MIF como citocina detonadora en el desarrollo de la diabetes tipo 2

Samara Ariadna Centeno Rivas

Susana Valeria Espejel Lucio

Jesús Gerardo Ponce Cruz

Luis Ángel Olvera Perdomo

Colegio Indoamericano S.C. (6779)

5370-5433

[e-mail]

www.indoamericano.edu

Unidad de Biomedicina, FES Iztacala, UNAM.

5623-1298 ext. 438

Dra. Miriam Rodríguez Sosa

Biol. Ana Lilia Moreno Trejo

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Área: Ciencias básicas o naturales: Biología

Categoría: Externa

Modalidad: Investigación Experimental o de campo.

Comentario y Visto bueno de la Dra. Miriam Rodríguez Sosa.

El trabajo de investigación realizado por los jóvenes Samara Ariadna Centeno Rivas, Susana Valeria Espejel Lucio, Jesús Gerardo Ponce Cruz y Luis Ángel Olvera Perdomo, se realizó siempre con gran sentido de responsabilidad y madurez, factores que resultaron indispensables para que se llevara a buen término el diseño experimental planteado originalmente. Cabe mencionar que el entusiasmo de los participantes nunca decayó y por el contrario despertó su interés por la investigación. Los resultados obtenidos con este experimento serán tomados en cuenta, una vez que sean reproducibles, para incluirlos en una publicación científica. Además servirán para dirigir con mayor acierto futuros diseños experimentales de nuestra línea de investigación.

Por todas las razones anteriores no dudo en decir que los jóvenes mencionados arriba desarrollaron una buena estancia en mi Laboratorio.

Vo.Bo. Dra. Miriam Rodríguez Sosa

Profesor de T. C. UBIMED. FES-Iztacala, UNAM

Comentario y Visto bueno de la Biol. Ana Lilia Moreno Trejo

El trabajo de los alumnos siempre se caracterizo por una actitud positiva y alto sentido de disciplina, los cuales son factores importantes para la realización de este tipo de investigaciones. Cabe mencionar que además presentan un interés sobresaliente por la investigación básica; lo cual es trascendente en su formación académica ya que su interés profesional esta encaminado hacia el área de investigación químico-biológica.

Vo.Bo. Biol. Ana Lilia Moreno Trejo

Profesora de Temas Selectos de Biología, Area II, Colegio Indoamericano.

Resumen

En México la diabetes es la primera causa de muerte, la obesidad, la falta de ejercicio y el sedentarismo son los principales factores que propician el desarrollo de diabetes Mellitus tipo II (DMT-2). Diversas investigaciones han establecido que la obesidad y la resistencia a la insulina están relacionadas con una inflamación de bajo grado en tejido adiposo y células pancreáticas, reacciones que pudieran estar reguladas por citocinas proinflamatorias. El factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) es una citocina pro-inflamatoria la cual participa en diversas enfermedades inmunoinflamatorias y autoinmunes. En este estudio utilizamos ratones deficientes para el gen que codifica para MIF (MIF-/-) y como controles ratones silvestres (MIF+/+), ambos con fondo genético BALB/c, para examinar el papel de MIF en el desarrollo de la diabetes tipo 2 inducida por una única dosis de estreptozotocina (STZ). Encontramos que los ratones MIF+/+ desarrollaron hiperglucemia, y murieron aproximadamente 14 días postinducción de la diabetes, mientras que los ratones MIF-/- desarrollaron niveles inferiores de glucosa en sangre y no mueren. No encontramos diferencias morfológicas en los islotes de las células  del páncreas entre los dos grupos. Sin embargo, los ratones MIF-/- tuvieron niveles disminuidos de TNF-, una citocina implicada en procesos pro-inflamatorios y en la resistencia a la insulina. Con este trabajo establecimos el modelo de diabetes mellitus tipo 2 de progresión lenta y representa la primera evidencia en el laboratorio de un modelo de diabetes mellitus tipo 2 que establece la participación de MIF en la patología de la enfermedad.

MIF como citocina detonadora en el desarrollo de diabetes tipo 2

Introducción.

