu jodu barwienie zmienia się kolejno z niebieskiego, przez fioletowe, czerwone, brunatne na bezbarwne. Drugi szereg probówek zobojętnić wodorotlenkiem sodowym (1 ml) i wykonać próbę Benedicta (doświadczenie 1). Obserwować coraz wyraźniejszą redukcję w miarę trwania hydrolizy.

Doświadczenie 3. Oznaczenie ilościowe glukozy metodą miareczkową Hagedorna-Jensena.

Zasada metody:

Glukoza zawarta w roztworze redu­kuje na gorąco sześciocyjanożelazian potasowy do sześciocyjanożelazinu. W celu przesunięcia równowagi reakcji w prawo, sześciocyjanożelazin potasowy wytrąca się w postaci nierozpuszczalnej soli cynku. Nad­miar nie zredukowanego przez glukozę sześciocyjanożelazianu redukuje się jodkiem potasowym. Wytworzony w tej reakcji jod cząsteczkowy miareczkuje się tiosiarczanem sodowym w obecności kleiku skrobiowe­go. Im więcej badana próbka zawiera glukozy, tym mniej tworzy się jodu w reakcji jodku potasowego z sześciocyjanożelazianem potasowym.

[Fe(CN)₆]^3- + e^- → [Fe(CN)₆]^4-

glukoza

2K₄[Fe(CN)₆] + 3ZnSO₄ → K₂Zn₃[Fe(CN)₆]₂ + 3K₂SO₄

2K₃[Fe(CN)₆] + 2KI → 2K₄[Fe(CN)₆] + I₂

nadmiar

I₂ + 2Na₂S₂O_{3 →} 2NaI + Na₂S₄O₆

Odczynniki:

1). Roztwór sześciocyjanożelazianu potasowego 0,005 mol/l.

2). Odczynnik jodkowo-siarczanowo-chlorkowy.

3). 3% roztwór kwasu octowego.

4). Roztwór tiosiarczanu sodowego 0,005 mol/l.

5). Wskaźnik skrobiowy.

6). Roztwór glukozy o zakodowanym stężeniu (próba właściwa).

Wykonanie:

Do 2 kolb stożkowych zawierających próbę właściwą i próbę ślepą odmierzyć bardzo dokładnie po 2 ml zasadowego roztworu sześciocyjanożelazianu potasowego. Kolby umieścić we wrzącej łaźni wod­nej i ogrzewać przez 15 min. Szybko ochłodzić pod bieżącą wodą, a następnie dodać po 3 ml odczynnika jodkowo-siarczanowo-chlorkowego i po 2 ml kwasu octowego. Wymieszać i po 2 min miareczkować z mikrobiurety 0,005 mol/l roztworem tiosiarczanu sodowego do barwy słomko­wej. Dodać wskaźnika skrobiowego i dalej miareczkować do odbarwie­nia.

Instytut Dietetyki

Ćwiczenie 5

BADANIE WŁAŚCIWOŚCI REDUKUJĄCYCH GLUKOZY, SACHAROZY, SKROBI PRZED HYDROLIZĄ I PO NIEJ. OZNACZANIE STĘŻENIA GLUKOZY.

1. Wprowadzenie

Węglowodany (mono-, oligosacharydy) z wolną grupą aldehydową lub ketonową wykazują właściwości redukujące. W roztworze zasadowym redukują one jony metali, jak np. Cu²⁺, Bi³⁺, i Ag⁺. Oligosacharydy powstają przez połączenie wiązaniem glikozydowym kilku cząsteczek (2-6) monosacharydów. W przyrodzie najczęściej występują dwucukry, które mogą być utworzone z cząsteczek tego samego cukru prostego, np. maltoza (zbudowana z 2 cząsteczek glukozy) lub cząsteczek różnych cukrów, np. sacharoza (glukoza + fruktoza). W wyniku polikondensacji monosacharydów połączonych wiązaniem glikozydowym powstają wielocukry (polisacharydy). Wielocukry nie mają właściwości redukujących i są nierozpuszczalne w wodzie. Na gorąco tworzą roztwory koloidalne o dużej lepkości.

Węglowodany są jednym z głównych składników pokarmowych dorosłego człowieka. Najważniejsze z nich to: skrobia, sacharoza, laktoza mleka, glikogen zwierzęcy. Są głównymi substratami energetycznymi ustroju. Podstawowym źródłem glukozy dla organizmu są węglowodany pożywienia oraz wewnątrzkomórkowa synteza glukozy (glukoneogeneza) i rozpad glikogenu wątrobowego (glikogenoliza).

2. Część doświadczalna

Doświadczenie 1. Wykrywanie cukrów redukujących metodą Benedicta.

Zasada metody: W obecności sacharydu (np. glukozy) miedź redukuje się ze stopnia utlenienia +2 do stopnie utlenienia +1. Jest to najbardziej czuła i swoista próba redukcyjna na cukry.

CuSO₄ + Na₂CO₃ → CuCO₃ + Na₂SO₄

glukoza

CuCO₃ + cytrynian sodowy → rozpuszczalny kompleks

2CuCO₃ - kompleks → Cu₂O + 2CO₂

Odczynniki:

1). Odczynnik Benedicta.

2). Roztwór glukozy o zakodowanym stężeniu.

3) Roztwór sacharozy o zakodowanym stężeniu.

