BIOTECHNOLOGIA 7 WYKŁAD
Połączono geny hemolizyny z antygenem.
Produkty genów hlyB i h lyD tworzą system sekrecyjny dla fuzji. Antygen hlyAs.
Antygen jest więc połączony z toksyną. Po co to połączenie?
Antygen uaktywnia makrofagi do prezentacji antygenów na powierzchni - dla systemu immunologicznego. Cząstka hemolizyny potrzebna jest do tego, by rozbić błonę wodniczki swoją aktywnością hemolityczną i wydostać na zewnątrz cząsteczkę antygen-hemolizyna.
Wadą tego systemu była niska wydajność - cząsteczki, które się wydostawały nie były w aż tak dużym stężeniu, aby powstała mocna odpowiedź immunologiczna przeciwko antygenowi, który niosła.
Mechanizm działania hemolizyn:
Jest to toksyna zwyczajowo... nie możemy jej jednak tak nazwać, bo ma ona jedną działalność - polega na swojej inkorporacji do błony białkowo-lipidowej. Najlepiej poznane są hemolizyny A - dla E. coli. Komórki, które rosną na krwawych płytkach agarowych, wytwarzają wokół hodowli strefy przejaśnień, które wynikają z lizy krwinek znajdujących się w tym podłożu. Myślano początkowo, że hemolizyna lizuje w sposób enzymatyczny.
Natomiast przyłącza się ona do błony białkowo-lipidowej w miejscu bogatym w cholesterol.
Hemolizyny mają powinowactwo do błon białkowo-lipidowych w miejscach bogatych w cholesterol.
Ta cecha jest wykorzystywana do tego, by zneutralizować "toksyny" typu hemolizyna.
Dodatek cholesterolu do hemolizyny powoduje, że traci ona swoją reaktywność.
Drugą cechą hemolizyn, szczególnie tych, które dały najwięcej biotechnologii szczepionek najnowszej generacji, to hemolizyny aktywowane przez związki redukujące. Możemy do nich zaliczyć niektóre aminokwasy - np. cysteina. A także ditiotrynitol i cały szereg prostych związków nieorganicznych.
Hemolizynę posiadają liczne bakterie. Z bardziej znanych to Streptococcus. Gdy posiada taką hemolizynę, nazywamy ją streptolizyną.
Taką hemolizynę posiada też Listeria monocytogenes.
O takiej hemolizynie mówimy wówczas Listeriolizyna (LLO).
Taką też hemolizynę posiada Clostridium perfringens - bakteria gram+, laseczka.
PFO - perfringolizyna.
Każda z tych „toksyn” tiozależnych (bo w swojej strukturze posiadają charakterystyczną grupę tiolową, którą stanowi cysteina i ta cysteina ma resztę SH, (musi być zredukowane, żeby hemolizyna była aktywna). Cała grupa hemolizyn jest zależna od grup redukujących.
Te toksyny również przyłączają się do miejsc bogatych w cholesterol, mają strukturę beta-baryłki, ale ich akcja zawsze musi być podjęta wtedy, gdy warunki środowiska są redukujące, a optimum pH będzie między 5,6, czyli lekko kwaśnym.
Kiedy stworzymy warunki dla takiej toksyny i pH będzie około 5,6, 37*C, wtedy ta toksyna działa. Działa tak, że te cząsteczki, które przyłączyły się do miejsc bogatych w cholesterol, inkorporują do błony białkowo-lipidowej.
W związku z tym część błony wypada i powstają pory w błonie cytoplazmatycznej i cała zawartość erytrocytu wylewa się na zewnątrz. Przy dużym stężeniu cząsteczek hemolizyny, erytrocyt może ulec zniszczeniu.
Struktura listeriolizyny: składa się z 4 domen. Jest to białko typu undekapeptydu. Domena 1 odpowiada za stabilność cząsteczki. Domena trzecia jest odpowiedzialna za insercję (za inkorporację w błonę), domena czwarta odpowiedzialna za wycinanie cząsteczek i rozpieranie w błonie białkowo-lipidowej - a więc za inicjację i kontrolę cytolizy komórkowej.