La base de la nutrición de las células consiste en el aprovechamiento de los nutrientes obtenidos a partir de la ingesta de alimentos que el organismo degrada hasta sus formas más simples conocidas como biomoléculas. Dentro de éstas podemos encontrar a los carbohidratos que a su vez se dividen en triosas, pentosas y hexosas. La hexosa de mayor importancia para la vida es conocida como glucosa la cual aporta la energía que la célula necesita para mantener su homeostasis.(Curtis, 2001)

En el metabolismo una molécula es degradada por una sustancia específica que la hace susceptible de aprovechamiento y en el caso de la glucosa quien la degrada es la insulina, secretada por el páncreas.(Curtis, op.cit)

El páncreas es una glándula grande que se encuentra detrás del estómago constituido por una parte exocrina y un parte endocrina. La parte endocrina se encuentra agrupada en islotes de Langerhans. Dichos islotes son microórganos compuestos por subunidades celulares: células α, β, Δ y PP. Las células α producen y liberan glucagón, una hormona que eleva el nivel de glucosa en la sangre; representan del 10-20% de los islotes de Langerhans y se distribuyen periféricamente. Mientras que, las células β, producen y liberan insulina, hormona que regula los niveles de glucosa en la sangre. Su función es retirar el exceso de glucosa que se almacena en el hígado en forma de glucógeno. Los diabéticos insulino dependientes no son capaces de producir esta hormona. Las células Δ producen somatostatina, hormona que se cree, regula la producción y liberación de la insulina por las células β así como la del glucagón por las células α. Las células PP producen y liberan Polipéptido Pancreático (Campuzano, 1999).

La poca o nula producción de insulina en el páncreas, provoca un desorden del metabolismo conocido como Diabetes que es la alteración de las células β localizadas en los islotes de Langerhans, o cuando la insulina no es aceptada por las células debido a una incompatibilidad en los receptores de la membrana. Dependiendo de cual sea la deficiencia que el organismo sufra, se adquiere un tipo diferente de Diabetes. Éstos pueden ser dos:

• Diabetes Mellitus I también conocida como diabetes insulinodependiente o de comienzo juvenil, es una enfermedad crónica (permanente), que ocurre cuando el páncreas produce muy poca o nada de insulina, la cual se encarga de regular los niveles de azúcar en sangre y permite su ingreso, como fuente de energía a las células. En ausencia o niveles bajos de insulina, las células son incapaces de utilizar la glucosa como energía generando altos niveles de azúcar en el torrente sanguíneo, polifagia, poliuria y polidipsia.

• Diabetes Mellitus II también conocida como diabetes no dependiente de insulina, no presenta una destrucción específica autoinmune y los pacientes no tienen ninguna otra causa aparente de su desarrollo, se caracteriza por una resistencia periférica a la insulina así como por defectos en la secreción de insulina.(Le Roith, et al., 2003)

En México una de las principales causas de muerte es la diabetes. A nivel mundial México ocupa el cuarto lugar en frecuencia de Diabetes Mellitus tipo II, pues se estima que aproximadamente 10 millones de personas la padecen.(INEGI, 2005)

El Factor Inhibidor de Migración de Macrófagos (MIF) es una citocina con acción proinflamatoria producida por células del sistema inmune y no inmune (David, J. R. 1966.). Cabe mencionar que MIF es producido de manera constitutiva por las células β del páncreas (Waeber, G., et al., 1999), y que la expresión y producción de MIF es significativamente sobreexpresada bajo condiciones patológicas como lo son la diabetes tipo 1, tipo 2, pancreatitis y obesidad (Yabunaka, N., et al., 2000), implicando en este caso que MIF podría participar en los procesos de la patología DMT-2(Herder C., et al., 2006).

Paralelamente, en el desarrollo de la DMT-2 existe una relación directa entre resistencia a la insulina y obesidad, pues se ha establecido que entre el índice de masa corporal (BMI en inglés) y el desarrollo de la DMT-2 se da una relación directamente proporcional(Sakaue S., et al., 2006). En la obesidad se presenta la proliferación de células adiposas, almacén de energía en forma de grasas y/o azúcares. Los adipocitos tienen altos niveles de MIF de manera constitutiva (Kershaw, E. E., et al., 2004), estableciéndose así que las concentraciones de MIF están positivamente relacionadas con el BMI.