Wykonanie:

Do 2 probówek zawierających po 5 ml odczynnika Benedicta wprowadzić po 0,5 ml roztworu glukozy i 0,5 ml roztworu sacharozy, wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Po tym czasie wyjąć i ostudzić zawartość, trzymając probówkę pod bieżącą wodą. Roztwory mogą zmienić barwę i może pojawić się osad. Z barwy roztworu można w przybliżeniu ocenić stężenie cukru w roztworze:

Barwa roztworu________Przybliżona zawartość cukru w roztworze [%]

Brak zmian 0

Zielona, brak osadu 0,1-0,3

Zielona, osad 0,5

Żółtozielona, osad 1,0

Pomarańczowa, osad 1,5

Czerwona, osad______________________2,0 i więcej_________

Instytut Dietetyki

Obliczenie:

W tabeli pierwsza kolumna pionowa zawiera jednostki i dziesiętne części ml tiosiarczanu sodowego, ściśle 0,005 mol/l. Pierwszy rząd poziomy oznacza setne części 0,005 mol/l roztworu tiosiarczanu sodowego. Liczby w dalszych kolumnach tabeli, na skrzyżowaniu odpowiednich objętości tiosiarczanu sodowego, oznaczają stężenie glukozy w mg/dl. Z tabeli oddzielnie odczytuje się ilość glukozy dla próby właściwej, oddzielnie dla próby ślepej. Różnica między pierwszą wartością (całkowita redukcja) a drugą (próba ślepa — redukcja zanieczyszczeń) odpowiada ilości substancji redukujących badanej próby wyrażonych w miligramach glukozy na dl.

Przykład:

Jeżeli na zmiareczkowanie próby ślepej i badanej zużyto odpowiednio 1,95 i 1,15 ml tiosiarczanu, to w tabeli na skrzyżowaniu 1,1 ml i 0,05 ml tiosiarczanu znajduje się wartość 150 mg/dl, stanowiąca ogólną ilość substancji redukujących, a na skrzyżo­waniu 1,9 i 0,05 ml znajduje się wartość 8 mg/dl, stanowiąca ilość zanieczyszczeń re­dukujących. Różnica (150 mg/dl — 8 mg/dl = 142 mg/dl) określa stężenie glukozy w ba­danej próbce.

Do wyrażenia wyników w milimolach na 1 litr należy ilość miligramów glukozy za­wartych w dl pomnożyć przez 10 i podzielić przez milimol glukozy, tj. przez 180, np.:

Zależność między ilością zużytego do miareczkowania tiosiarczanu sodowego a stęże­niem glukozy (mg/dl)¹

Tiosiarczan 0,005 mol/l (ml)	0,00	0,01	0,02	0,03	0,04	0,05-	0,06	0,07	0,08	0,09
0,0	385	382	379	376	373	370	367	364	361	358
0,1	355	352	350	348	345	343	341	338	336	333
0,2	331	329	327	325	323	321	318	317	134	312
0,3	310	308	306	304	302	300	298	296	294	292
0,4	290	288	286	284	282	280	278	276	274	272
0,5	270	268	266	264	262	260	259	257	255	253
0,6	251	249	247	245	243	241	240	238	236	234
0,7	232	230	228	226	224	222	221	219	217	215
0,8	213	211	209	208	206	204	202	200	198	197
0,9	195	193	191	190	188	186	184	182	181	179
1,0	177	175	173	172	170	168	166	164	163	161
1,1	159	157	155	154	152	150	148	146	145	143
1,2	141	139	138	136	134	132	131	129	127	125
1,3	124	122	120	119	117	115	113	111	110	108
1,4	106	104	102	101	99	97	95	93	92	90
1,5	88	86	84	83	81	79	77	75	74	72
1,6	70	68	66	65	63	61	59	57	56	54
1,7	52	50	48	47	45	43	41	39	38	36
1,8	34	32	31	29	27	25	24	22	20	19
1,9	17	15	14	12	10	8	7	5	3	2

¹ Wartości podane w mg/dl wg oryginalnej metody przelicza się na stężenie w mmol/l:

mg/dl • 10/180 = mmol/l.

Instytut Dietetyki

Ćwiczenie 7

WPŁYW CZYNNIKÓW FIZYCZNYCH NA SZYBKOŚĆ REAKCJI ENZYMATYCZNYCH.

OCENA AKTYWNOŚCI ENZYMÓW.

1. Wprowadzenie

Enzymy są biokatalizatorami wytwarzanymi przez żywe organizmy. Przyspieszają szybkość reakcji zachodzących w organizmie, poprzez obniżanie energii aktywacji.

Szybkość reakcji enzymatycznych zależy od wielu czynników, m.in. od: stężenia substratu, stężenia enzymu, temperatury, pH środowiska, obecności aktywatorów, obecności inhibitorów. Badaniem zależności miedzy szybkością przebiegu reakcji i różnymi czynnikami zajmuje się kinetyka reakcji chemicznych. Enzymy tworząc przejściowe połączenia z substratem zmniejszają energię aktywacji, obniżając barierę energetyczną pomiędzy reagującymi cząsteczkami. Następnie kompleks enzym-substrat ulega rozpadowi na produkt reakcji i wolny enzym: E+S → E-S → E+P E - enzym, S - substrat, E - S - kompleks enzym-substrat, P - produkt

CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA SZYBKOŚĆ REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Stężenie substratu

Przy stałym poziomie enzymu szybkość reakcji enzymatycznej wzrasta początkowo wraz ze wzrostem stężenia substratu, jednak w momencie całkowitego wysycenia enzymu substratem reakcja osiąga tzw. szybkość maksymalną (Vmax). Dalsze zwiększanie stężenia substratu nie przyczynia się już do przyspieszenia szybkości reakcji (może nawet, wręcz przeciwnie, doprowadzić do obniżenia szybkości reakcji).