Domena 2 - undekapeptyd, który musi być stymulowany przez odpowiednie pH i warunki redukcyjne, aby w całości zaszła akcja hemolizyny.
Gdy komórki bakteryjne znajdą się w pobliżu makrofagów albo komórek makrofagopodobnych, następuje natychmiastowa ich fagocytoza.
Jak udowodnić, że komórki weszły do środka makrofaga?
Podstawą hodowli tkankowych w celu wykazania infekcji wewnątrzkomórkowych jest pewien eksperyment: zakażaliśmy hodowle makrofagów w płytkach petriego, gdzie były szkiełka podstawowe obrośnięte przez makrofagi jednowarstwowo, a komórki bakteryjne wnikają do środka. Dodawaliśmy tam gentamycyny - zabija komórki bakteryjne siedzące w płynie hodowlanym, ale nie potrafi zabić tego, co weszło do środka.
Bardzo często komórki uszkodzone, mutanty skupiają się wokół jądra komórkowego (gdy ma uszkodzone czynniki patogenezy).
Gdy zwykła komórka znajdzie się w pobliżu makrofaga, istnieje możliwość strawienia, ale gdy jest rozpoznana przez organizm, to przeciwciała odnajdują tę komórkę infekującą i ulega ona degradacji, natomiast w przypadku, kiedy spotkamy się z patogenami wytwarzającymi hemolizyny i gdy te bakterie dostaną się z pożywieniem do przewodu pokarmowego, to możliwości bakterii są ciekawe.
Pierwsze stadium zakażenia listeriami - kosmki jelitowe. Ale nie one są podatne na infekcje, a kępki Peyera!
Są to komórki nabłonkowe z kosmkami jelitowymi... różnicę stanowi to, że w kępkach Peyera pod komórkami nabłonkowymi znajduje się cały system obronny organizmu.
Kępki Peyera służą temu, aby tam gromadzić komórki do walki z bakteriami. Okazuje się, że właśnie te kępki Peyera są pokonywane przez bakterie. Jest to fenomen biologiczny - to, co broni, stało się wrotami zakażenia.
Hemolizyny powodują zniszczenie kosmków jelitowych i na tym się kończy - bakteria nie wchodzi do komórek i nie niszczy ich. Stąd krwawa biegunka charakterystyczna dla enteropatogenów.
W przypadku, gdy zakażeniem okazuje się być Yersinia - np. Yersinia enterocolitica, jest to też enteropatogen, okazuje się, że mimo iż nie wytwarza hemolizyn, a cały szereg białek zastępczych, potrafi wniknąć przez kępki Peyera do wnętrza organizmu, wykorzystując infekcję makrofagów, chroniących Kępki Peyera przed infekcją.
Z makrofagami może być rozniesiona po całym organizmie.
Salmonella - również infekuje komórki nabłonkowe, czasami potrafi dostać się do makrofagów, ale to jest rzadkie. Swój cykl życiowy ma w nabłonku, w jelitach. Robi spore spustoszenie, bo namnażające się bakterie powoduje rozpad komórek nabłonkowych. Komórki Salmonella dzielą się bardzo szybko i w kilka godzin po zjedzeniu czegoś człowiek jest w szpitalu.
Shigella - patogen wewnątrzkomórkowy, ale podobnie jak Yersinia, zakaża po to, by przedostać się dalej. Shiigella i Listeria - pokonanie kępek Peyera i wejście do makrofagów. Infekcja ta jest bardzo intensywna, mnóstwo makrofagów jest zakażonych.