La observación anterior ha sugerido que MIF podría ser un mediador de la infiltración de los macrófagos en los tejidos adiposos obesos (Ghanim H., et al., 2004) y quizá MIF participe en los eventos de resistencia a la insulina que dan pie a la génesis de la DMT-2, pero hasta ahora es insuficiente la información para establecer una asociación directa entre ésta y MIF.

HIPOTESIS

Dado que MIF posee características que lo califican como un posible mediador de la resistencia a la insulina cómo generador la de diabetes tipo 2, nosotros creemos que posiblemente:

MIF participa en los procesos inflamatorios que generan resistencia a la insulina en la DMT-2

OBETIVO GENERAL

Estudiar si la molécula MIF participa en la génesis y patología de la DMT-2 usando un modelo murino de diabetes mellitus de progreso lento no dependiente de insulina (tipo 2) y con este estudio se intentará probar si existe relación de los procesos inflamatorios con MIF, que faciliten la génesis de la DMT-2.

OBJETIVOS PARTICULARES

1. Desarrollar un modelo de DMT-2 en ratones con fondo genético BALB/c.

2. Desarrollar un modelo de DMT-2 en ratones con fondo genético BALB/c con deleción para el gen que codifica para el factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF).

3. Establecer si existe una asociación a nivel sistémico entre los niveles de MIF con ratones diabéticos inducidos con STZ.

4. Determinar los niveles de glucosa en sangre de ratones diabéticos inducidos con STZ deficientes para el gen MIF y no deficientes.

5. Determinar cambios en la morfología de los islotes de las células pancreáticas en los grupos experimentales.

MATERIAL Y MÉTODOS

El presente trabajo se realizo en laboratorio de Inmunoparasitología de la Unidad de Biomedicina de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, por Centeno Rivas Samara Ariadna, Espejel Lucio Susana Valeria, Ponce Cruz Jesús Gerardo y Olvera Perdomo Luis Ángel, con el asesoramiento de la Dra. Miriam Rodríguez-Sosa y la Biol. Ana Lilia Moreno Trejo.

Animales. Machos entre 8-10 semanas de edad MIF+/+ y MIF-/- con fondo genético BALB/c, criados en sistemas de cajas aislados en un cuarto con aire acondicionado a 23 ±1 °C, en el Bioterio de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala (UNAM).

Prueba de PCR (Polimerase Chain Reaction): Prueba realizada para verificar la presencia y ausencia del genotipo en ratones deficientes del gen que codifica para MIF.

Se obtuvo un trozo e cola (0.5cm) de los animales experimentales, la cual se llevó a digestión en tubos de 1.8 μl (Eppendorf) con buffer de lisis y 20 μl de Proteinasa K (in vitrogen 100μg/ml durante toda la noche a 56°C. Posteriormente se centrifugó a 14000rpm durante 10 minutos, se tomó el sobrenadante y se adicionaron 500μl de isopropanol frío, se homogenizó hasta la precipitación del DNA. Nuevamente, se centrifugó 14000rpm durante un minuto para después lavar el botón de DNA con etanol frío al 75% en el mismo tubo, centrifugándolo a 14000rpm por 5 minutos. Se dejó evaporar el etanol a temperatura ambiente por lo menos 1 hora. El botón de DNA se resuspendió con 200l de agua grado biología molecular (Sigma) toda la noche a 56°. Posteriormente se determinó la cantidad y pureza extraída utilizando una dilución 1:1200 de muestra de DNA en agua y se analizaron las muestras en un espectrofotómetro (Jenwey, Genova) a 260mm. La concentración final se obtuvo con el factor 1 D.O.=40g. Para la PCR se utilizarán tubos nuevos libres de DNAsas-RNA-sas con capacidad de 0.2ml, en los cuales con un volumen final de reacción de 25 μl se colocaron los siguientes reactivos (kit taq Platinum polimerase, invitrogen) en orden: Buffer 10x (2.5l), Mg Cl2 (50mM; 0.75l), DNTPmix (5mM; 0.5l), Primers (50pM), DNA Taq polimerasa (5U/l; 0.25μl), muestras de DNA 1.25μl, agua grado biología molecular (Sigma) suficiente para un volumen de 25ml. La secuencia de los primeros a usar fueron: MIF, (F) AgA CCA CgT gCT TAg CTg Ag; (R) gCA TCgCTA CCg gTg gAT AA (200pb); NEO (F) ATT gAA CAA gAT ggA TTg CAC, (R) CgT CCA gAT CAT CCT gAT (500pb). Una vez con los reactivos respectivos los tubos para la PCR se sometieron 94°C por 30 seg, 58°C por 30 seg y 72°C por 120 seg; con 35 repeticiones en el termociclador (Corbett Research).