Stężenie enzymu

Związek miedzy szybkością reakcji i stężeniem enzymu można zaobserwować, gdy w środowisku jest nadmiar substratu. Szybkość reakcji jest proporcjonalna do stężenia enzymu.

Temperatura

Wzrostowi temperatury towarzyszy przyspieszenie reakcji enzymatycznej. Jednak po osiągnięciu pewnego optimum w danych warunkach, reakcja ulega spowolnieniu w następstwie denaturacji cieplnej enzymu. Większość enzymów traci nieodwracalnie aktywność po przekroczeniu temperatury 65°C.

pH

Stężenie jonów wodorowych jest czynnikiem silnie wpływającym na szybkość reakcji enzymatycznej. Dla każdego enzymu istnieje optymalne dla jego działania pH.

Aktywatory

Aktywatory to różnego rodzaju substancje, nie biorące udziału w reakcji katalitycznej, które uczynniają enzymy lub zwiększają ich aktywność.

Inhibitory

Inhibitory są substancjami obniżającymi lub całkowicie znoszącymi aktywność enzymatyczną.

Amylazy są enzymami hydrolizującymi wiązania α-1,4-glikozydowe w α-glikanach (skrobia, glikogen). Znane są trzy rodzaje amylaz: α-amylaza, β-amylaza i γ-amylaza (glukoamylaza). α-amylaza (endoenzym) atakuje wiazania znajdujące się w środku łańcucha, natomiast β-amylaza (egzoamylaza) i γ-amylaza rozrywają odpowiednio co drugie lub kolejne wiązania glikozydowe, rozpoczynając od nieredukującego końca łańcucha wielocukru. W wyniku działania α-amylazy, wchodząca w skład skrobi amyloza (długie, nierozgałęzione łańcuchy reszt glukozy) rozkładana jest do drobnocząsteczkowych dekstryn, złożonych z 6-7 reszt glukozowych. Prowadzi to do szybkiego zaniku reakcji z jodem, spadku lepkości oraz powolnego przyrostu redukcyjności roztworu. W związku z tym α-amylaza nazywana jest enzymem dekstrynotwórczym. W przypadku działania β-amylazy i γ-amylazy, odcinających cząsteczki glukozy lun maltozy, obserwuje się z kolei powolny zanik reakcji z jodem i powolny spadek lepkości, a szybki przyrost redukcyjności roztworu. Dlatego też te dwa egzoamylazy nazywane są cukrotwórczymi. W skład skrobi wchodzi, obok amylazy, wchodzą również rozgałęzione łańcuchy amylopektyny, zawierające obok wiązań α-1,4, wiązania α-1,6 glikozydowe, występujące w miejscu rozgałęzień łańcucha. Wiązania te stanowią barierę dla działania α-amylazy i β-amylazy i w związku z tym powstaje nierozłożona wielkocząsteczkowa dekstryna graniczana, wykazująca znaczną lepkość w roztworze oraz fioletową barwę z jodem. W wyniku jednoczesnego działania α-amylazy i β-amylazy amylopektyna może zatem ulegać rozładowi do maltozy, izomaltozy oraz niewielkich ilości glukozy. Enzymem zdolnym do rozkładania zarówno wiązań α-1,4, jak i α-1,6 glikozydowych, γ-amylaza. Przy jej udziale amylopektyna i glikogen ulegają rozkładowi do glukozy. U człowieka i zwierząt występują α-amylaza i γ-amylaza. Pierwszą z nich stwierdza się w: trzustce, gruczołach ślinowych, wątrobie, nerkach, płucach, w mniejszych ilościach w śledzionie, mięśniach szkieletowych, sercu, mózgu. Z płynów ustrojowych największą aktywność amylazy wykazują sok trzustkowy i ślina, mniejszą - osocze i mocz. Z kolei γ-amylaza pochodzi z komórek nabłonkowych jelita cienkiego. Największe znaczenie kliniczne ma oznaczanie aktywności amylazy w przypadku schorzeń trzustki i ślinianek.

2. Część doświadczalna

Doświadczenie 1: Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej

Wzrost szybkości reakcji pod wpływem temperatury jest wynikiem aktywności cząsteczek substratów. Energia ta, zwana energią aktywacji, powoduje rozluźnienie wiązań w reagujących cząsteczkach oraz służy do pokonania sił odpychania międzycząsteczkowego.

Odczynniki:

1). Bufor fosforanowy (0,1 mol/l) o pH 7,0.

2). 1% roztwór skrobi.

3). 0,01% jod w 0,02% KJ.

4). 0,9% NaCl.

5). Roztwór amylazy.

Wykonanie: Przygotować cztery probówki, oznaczyć je kolejno numerami od 1 do 4. Do każdej z nich wprowadzić 2 ml buforu fosforanowego o pH 7,0 oraz 2 ml roz­tworu amylazy. Zawartość probówki nr 1 zagotować natychmiast nad palnikiem, a następnie wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut, po czym ochłodzić. Do każdej z czterech probówek dodać: 2 ml 1% roztworu skrobi oraz 0,2 ml 0,01% roztworu jodu w 0,02% KJ. Probówki nr 1 i 2 pozostawić w temperaturze pokojowej. Probówkę nr 3 wstawić do zlewki z lodem. Probówkę nr 4 umieścić w łaźni wodnej o temp. 37°C. Po 10 min porównać zabarwienie w probówkach (skrobia nie rozłożona barwi się z jodem na kolor niebieski).

Doświadczenie 2. Wpływ stężenia enzymu na szybkość reakcji enzymatycznych

Odczynniki:

1). Bufor fosforanowy (0,1 mol/l) o pH 7,0.