W pewnym etapie infekcji następuje liza fagolizosomu. Gdyby nie to, bakteria uległaby kasacji przez komórki. Zanim zostaną strawione, opuszczają komórkę, bo rozbijają ją (dzielą się tak szybko). W przypadku patogenów typu Shigella, czy Listeria następuje produkcja co najmniej dwóch czynników patogenezy, do których należy nasza hemolizyna i fosfolipaza. Te dwa białka powodują, że hemolizyna inkorporuje w miejsca bogate w cholesterol, a fosfolipaza rozkłada fosfolipidy - a więc te elementy, które budują błonę. Proces ten jest bardzo sprawny.
Błona wodniczki odżywczej zostaje szybko zdegradowana i wolne komórki wchodzą do cytoplazmy. W tym momencie komórka nie ma żadnej możliwości akcji. Komórka bakteryjna jest wolna, ma mnóstwo substancji pokarmowych, w związku z tym zaczyna się dzielić. Wokół komórki bakteryjnej zaczynają zbierać się kolejne białka, które syntetyzuje bakteria. Głównym białkiem, które jest istotnym czynnikiem patogenezy jest białko Acta. Opłaszcza ono komórkę bakteryjną i stanowi element ściągający włókienka aktynowe komórki makrofaga. Wykazano, ze mutanty pozbawione białka Acta nie mają zdolności przyłączania włókienek aktynowych.
W pierwszym etapie powstaje otoczka włókienek aktynowych wokół komórki bakteryjnej.
W kolejnym etapie włókienka aktynowe zsuwają się z komórki bakteryjnej - następuje stop syntezy Acta. A więc zsuwają się one do któregoś z biegunów komórki.
Dzieje się tak, że następuje cały czas intensywna polimeryzacja: prowadzi do tego, że cały czas przyrasta ogon aktynowy za bakterią (nazywamy go kometą). Jak się to wybarwi, to widać komórkę bakteryjną z "kometą".
Podstawą napędzania bakterii jest proces polimeryzacji włókienek aktynowych. Komórka wypychana jest przez kometę listeryjną na zewnątrz.
Wypustka, która powstaje posiada dwie błony - błonę własną komórkową i wnikając do sąsiedniego makrofaga zaczyna posiadać błonę komórki sąsiedniej. Gdy wniknie do środka, będzie otoczona podwójną błoną białkowo-lipidową.
Tym się różni początek od końca cyklu.
Komórka wytwarza kolejne czynniki patogenezy - z grupy fosfolipazy B, metaloproteazy i cały system innych białek. Wszystkie geny odpowiedzialne za czynniki patogenezy znajdują się w jednej wyspie patogenności u Listeria. Jest to wyspa patogenności, gdzie znajdują się geny za produkcję listeriolizyny, fosfolipaz, metalloproteaz, a tak ogólnie mówiąc - system jest pozytywnie kontrolowany przez produkt genu PLFA. Jest to pozytywny regulator transkrypcji dla wysp patogenności Listeria. Znajomość tego jest nam potrzebna, aby rozumieć, w jaki sposób konstruuje się wektory do walki z nowotworami.
Stosowane patogenu jako takiego często jest hamulcem w rozwoju szczepionek nowej generacji. Pojawia się mnóstwo przeciwników takich rozwiązania, którzy twierdzą, że bakterie patogenne, to bakterie patogenne. Nawet uszkodzenie delecyjne może przywrócić patogenność. Jeżeli taki wektor będzie szczepionką, może być powrót do aktywności chorobotwórczej. Praca na patogenach samych w sobie jest utrudniona.
Dlatego też równolegle do stosowania faktycznych patogenów mutantów, prowadzi się badania, które mają wykorzystać bakterie niepatogenne, które przyjmują funkcje patogenów, dlatego w szeregu laboratoriów cechy patogenów przekłada się na cechy bakterii niepatogennych.
Spróbowano przeklonować czynniki patogenezy z bakterii patogennej do niepatogennej.
Dawcą musiała być prosta bakteria - gdzie znany jest cykl życiowy itd. Spróbowano przeklonować pierwszy lepszy czynnik - listeriolizynę z L.Monocytogenes do B.subtilis.