Para la electroforesis, se utilizó un gel de azarosa (ICN Biochemicals) 1% en Buffer TBE 1x, bromuro de etidio sobre una cámara molde y un peine de 12 pozos que se mantuvo a 4°C por 30 minutos para que se solidifique.

Una vez hecho el gel, se hizo una dilución 1:4 de DNA y se colocó por pozo 2l de muestra previamente diluida en 8l buffer de carga blue juice (In vitrogen) a partir del segundo pozo ya que en el primero se colocaron 3l del marcador de peso molecular 100pb (In vitrogen). Se corrió el gel a 80 Volts, 45 Ameperes durante 50 minutos. MIF tiene un peso de 200pb y neomicina de 500pb. El resultado se observó en un transiluminador con luz UV y se capturó la imagen utilizando el programa Alphalmaher.

Inducción de diabetes. La diabetes por puede ser inducida por diversos factores entre los cuales se encuentran los externos o ambientales, un claro ejemplo es el empleo de drogas tóxicas y dañinas para los órganos del cuerpo, en este caso para el páncreas (3). La estreptozotocina (STZ; N-nitroso derivado de glucosalina) es un antibiótico de amplio espectro extraído de Streptomyces acromogenes, es un antibiótico antitumoral del grupo de las nitrosoureas. Su indicación principal es el tumor de islotes celulares del páncreas (14). Esta es una toxina pancreática de las células β que induce la necrosis rápida e irreversible de las células β (15). Dosis intraperitoneales repetidas de esta droga (STZ) son utilizadas para generar en ratones modelos experimentales de diabetes mellitus dependiente de insulina (tipo 1) (16). Mientras que una única dosis de STZ (175 a 200 mg/kg) i.p. en ratones BALB/c genera diabetes de progreso lento no dependiente de insulina (DMT-2). En modelo se establece la generación de la DMT-2 debido a una destrucción parcial (menos del 20%) de las células  del páncreas con una única dosis de STZ, lo cual desencadena un proceso inflamatorio con niveles incrementados de TNF-, molécula implicada en los procesos de resistencia a la insulina debido a una interacción directa con los receptores GLU (16). En este trabajo nosotros utilizamos este modelo de DMT-2. Brevemente, se disolvió la STZ en buffer de citratos 0.05M, pH de 4.5. Los ratones MIF-/- y MIF+/+ ambos con fondo genético BALB/c recibieron una inyección i.p. de 200 mg/kg de STZ. Como controles utilizamos ratones de los dos grupos que únicamente recibieron i.p. un volumen equivalente de buffer de citratos.

Determinación de glucosa en suero. Evaluación clínica. El peso de los animales fue medido inmediatamente después del examen sanguíneo, los animales fueron resguardados individualmente en cajas metabólicas por 24 horas, esta prueba se realizo a las 12:00 pm supuesta hora de inactividad de los ratones, por lo que es una hora en la que los animales presentan un ayuno de forma natural.

Obtención de suero. De ambos grupos, MIF+/+ y MIF-/- controles e inducidos con STZ se obtuvo sangre de la vena caudal a las 0, 24 hs y las 1, 2, 4 y 6 semanas post-inducción. Se congeló a -40oC hasta su uso.