2). 1% roztwór skrobi.

3). 0,01% jod w 0,02% KJ.

4). 0,9% NaCl.

5). Roztwór amylazy.

Wykonanie: Przygotować trzy probówki do każdej odmierzyć po 2 ml buforu fosfora­nowego o pH 7,0 i 2 ml 1% roztworu skrobi. Następnie do probówek dodać roztwór amylazy i 0,9% NaCl wg schematu:

1 probówka - 2 ml roztworu amylazy,

2 probówka - 1 ml roztworu amylazy + 1 ml 0,9% NaCl,

3 probówka - 0,4 ml roztworu amylazy + 1,6 ml 0,9% NaCl. Wstawić probówki na 10 min do łaźni wodnej o temp. 37°C. Następnie ochłodzić i dodać 0,2 ml roztworu jodu w KJ. Porównać zabarwienie w probówkach.

Doświadczenie 3: Oznaczanie aktywności amylazy metodą Wohlgemutha

Amylaza rozkłada skrobię do produktu nie dającego barwnego zabarwienia z jodem. W metodzie tej poszukujemy największego rozcieńczenia badanego materiału, które zachowuje zdolność do rozłożenia skrobi do produktów nie dających reakcji barwnej z jodem.

Odczynniki:

1). 0,1% roztwór skrobi.

2). Roztwór fizjologiczny NaCl.

3). 0,01 % roztwór jodu w KJ.

4). Roztwór amylazy.

Wykonanie: Do 10 ponumerowanych probówek odmierzyć po 1 ml fizjologicznego roztworu NaCl. Do pierwszej probówki dodać 1 ml 10-krotnie rozcieńczonej fizjologicznym roztworem NaCl śliny i dokładnie wymieszać. 1 ml roztworu z pierwszej probówki przenieść do drugiej probówki. Dokładnie wymieszać i przenieść 1 ml roztworu z drugiej probówki do trzeciej itd. W ten sposób otrzy­muje się szereg rozcieńczeń (stężenie śliny, a tym samym i amylazy, jest w każdej następnej probówce dwa razy mniejsze niż w poprzedniej):

Probówka 1 - 1: 20 2 - 1: 40 3 - 1: 80 4 - 1: 160 5 - 1: 320

6 - 1: 640 7 - 1: 1 280 8 - 1: 2 560 9 - 1: 5 120 10 -1: 10 240

Z probówki 10, po wymieszaniu zawartości, odpipetować 1 ml roztworu i zachować do ewentualnych dalszych rozcieńczeń.

Do wszystkich probówek wprowadzić (rozpoczynając od probówki 10) po 2,0 ml 0,1% roztworu skrobi. Dodawanie skrobi należy rozpocząć od największego rozcieńczenia amylazy (najwolniejszy rozkład skrobi), aby powstały na skutek niejednoczesnego wprowadzania skrobi błąd był jak najmniejszy.

Wszystkie probówki wstawić równocześnie do łaźni wodnej o temperatu­rze 38°C na 30 minut. Następnie wyjąć probówki z łaźni, ochłodzić pod bieżącą wodą i do każdej dodać 4-5 kropli roztworu jodu w KJ. Wymieszać i obserwować zabarwienie w kolejnych 10 probówkach. Zabarwienie żółte świadczy o rozłożeniu skrobi, czerwonobrązowe o obecności dekstryn, niebieskie oznacza obecność skrobi lub początkowych produktów jej rozpadu.

Obliczanie aktywności amylazy w ślinie:

Do każdej probówki wprowadzono po 2 ml 0,1% roztworu skrobi (co odpowiada 2 mg skrobi). Pełne rozszczepienie skrobi nastąpiło w tych probówkach, w których stwierdzono brak zabarwienia niebieskiego.

Przypuśćmy, że będzie to probówka 5. Znajduje się w niej 1/320 ml nierozcieńczonej śliny, co odpowiada:

320 • 2 = 640 jednostek Wohlgemutha/ml śliny.

Jednostka Wohlgemutha (JW) jest to taka ilość amylazy, która w ciągu 30 minut w temperaturze 38°C rozkłada 1 mg skrobi do dekstryn.

Instytut Dietetyki

Ćwiczenie 3

RÓWNOWAGI W WODNYCH ROZTWORACH ELEKTROLITÓW - DYSOCJACJA ELEKTROLITYCZNA, PH, HYDROLIZA.

1. Wprowadzenie

Dysocjacja elektrolityczna

Elektrolity są to związki, które podczas rozpuszczania w wodzie ulegają rozpadowi na jony odpowiedzialne za przewodzenie prądu elektrycznego. Do tej grupy związków zalicza się kwasy, zasady i sole. Proces rozpadu substancji na jony pod wpływem rozpuszczalnika nazywamy dysocjacją elektrolityczną, którą charakteryzują dwie wielkości: stopień dysocjacji i stała dysocjacji.

Stopień dysocjacji (α) jest to stosunek liczności tej części elektrolitu, która ulega dysocjacji (n) do całkowitej liczności tego elektrolitu w roztworze (n₀).

