Metoda RT-PCR - stosowana do badań poziomu transkrypcji, a zate i poziomu ekspresji

Genów

Etapy metody:

1.synteza cDNA na matrycy całkowitego RNA przy udziale enzymy odwrotnej

transkyptazy.

2.amplifikacja badanego fragmentu DNA metodą PCR

Synteza cDNA

A)przy użyciu heksamerów - wszystkie rodzaje RNA ulegają przepisaniu na cDNA

(rRNA, t RNA i mRNA) i dopiero PCR zze specyficznymi starterami dla badanego

genu. Dochodzi do wybiórczej syntezy specyficznego produktu

B) przy użyciu oligo (dT)

• bardziej specyficzna systeza z zastosowaniem oligo (dT). Który hybrydyzuje z

• poliadenylowymi końcami 3' mRNA

• ilość cDNA jest mniejsza niż w przypadku syntezy na matrycy całkowitego RNA

• (mRNA to ok. 5% całkowitego RNA)

• C) przy użyciu startera specyficznego do analizowanego genu

• najbardziej specyficzna synteza cDNA

• - czasami pojawiają się problemy z uzyskaniem cDNA

• D)Syteza cDNA z losowymi heksamerami (random hexametric primers)

etapy: 1) przygotować mieszaninę) całkowity RNA 5ၭl. Losowe hesamery 3ၭl,

woda dest. 4ၭl

2)Inkubować 10min 70ႰC

3)dodać 8ၭl mieszaniny buforu, MgCl_2, dNTP, 0,1M MdTT i RT 4)inkubacja

50min w 42ႰC

5) Dodać Rnazy

6) inkubacja 20min w 37ႰC 7) Schłodzić do 4Ⴐ -> PCR lub zamrozić

---