Determinación de MIF y citocinas por el método de ELISA. Se obtuvo sangre por goteo con un ligero corte en la vena caudal de cada uno de los ratones experimentales MIF+/+ a las 0 y 24 horas continuando a la semana 1, 2, 3, 4,5 y 6 para analizar la producción de citocinas de la respuesta inmune innata como adquirida. Se determinó la concentración de TNF-α y IL-1β Se utilizaron anticuerpos de marca Pharmingen. Todas estas citocinas fueron evaluadas por medio de la técnica de ELISA-Sandwich. Se diluyó a una concentración de 2l/ml en buffer de fosfatos, pH 9 (0.1M NaH₂PO₄ pH 9.0, J.T. Baker) el anticuerpo primario purificado anti TNF-, IL-1, según sea el caso y se adicionaron 50l /pozo a placas de 96 pozos para ELISA. Se incubó toda la noche a 4°C. Posteriormente las placas fueron lavadas con PBS-tween 20 (0.05% Tween-20 en PBS, Sigma, solución de lavado) y se adiciona 100ml de buffer de bloqueo (10% FCS in PBS) y se incubaron a temperatura ambiente por 2 horas. Posteriormente, las placas fueron lavadas dos veces con la solución de lavado y se ponen 50l/pozo de las muestras a determinar por duplicado. Se utilizó como control una curva de la citocina recombinante correspondiente partiendo con una concentración inicial de 4000 pg/ml y siguiendo diluciones a la mitad en buffer de bloqueo. Las placas fueron incubadas a 4°C durante toda la noche. Posteriormente las placas se lavaron cuatro veces con buffer de lavado y se adicionó el anticuerpo de detección secundario marcado con biotina correspondiente para cada citocina a la concentración de 1g/ml en buffer de bloque/Tween, las lacas fueron incubadas a temperatura ambiente por 1hr para posteriormente ser lavadas 6 veces con solución de lavado. Enseguida se adicionaron 100l/pozo del conjugado de estreptoavidina peroxidasa a una dilución de 1:2000 en buffer de bloqueo/Tween y se incubaron a temperatura ambiente por 30 minutos. Después, fueron lavadas 6 veces con buffer de lavado. Se adicionaron 100l/pozo de sustrato ABTS en 0.M ácido cítrico anhdidro, pH 4.35 con NaOH mas 1% H₂O₂ al 3%, todos los reactivos marca Sigma. La densidad óptica se determinó entre los primeros 30 minutos de iniciada la reacción en un lector de placas de ELISA (SpectraMax 250, M.D) a 450 nm.

Inmunohistoquímica.

En orden de esclarecer las características de la diabetes progresiva en los dos grupos de ratones (MIF-/- y MIF+/+) se siguieron los cambios morfológicos de los islotes después de la administración de la STZ. Los ratones fueron sacrificados con CO2 y su páncreas fue removido a los días 0, 7 y 14 después de la administración de STZ. El páncreas fue puesto en un buffer al 10% de formalina y después se embebió en parafina. Dos secciones consecutivas (1-μm) del bloque de parafina, fueron cortadas. Los cortes fueron teñidos por medio del método de tinción histológica de hematoxilina-eosina (HE), los cuales fueron observados para ver si hubo algún tipo de daño en los islotes de Langerhans de ambos grupos (MIF+/+ vs MIF-/-).

Análisis estadístico:

Los datos se analizaron usando estadísticos no paramétricos (“t” de Studenst) y una p<0.05 se considerará significativa.

RESULTADOS

Genotipo de ratones MIF-/-. La determinación de la electroforesis del gel muestra como resultado el estado positivo de los ratones MIF+/+ y positivos para NEO en los ratones MIF-/-, como se muestra en la figura.

Figura 1.- a) Determinación del genotipo de los ratones experimentales por PCR.

a) Amplificación del gen funcional de (MIF+/+) ♂ y b) determinación del gen de inserción NEO (MIF-/-) ♂.