α = n/n₀

Stopień dysocjacji zależy od kilku czynników, m.in. od rodzaju elektrolitu, rodzaju rozpuszczalnika, temperatury, stężenia roztworu. Stopień dysocjacji może przyjmować wartości z zakresu od 0 do 1. Elektrolity w roztworach wodnych mogą ulegać dysocjacji całkowitej (n = n₀) lub częściowo (n<n₀). Ze względu na stopień dysocjacji elektrolity możemy podzielić na mocne i słabe. Elektrolity mocne są w roztworach wodnych, niezależnie od stężenia, całkowicie dysocjowane na jony, czyli ich stopień dysocjacji jest praktycznie równy jedności. Należą do nich wszystkie sole, kwas solny, kwas bromowodorowy, kwas jodowodorowy, kwas azotowy (V), kwas chlorowy (VII), wodorotlenki litowców oraz wodorotlenek wapnia. Elektrolity słabe w roztworze wodnym oprócz formy zdysocjowanej występują także w formie niezdysocjowanych cząsteczek. Należą do nich między innymi: kwas azotowy(III), kwas węglowy(IV), kwas cyjanowodorowy, kwas octowy i inne kwasy karboksylowe, wodny roztwór amoniaku, wodorotlenki metali ciężkich.

Równania dysocjacji elektrolitycznej dla wybranych elektrolitów można przedstawić następująco:

HCl →H⁺ + Cl^-

HNO₂ ↔ H⁺ + NO₂^-

Na₂SO₄ → 2Na⁺ + SO₄ ^2-

Strzałki skierowane w przeciwnych kierunkach oznaczają częściową dysocjację elektrolitu słabego, natomiast strzałka skierowana w prawo oznacza całkowitą dysocjację elektrolitu mocnego.

Stała dysociacii K (ogólnie dla reakcji AB ↔ A⁺ + B^-) jest to stosunek iloczynu stężeń produktów do stężenia niezdysocjowanego elektrolitu:

[A⁺] [B^-]

K = ----------- , gdzie [A⁺], [B^-], [AB] - stężenia molowe produktów dysocjacji

[AB] i cząsteczek niezdysocjowanych w stanie równowagi.

Iloczyn jonowy wody, pH

Woda należy do elektrolitów bardzo słabych. Dysocjuje według równania:

2 H₂O ↔ H₃O⁺ + OH^- (dla uproszczenia piszemy H₂O ↔ H⁺ + OH^-)

Stała dysocjacji wody ma postać:

[H⁺] [OH^-]

K = --------------

[H₂O]

Ponieważ stężenie [H₂O] w czystej wodzie i w roztworach rozcieńczonych można przyjąć za wielkość stałą (cH₂O = 55,4 mol/dm³), iloczyn K[H₂O]=[H⁺][OH^-] dla ustalonej siły jonowej jest również wielkością stałą definiowaną jako iloczyn jonowy wody K_w.

Wartość pK_w = -log K_w przy sile jonowej I = 0 w temperaturze 298K = 14,00.

W celu uniknięcia operowania bardzo małymi liczbami, zamiast stężenia jonów wodorowych posługujemy się wartościami pH zdefiniowanymi wzorem:

pH = -log[H⁺]

Logarytmując obustronnie zależność K_w = [H⁺] [OH^-] i korzystając z definicji pH i pOH otrzymuje się wyrażenie na iloczyn jonowy wody w postaci:

pKw = pH + pOH

Jeżeli jony H⁺ i OH^- powstają wyłącznie z dysocjacji wody, to [H⁺] = [OH^-], czyli pH = pOH, co oznacza, że roztwór jest obojętny. Wprowadzenie do roztworu kwasu lub zasady powoduje zmianę położenia równowagi reakcji dysocjacji wody. W roztworach kwaśnych pH < 7, a roztworach zasadowych pH >7.

Do najczęściej stosowanych metod pomiaru pH należą metoda potencjometryczna i wskaźnikowa. W metodzie potencjometrycznej wykorzystuje się zależność między potencjałem odpowiednich elektrod a stężeniem kationów wodorowych w roztworze. Do pomiaru pH stosuje się przyrządy zwane pehametrami, W metodzie wskaźnikowej wykorzystuje się zmiany barwy roztworów wskaźników kwasowo-zasadowych lub papierków wskaźnikowych w zależności od pH roztworu.

Hydroliza

Hydroliza oznacza reakcję anionów słabego kwasu lub kationu słabej zasady z cząsteczkami wody. Hydrolizie ulegają kationy słabych zasad i aniony słabych kwasów pochodzących od soli słabych zasad i mocnych kwasów, soli słabych kwasów i mocnych zasad oraz soli słabych kwasów i słabych zasad. Hydrolizie nie ulegają aniony mocnych kwasów i kationy mocnych zasad.

Hydroliza soli słabych zasad i mocnych kwasów oraz słabych kwasów i mocnych zasad. Po rozpuszczeniu w wodzie sole całkowicie ulegają dysocjacji, przykładowo:

NH₄CI → NH₄⁺ + Cl^-

CH₃COONa → CH₃COO^- + Na⁺

Następnie kation słabej zasady lub anion słabego kwasu ulega hydrolizie według równania:

NH₄⁺ + H₂O = NH₄OH + H⁺

CH₃COO^- + H₂O = CH₃COOH + OH^-

Z równań tych wynika, że roztwór soli słabej zasady i mocnego kwasu będzie miał odczyn kwaśny a roztwór soli słabego kwasu i mocnej zasady będzie miał odczyn zasadowy. Wartości pH tych roztworów są zależne od wartości stałych dysocjacji słabych elektrolitów. W przypadku soli słabej zasady i mocnego kwasu wartość pH roztworu będzie maleć wraz z obniżaniem wartości stałej dysocjacji słabej zasady. W przypadku soli słabego kwasu i mocnej zasady wartość pH będzie rosła wraz z obniżaniem wartości stałej dysocjacji słabego kwasu. Z przedstawionych równań wynika, że dodatek mocnego kwasu (nośnika jonów H⁺) do roztworu soli słabej zasady i mocnego kwasu spowoduje zmniejszenie hydrolizy soli tego typu. Działanie takie spowoduje wzrost stężenia jonów wodorowych i przesunięcie równowagi reakcji w lewo. Zmniejszenie hydrolizy soli słabego kwasu i silnej zasady można osiągnąć poprzez dodanie do roztworu tej soli mocnej zasady. Działanie takie spowoduje wzrost stężenia jonów wodorotlenowych i przesunięcie równowagi reakcji w lewo.