B.subtilis żyje w glebie, jest saprofitem, nigdy nie miał nic wspólnego z patogenezą i w zasadzie stąd mogła być dobrana, jako mikrob, w którym zachodzi prawdopodobieństwo, że przeklonowane elementy będą sekrecjonowane.
Bardzo ważne w tych projektach na temat szczepionek najnowszej generacji są te grupy, które chcą zastosować bakterie niepatogenne.
Są one minitransporterami dowolnej cząsteczki. Dlaczego B.subtilis?
Rośnie w temperaturze 37oC, w podłożach odżywczych, minimalnych. Jest to saprofit. Jest bardzo popularna i nigdy nie miała kontaktu z patogenami. Stała się więc ona docelowym obiektem, do którego próbowano sklonować czynniki patogenezy.
Jest jeden problem - B.subtilis jest bakterią sporującą. Przetrwalniki Bacillusa są wytwarzane w dużych ilościach i podczas kryzysu głodowego wytwarza dużo przetrwalników, co nie jest korzystne.. gdyby okazało się że czynniki patogenności powodują u tej bakterii patogenność, to stałaby się bardzo silną bronią biologiczną.
Do pracy wybiera się mutanty pozbawione możliwości sporulacji. Wystarczą tu mutanty delecyjne. Są one wystarczające pod względem bezpieczeństwa. Warto pomyśleć o innym systemie bezpieczeństwa. Można sklonować je na plazmidy, którego replikację można uruchomić przy pomocy induktora.
Listeria monocytogenes - wybieramy szczep, który jest najlepiej szczepem dzikim. Izolujemy jego chromosomalne DNA. Izolacja jest stosunkowo łatwa. Następnie PCR-em wybieramy JFG - gen, który chcemy sklonować. Gen ten ulega wstawieniu do plazmidowego DNA. Plazmid pAG58. Doskonale się kopiuje w B.subtlisie. Ma układ operonu laktozowego, dzięki któremu może być indukowany przez IPTG. IPTG uwalnia wszystkie geny schowane za genem LacO. Po takiej ligacji produktu PCR-a z plazmidem powstaje plazmid, który zawiera w sobie ten wybrany gen. Następnie musi być transformacja. Transformujemy E.coli, aby mieć DNA do dalszych działań. Uzyskana jest konstrukcja. DNA to pakujemy do B.subtilis.
Jeśli nie znamy sekwencji genów bakterii, to trzeba poznać albo mapę sewkencyjną, albo shotgunowo klonować (przypadkowo) DNA chromosomalnowe do plazmidów i poszukiwanie odpowiednich genów. W tym przypadku naszym faworytem jest gen LLO - odpowiedzialny za produkcję białek strukturalnych hemolizyny.
Najważniejszym elementem plazmidu pAG58 jest system nadający plazmidowi oporność na antybiotyki.
Plazmid ten nie ma polilinkera (nie jest to plazmid do klonowania, a do ekspresji).
Ma miejsca SaI i XbaI - miejsca klonowania hemolizyny.
Dodatek IPTG powoduje uwolnienie represora od tego promotora i następuje synteza zarówno genów hemolizyny, które są ustawione zaraz za promotorem.
Konstrukcja plazmidu pAG58 hly-iap.
Po wprowadzeniu szczepu Bacillusa, który uzyskał bakeriolizynę, okazuje się, ze wewnątrz komórek nabłonkowych (do tych celów stosuje się najczęściej linie komórkowe int407 - linia do testowania patogenów nabłonkowych) już po pół godziny znajdują się komórki Bacillus, a więc szczep ten potrafi je pokonać.
Potrafi w związku z tym pokonać komórki makrofagów. Indukuje więc fagocytozę i jest pobierany przez komórki makrofaga. Etap przejścia przez kępki Peyera i infekcja makrofagów - ten szczep to spełnia.
Zwykle po czasie Bacillus dąży do środka, otacza jądro i lokuje się wokół jądra... zachowuje się jak uszkodzona komórka patogenu.