Peso de los ratones MIF+/+ vs MIF-/- inducidos con DMT-2.

Los ratones sufrieron un aumento considerable en el peso de la semana cero a la primera semana después de la inducción con STZ, de un promedio de 17.5g a los 23g de peso.

Al cabo de la segunda semana se observa una disminución en el peso en ambos grupos experimentales. Después de la segunda semana, los ratones MIF+/+ quedando solo los ratones del grupo MIF-/-, que al cabo de la tercera semana vuelven a tener un aumento considerable en su peso para después mantenerse estable.

Figura 2. Gráfica de pesos de los grupos experimentales MIF+/+ y MIF-/-

Los monocitos de sangre periférica se ven disminuidos en los ratones deficientes para MIF. Cuando analizamos las células de sangre periférica al microscopio en frotis sanguíneos de ambos grupos inducidos con STZ observamos una reducción en los monocitos de los ratones MIF-/- comparados con los ratones MIF+/+ (Figura 3). No encontramos diferencias en los porcentajes de otras células MIF+/+ linfocitos (77.92%), eosinófilos (0.5%), basófilos (2.5%) y neutrófilos (3.5%); MIF-/- linfocitos (79.28%), eosinófilos (1%), basófilos (3.2%) y neutrófilos (4.2%).

Figura 3. Porcentajes de células monocitos en sangre periférica de ratones MIF+/+. T de students * p<0.05.

La ausencia de MIF evita parcialmente el incremento de glucosa en sangre.

Los niveles de glucosa en sangre de los ratones MIF+/+ fueron altos desde la primera semana post-inducción (475 mg/dl) incrementándose paulatinamente hasta (550 mg/dl) hasta alcanzar niveles de glucosa por arriba de los 600mg/, en algunos ejemplares el glucómetro indicaba una leyenda “HI” por sus siglas en inglés “alto” (Tabla1, MIF+/+).

Por otro lado los ratones MIF-/- inducidos por DMT-2, aún cuando desarrollaron hiperglucemia, nunca alcanzaron niveles de glucosa tan altos como los detectados en los ratones MIF+/+ (Tabla1, MIF-/-). Los datos mostrados en la tabla se muestran en la gráfica 4.

Semanas	MIF-/-				MIF+/+
0	90	100	110	109	75	88	90
1	340	437	180	155	500	450	425
2	139	414	188	143	600
3	228	408	601	194
4	206	146	167	600
5	206	578	152
6	208	600	198

Tabla 1. Medición de los niveles de glucosa en el modelo experimental en diferentes tiempos (mediciones semanales, niveles de glucosa en sangre mg/dl). Resultado promedio de dos experimentos.

Figura 4. Niveles de glucosa en el modelo experimental de DMT-2. Los ratones MIF-/- aún cuando presentan hiperglucemia esta no es tan alta como en los ratones MIF+/+. t de students *p<0.05.

Los ratones con ausencia de MIF no sucumben a la DMT-2.

En la figura 5 podemos observar que los ratones MIF+/+ mueren cuando alcanzan niveles de glucosa por arriba de 600 mg/dl. Notablemente, los ratones MIF-/- aún cuando desarrollaron hiperglucemia (Grafica 4) no murieron (Gráfica 5).

Figura 5. Porcentaje de sobrevivencia en ratones MIF -/- y MIF +/+. Los ratones MIF-/- aún con hiperglucemia no mueren como los MIF+/+.

No hay diferencias morfológicas en el páncreas entre los ratones MIF+/+ vs MIF

Con el fin de establecer si las diferencias en los niveles de glucosa incrementados y mayor mortalidad observados en los ratones MIF+/+ comparados con los MIF-/- se pudiera deber a que hubiera mayor daño en los islotes de las células  de páncreas de los ratones MIF+/+ que de los MIF-/-, se procedió a hacer inmunohistología del páncreas de ambos grupos. En la figura 6 podemos observar un islote amplificado (40X) de las células  del páncreas de ratones MIF+/+ (a) y MIF-/- (b) a los 14 días post-inducción con STZ. No observamos diferencias entre los dos grupos; no hubo daño ni infiltración en los ratones MIF+/+ que pudiera explicar los mayores niveles de glucosa y mortalidad observados en este grupo.

a) MIF+/+ b) MIF-/-

Figuras 5, 6. Muestra histológica de los islotes de Langerhans teñidos con eosina hematoxilina de un ratón MIF +/+ y otro MIF -/- respectivamente 14 días después de ser inducidos con STZ.