Hydroliza soli słabej zasady i słabego kwasu

Po rozpuszczeniu w wodzie soli słabego kwasu i słabej zasady następuje dysocjacja elektrolityczna soli, przykładowo:

CH₃COONH₄ → CH₃COO^- + NH₄⁺

Następnie zarówno anion słabego kwasu i kation słabej zasady ulegają hydrolizie

CH₃COO^- + H₂O = CH₃COOH + OH^-

NH₄⁺ + H₂O = NH₄OH + H⁺

Odczyn roztworu wodnego soli tego typu będzie zbliżony do obojętnego, jeżeli wartości stałych dysocjacji słabego kwasu (K_a) i słabej zasady (K_b) tworzących sól będą do siebie zbliżone. Jeżeli wartości stałych dysocjacji K_a i K_b różnią się znacznie, to odczyn roztworu wodnego będzie różny od obojętnego. Jeśli K_a > K_b roztwór będzie miał odczyn kwaśny, a gdy K_b > K_a roztwór będzie miał odczyn alkaliczny.

Instytut Dietetyki

2. Część doświadczalna

Doświadczenie 1. Określanie pH wodnych roztworów

Przygotować sześć ponumerowanych probówek oraz sześć papierków wskaźnikowych. Do probówek wprowadzić po 1 cm³ roztworu: 0,1 M HCl; 0,1 M CH₃COOH; 0,1 M NaOH; 0,1 M NH₄OH; 0,1 M NaCl; H₂O (destylowana). Suchą bagietką przenieść kroplę roztworu z probówki na papierek wskaźnikowy. Porównując zabarwienie papierka ze skalą umieszczoną na opakowaniu określić pH każdego roztworu. Wykonać pomiary pH roztworów o zadanych stężeniach przy użyciu pH-metru (roztwory znajdują się w zlewkach 100 cm³). Obliczyć stężenie jonów wodorowych oraz wartość pH dla badanych roztworów. Stała dysocjacji kwasu octowego - 2,82⋅10^-5; stała dysocjacji wodorotlenku amonu - 4,67⋅10^-5. Wyniki przedstawić w formie tabeli:

Roztwór	Zabarwienie papierka wskaźnikowego	Wartość pH odczytana ze skali	Wartość pH zmierzona pH-metrem	Wartość pH obliczona
0,1 M HCl
0,1 M CH3COOH
0,1 M NaOH.
0,1 M NH4OH
0,1 M NaCl
H2O (destylowana)

Doświadczenie 2. Wskaźniki pH stosowane w laboratoriach

Przygotować 4 serie po 3 probówki (razem 12 sztuk). W ramach każdej serii wlać do probówek po 1 cm³ następują­cych roztworów: (1) 0,1 M HCl; (2) H₂O (destylowana); (3) 0,1 M NaOH. Do probówek dodać po 1 kropli roztworu wskaźnika 1 seria - oranż metylowy, 2 seria - czerwień metylowa, 3 seria - błękit bromotymolowy, 4 seria - fenoloftaleina. Wyniki przedstawić w postaci tabeli, w której należy zapisać obserwowane kolory badanych roztworów.

Wskaźnik	Środowisko kwaśne 0,1 M HCl	Środowisko obojętne H2O	Środowisko zasadowe 0,1 M NaOH
Oranż metylowy
Czerwień metylowa
Błękit bromotymolowy
Fenoloftaleina

Doświadczenie 3. Badanie odczynu soli

W czterech ponumerowanych probówkach przygotować roztwory następujących soli: węglan sodu, chlorek amonu, octan amonu, chlorek potasu. Roztwory przygotować wsypując do probówek niewielkie ilości soli (1/2 łyżeczki) a następnie dodać ok. 5 cm³ wody destylowanej. Za pomocą papierków wskaźnikowych określić pH otrzymanych roztworów.

Wyniki przedstawić w postaci tabeli.

Lp.	Roztwór soli	pH	Reakcja(e) hydrolizy
1.
2.
3.
4.

Instytut Dietetyki

Ćwiczenie 6

BADANIE WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH LIPIDÓW:

ZMYDLANIE TŁUSZCZÓW, LICZBA ZMYDLANIA, LICZBA JODOWA,

LICZBA KWASOWA, LICZBA NADTLENKOWA.

1. Wprowadzenie

Tłuszcze pod wpływem przegrzanej pary wodnej ulegają hydrolizie, dając glicerol i wolne kwasy tłuszczowe, natomiast ogrzane z wodorotlenkiem sodowym lub potasowym oprócz glicerolu tworzą mydła (reakcja zmydlania). Mydła są solami sodowymi lub potasowymi wyższych kwasów tłuszczowych.

Tłuszcze należą do produktów nietrwałych i łatwo psujących się. Wszystkie tłuszcze pod wpływem tlenu, powietrza, wody, światła i temperatury oraz enzymów znajdujących się w tkankach roślinnych i zwierzęcych lub enzymów wytwarzanych przez drobnoustroje ulegają różnym zmianom, które objęte są ogólną nazwą „jełczenie”.