Znacznie lepsza immunizacja byłaby, gdyby ta bakteria mogła się rozprzestrzeniać do kolejnych makrofagów, ale ona się nie rozprzestrzenia i stopień infekcji uzależnia zdolność immunizacji - nie jest ona tak duża, jakby to był patogen w pełni pracujący.
Z drugiej strony zwiększa to bezpieczeństwo.
Bakterie gram dodatnie nie są w stanie przyjmować za dużych plazmidów... nie ulegają one rekombinacji.
Plazmid ten musi zawierać sekwencję, które pozwolą mu się wbudować do DNA chromosomalnego
takimi sekwencjami są sekwencje SP beta, które to sekwencje są sekwencjami naturalnych bakteriofagów, które siedzą w chromosomie B.subtilis. Sekwencje Sp beta zawsze wbudowują plazmid w to samo miejsce w chromosomie z tą samą skutecznością.
Cząsteczki te za pomocą fagów SP beta pozwalają uzyskać szczepy potomne, którymi są transformanty posiadające kasety wbudowane - eksprymują swoje geny po indukcji IPTG.
A jak to będzie działać w organizmie, skoro trzeba to indukować?
Ten system kontrolny jest potrzebny tylko i wyłącznie dla konstrukcyjnych momentów - gdy nie wiemy, jaki będą skutki. Gdy stwierdzimy w labie, że po indukcji system pracuje bez szwanku dla zdrowa, z całą pewnością, możemy wówczas wyłączyć promotor i następuje konstytutywna synteza genów. Można usunąć gen LacI.
Jak ten system będzie pracować?
Mamy Bacillusa z kasetą SP. Bacillus ulega inkorporacji. Po uzyskaniu jednego genu strukturalnego hly, prosta bakteria glebowa staje się bakterią patogenną - bo wnika do makrofagów na drodze fagocytozy, lizuje białkowo-lipidową błonę wodniczki odżywczej przy udziale hemolizyny - listeriolizyny, która w tym momencie jest uwalniana z komórki. Komórka opuszcza w ten sam sposób swoją wodniczkę i staje się wolna komórkom w cytoplazmie, ulega podziałom komórkowym, produkuje liczne białka, które wydostają się na zewnątrz. Następuje prezentacja antygenów... system jest o tyle korzystny, że o ile stosowane wcześniej systemy były takie, że zadaniem hemolizyny była liza, gdy była trawiona komórka. A więc E.coli była wzorcowym nośnikiem hemolizyny w szczepionkach nowej generacji. E.coli miała hemolizynę związaną wewnątrz ścian komórkowych. Dopiero po strawieniu w wodniczce, gdy działały enzymy trawiące bakterie przy udziale aparatu Golgiego ,następowało strawienie bakterii wewnątrz wodniczki. W ten sposób osłony zewnętrzne były zlikwidowane, enzymy doszły do wnętrza komórki i uwalniała się hemolizyna, która rozbijała wodniczkę odżywczą.
Z tych komórek uwalniały się miliony białek...
Pożądane białko, które miało być aktywatorem powstawało w tak małych ilościach, że nawet nie można było znaleźć od niego sygnału... a co dopiero, żeby wzbudzić układ immunologiczny z wystarczającą siłą.
W przypadku, gdy komórka nie ulega strawieniu i żyje w cytoplazmie wydziela dowolne białko, jest to system sprawniejszy - bo wydziela tylko to, czym chcemy zaindukować przeciwciała.
Nie ma tutaj genu Acta, który opłaszczałby komórkę bakteryjną.
Przy dużym stopniu infekcji, gdy sprawnie jest dobrany system infekowania i wiele komórek ma być indukowanych, to gdy walczymy z nowotworami, niekonieczna jest proliferacja do sąsiednich. Dobrze, jest gdy to działa miejscowo i specyficznie do guza.
Z tym systemem są wiązane duże nadzieje - stworzenie wektorów pracujących sprawniej, niż do tej pory.
Biotechnologia, wykład VII, strona 5