Los niveles de TNF- están incrementados en los ratones MIF+/+ y dramáticamente disminuidos en los ratones MIF-/-. Esto es debido a que MIF es una citocina que induce a la producción de TNFα, por lo que los ratones MIF-/- al no poseerla, no producen cantidades normales de TNFα.

Figura 7. Niveles de TNFα en los modelos experimentales MIF+/+ y MIF-/-medidos a los 14 días después de haber sido inducidos.

DISCUSIÓN

El establecimiento del modelo de DMT-2 fue exitoso, pues el aumento en los niveles de glucosa en sangre fue constante en los ratones (hubo reproducibilidad con el articulo científico en el cual nos basamos).

Cómo se muestra en los resultados con este modelo de diabetes, los ratones ganaron peso relativamente rápido, aún cuando no hubo diferencia entre los ratones MIF+/+ y MIF-/-. Sin embargo, la patología de la DMT-2 fue más severa en los ratones silvestres (MIF+/+) que en los ratones deficientes para el gen que codifica para MIF (MIF-/-). Los ratones MIF+/+ presentaron hiperglucemia severa en un lapso de tiempo relativamente corto, lo cual los llevó a la muerte.

En las muestras histológicas de páncreas observamos poca a nada de infiltración de macrófagos y linfocitos, esto puede explicarse como el daño relativo en las células β del páncreas (<del 20%), generado por la única dosis de STZ. Este daño relativo podría desencadenar procesos inflamatorios que implican la producción elevada de citocinas proinflamatorias como MIF, IL-1 (procesando su determinación) y TNF- Diversos artículos sugieren que la DMT-2 puede ser inducida por la producción de citocinas proinflamatorias como TNF-α, ya que dichas citocinas están presentes en la obesidad con actividad proinflamatoria entre las células adiposas (11). La presencia de estas citocinas, sobre todo TNF- ha sido implicado en el bloqueo del receptor de la insulina en las células (11). Nosotros observamos que los ratones MIF+/+ tuvieron niveles altos de TNF- mientras que los ratones MIF-/- tuvieron niveles de TNF- francamente disminuidos esto implicaría que no esta presente la citocina (TNF-) que impide el reconocimiento del receptor a la insulina, esta hipótesis explicaría porque los ratones MIF-/- sobreviven y desarrollan niveles de glucosa menores a los MIF+/+.

CONCLUSIONES

-La inducción con STZ afectó de diferente manera a los grupos experimentales, pues el grupo MIF+/+ se vio severamente afectado desarrollando patología severa.

-El grupo experimental de MIF-/-, se vio menos afectado, la patología fue menor.

-TNF-α, está asociado con MIF, pues esta también es una citocina proinflamatoria, además de producirse en grandes cantidades por los tejidos corporales, sobre todo células β pancreáticas y adipocitos, esta bloquea los receptores de insulina en el cuerpo.

-Los ratones MIF-/- sobrevivieron al estudio debido a que no poseen MIF y por lo tanto no hay producción de TNFα, haciendo que cierta cantidad de insulina entre a las células depositando ciertas cantidades de glucosa, evitando así, la muerte de los ratones.

• MIF puede favorecer la respuesta inflamatoria (TNF-, IL-1) y facilitar la génesis de DMT-2.

• La ausencia del gen que codifica para MIF atenuará la patología en la DMT-2 cuando sea inducida en el modelo murino propuesto en este protocolo.

Referencias

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http://www.uv.es/histomed/practicas/02-epglan/02-epglan.htm

18

NEO

500pb

MIF -200pb

100 pb

PM

b)

a)

MIF +/+ ♂

MIF -/- ♂

MIF +/+♂

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