Głównymi procesami jełczenia tłuszczów są: hydrolityczny rozpad glicerydów związany z obecnością w tłuszczach swoistych enzymów, zwanych lipazami na glicerynę i kwasy tłuszczowe, następnie procesy utleniania zarówno katalizowane przez specyficzne enzymy, zwane lipooksydazami, jak i tzw. procesy autooksydacji. Szybkość utleniania zależy w dużym stopniu od składu chemicznego tłuszczów.

Autooksydacja (jełkość oksydacyjna) jest to samorzutne przyłączanie tlenu przez nienasycone kwasy tłuszczowe. Najczęściej tłuszcze ulegają jełczeniu w wyniku procesu autooksydacji, który raz zapoczątkowany przebiega dalej samorzutnie. Inicjowanie reakcji może zachodzić pod wpływem promieni świetlnych, podwyższonej temperatury, enzymów oraz obecności jonów metali, takich jak miedź, kobalt, żelazo dwu- i trójwartościowe oraz chrom.

Do oceny jakości tłuszczów stosuje się pewne wyróżniki chemiczne, które określają zmiany zachodzące w czasie przechowywania tłuszczów, a także pozwalają zdefiniować stopień i rodzaj zepsucia badanego produktu spożywczego. W tym celu w analizie produktów tłuszczowych oznacza się liczby tłuszczowe: zmydlania, jodowa, kwasowa, nadtlenkowa.

2. Część doświadczalna

Doświadczenie 1. Zmydlanie tłuszczów.

W parownicy porcelanowej ogrzać ok. 5 g tłuszczu (np. smalcu). Dodać następnie 8 ml 30% roztworu NaOH, potem 5 ml etanolu i mieszać, ogrzewając łagodnie przez kilka minut, aż do utworzenia się jednolitej masy (mydła). Do otrzymanego mydła wprowadzić ok. 150 ml wrzącej wody, roztwór przelać do zlewki i ogrzewać do całkowitego rozpuszczenia się mydła.

a) Otrzymywanie mydła nierozpuszczalnego. Do 2 probówek zawierających po 2 ml roztworu mydła dodać po 0,5 ml 1% roztworów CaCl₂ i BaCl₂. Wytrąca się osad nierozpuszczalnych mydeł wapniowych i barowych.

b) Tworzenie trwałej emulsji tłuszczu w obecności mydła. Do 2 probówek wprowadzić po 4 ml wody lub mydła i 0,5 ml oleju, a do trzeciej probówki zawierającej 4 ml wody dodać 0,5 ml mydła. Zawartość probówek silnie wstrząsnąć. Wyniki zanotować.

Doświadczenie 2. Liczba zmydlania (LZ).

Zasada: LZ jest to liczba miligramów KOH potrzebna do zmydlenia 1 g i zobojętnienia zawartych w nim wolnych kwasów tłuszczowych. Znajomość liczby zmydlania pozwala wyznaczyć średnią masę cząsteczkową kwasów tłuszczowych wchodzących w skład danego tłuszczu.

Tłuszcze zawierające stosunkowo dużą ilość estrów kwasów o mniejszej masie cząsteczkowej, jak: masłowy, kaprylowy (masło, olej kokosowy) mają dużą liczbę zmydlenia. Natomiast tłuszcze o dużym odsetku estrów długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (olej rzepakowy, słonecznikowy), mają małe liczby zmydlania. Obecność substancji nie ulegających zmydleniu, np. olejów mineralnych, zmniejsza liczbę zmydlenia. Domieszka takich substancji w ilości 1% zmniejsza LZ o 1,7-2,5 jednostek.

Materiał: Masło, smalec, olej.

Odczynniki:

1) 0,5 M roztwór KOH.

2) 96% roztwór etanolu.

3) 0,5 M roztwór HCl.

4) 1 % etanolowy roztwór fenoloftaleiny.

Wykonanie: Do kolby stożkowej o pojemności 200-300 ml odważyć ok. 1 g tłuszczu, dodać 10 ml 0,5 M roztworu KOH i 50 ml etanolu. Zawartość kolby ogrzewać pod chłodnicą zwrotną w ciągu 20 min we wrzącej łaźni wodnej (kolbę zamknąć szczelnie korkiem z wąską szklaną rurką długości ok. 1 m i średnicy 3-5 mm). W wyniku hydrolizy tłuszcz zostaje rozłożony do glicerolu i kwasów tłuszczowych, które z wodorotlenkiem potasu dają mydła. Nadmiar KOH odmiareczkować 0,5 M roztworem HCl wobec fenoloftaleiny. Równolegle należy wykonać próbę kontrolną, nie zawierającą tłuszczu.

LZ = 28,055 (a - b)/c,

gdzie: a - liczba ml 0,5 M roztworu HCl potrzebna do zmiareczkowania próby kontrolnej, b - liczba ml 0,5 M roztworu HCl potrzebna do miareczkowania próby badanej, c - ilość gramów tłuszczu.

Doświadczenie 3. Liczba jodowa (LJ).

Zasada: LJ oznaczą tę ilość gramów jodu, która zostaje przyłączona do 100 g tłuszczu. Liczba ta wyraża ilościowo zawartość nienasyconych związków w tłuszczu. Tłuszcze o dużej zawartości estrów nienasyconych kwasów tłuszczowych, np. oleje roślinne charakteryzują się dużą liczbą jodową (olej rzepakowy). Tłuszcze stałe - o małej zawartości nienasyconych wiązań mają natomiast małą liczbę jodową (np. masło, smalec).

Tłuszcz rozpuszczony w obojętnym rozpuszczalniku organicznym traktuje się nadmiarem mianowanego roztworu chlorowca w takich warunkach, aby nastąpiło tylko jego przyłączenie, a nie podstawienie. Następnie dodaje się roztwór jodku potasu. Nadmiar chlorowca ruguje jod, który odmiareczkowuje się roztworem Na₂S₂O₃.

Z różnicy między ilością jodu uwolnionego w próbie kontrolnej i badanej otrzymuje się tę ilość jodu, która została przyłączona przez daną ilość badanego tłuszczu. Do ilościowego przyłączenia chlorowców nadają się ICl i IBr. Chociaż reakcja przyłączania czystego chloru zachodzi najenergiczniej, to jednak chlor podstawia częściowo wodór. Czysty brom i jod reagują natomiast zbyt wolno i dlatego się ich nie stosuje.

Odczynniki:

1). Odczynnik Hanusa: 10 g IBr rozpuścić w 500 ml CH₃COOH lodowatego.

2). 10% roztwór KI.

3). 0,1 M roztwór Na₂S₂O3.

4). 1% roztwór skrobi.

5). Chloroform.

Wykonanie: W naczyńku wagowym odważyć dokładnie 0,2 g oleju lub 0,4 g mas­ła/smalcu. Naczyńko wprowadzić ostrożnie do kolby stożkowej o pojemności 200-300 ml z doszlifowanym korkiem, zwilżonym uprzednio roztworem KI. Następnie dodać 10 ml chloroformu i starannie rozpuścić odważkę tłuszczu. Dodać 15 ml odczynnika Hanusa, kolbę starannie zamknąć korkiem i po wymieszaniu pozostawić w ciemnym miejscu na 30 min. Równolegle wykonać próbę kontrolną nie zawierającą tłuszczu. Po upływie tego czasu wprowadzić 15 ml 10% roztworu KI (zmywając nim szyjkę kolby i korek) oraz ok. 50 ml wody. W wyniku reakcji IBr i KI uwalnia się I₂: IBr + KI → I₂ + KBr

Jod odmiareczkować za pomocą 0,1 M roztworu Na₂S₂O₃ (do słabo różowego zabarwienia), dodać wskaźnika skrobiowego i skończyć miareczkowanie.

LJ = 1,269 (a - b)/c,

gdzie: a - liczba ml 0,1 M roztworu Na₂S₂O₃ potrzebna do zmiareczkowania próby kontrolnej, b - liczba ml 0,1 M roztworu Na₂S₂O₃ potrzebna do miareczkowania próby badanej, c - masa tłuszczu w gramach.

Doświadczenie 4. Liczba kwasowa (LK).

Liczba kwasowa jest to ilość mg KOH potrzebna do zobojętnienia wolnych kwasów tłuszczowych zawartych w 1 g tłuszczu. Liczba ta charakteryzuje stopień hydrolizy badanego tłuszczu. Zasada oznaczenia polega na odmiareczkowaniu wolnych kwasów tłuszczowych mianowanym roztworem zasady.

Do kolby stożkowej o pojemności 250 cm³ odważyć 5 g próbki tłuszczu z dokładnością do 0,01 g. Dodać 30 cm³ mieszaniny rozpuszczalników (alkohol etylowy - toluen), po wymieszaniu dodać 3 krople fenoloftaleiny i miareczkować roztworem KOH o stężeniu 0,1 mola/dm³, do uzyskania jasnoróżowego zabarwienia utrzymującego się przez 1 minutę.

Liczbę kwasową (LK), w mg KOH/g, obliczyć ze wzoru:

LK = (a ⋅ 5,611)/m,

gdzie: a - liczba ml 0,1 M KOH zużytego do miareczkowania, m - naważka w gramach.

5,611 - ilość w mg KOH zawarta w 1 ml 0,1 M roztworu KOH.

Doświadczenie 5. Liczba nadtlenkowa (LOO).

Liczba nadtlenkowa jest to ilość ml 0,002-molowego tiosiarczanu sodu potrzebna do zmiareczkowania jodu wydzielonego z jodku potasowego przez nadtlenki zawarte w 1 g tłuszczu.

Zasada oznaczenia polega na ilościowym oznaczeniu jodu wydzielonego z jodku potasowego w wyniku działania nadtlenków znajdujących się w badanym tłuszczu. Liczba ta jest miarą zawartości nadtlenków i oznacza pierwotny stopień utlenienia tłuszczu.

Odważyć około 1 g tłuszczu z dokładnością do 0,001 g, przenieść do kolby stożkowej o pojemności 250 ml z korkiem na szlif, dodać mieszaninę rozpuszczalników chloroformu i kwasu octowego 2:3 (25 ml) i 1 ml świeżo przygotowanego nasyconego roztworu jodku potasu, zamknąć kolbę korkiem. Mieszać przez minutę i zostawić w ciemności na 5 minut. Potem dodać 75 ml wody destylowanej oraz 5 kropli 2-procentowego roztworu skrobi i po wymieszaniu natychmiast miareczkować 0,002-molowym roztworem tiosiarczanu sodu, aż do całkowitego odbarwienia. Równolegle wykonać próbę ślepą odczynnikową.

Liczbę nadtlenkową (LOO), w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kg tłuszczu, obliczyć ze wzoru:

LOO = [(a - b)/m] ⋅ 2,

gdzie: a - liczba ml 0,002 M roztworu Na₂S₂O₃ potrzebna do zmiareczkowania próby właściwej, b - liczba ml 0,002 M roztworu Na₂S₂O₃ zużytego do miareczkowania próby ślepej, c - masa tłuszczu w gramach.

---