BIOTECHNOLOGIA 9
Mechanizmy negatywnej kontroli metabolicznej
O przydatności organizmów do nadprodukcji danego związku, np. aminokwasu decyduje poziom komplikacji regulacji metabolizmu. U eukariota mechanizmy te, obok charakterystycznego dla bakterii poziomu lokalnego związanego z określonym szlakiem metabolicznym, mają często charakter kontroli ogólnometabolicznej. Ponadto dodatkowo w tych organizmach np. aminokwasy są gromadzone w dużych stężeniach w komórce, co hamuje ich biosyntezę.
Mechanizmy występujące w negatywnej kontroli metabolizmu związków (aminokwasów).
hamowanie syntezy enzymów zaangażowanych w biosyntezę określonego związku (aminokwasów) przez jego obecność w podłożu w stężeniu wystarczającym do normalnego wzrostu.
Hamowanie w warunkach przejściowego nadmiaru danego związku (aminokwasy) aktywności wszystkich kluczowych enzymów szlaku lub tylko pierwszego enzymu odgałęzienia prowadzącego do syntezy tego związku (aminokwasu).
Dostępność prekursorów (np. szkieletów węglowych) pochodzących z innych szlaków metabolizmu pierwotnego.
W przypadku jednokomórkowców regulacja metabolizmu jest tożsama z regulacją metabolizmu dla całego organizmu.
W przypadku tkankowców albo w komórce mamy specjalne wydzielone przestrzenie, wakuole, lub ściana komórkowa.
U zwierząt też nie ma bezpośredniej komunikacji ze środowiskiem, a z przestrzeniami wewnętrznymi organizmu, np. gdzie znajduje się krew.
Metabolizm pierwotny - powszechnie występuje w całym świecie ożywionym. Glikoliza występuje powszechnie, a asymilacja u roślin.
Metabolizm wtórny - jest ich dużo więcej, niż pierwotnych. Samych terpenoidów roślinnych jest wiele tysięcy. Związki takie znajdują spore zastosowanie.
Metabolity wtórne prokariontów są lepiej poznane... W przypadku roślin metabolitów jest znacznie więcej i nie zawsze wiemy, który ze związków ma to działanie.
Glikozydy i alkaloidy - niektóre wykorzystywane jako związki antynowotworowe. Są trujące, nie możemy ich wprowadzać do wewnątrz. Stosujemy je zewnętrznie.
Nadprodukcja związków: trzeba pokonać negatywne mechanizmy kontrolne - a więc, gdy poziom metabolitów osiąga poziom fizjologiczny. Produkcja większej ilości jest niekorzystna dla organizmu, dlatego trzeba ją przełamać.
Gdy chcemy otrzymać kultury zawiesinowe tkankowców, okazuje się, że nie chcą one produkować związków, które produkują, gdy mamy do czynienia z całą rośliną.
Metody wpływania na kontrolę metabolizmu związków
A. Zmiana preferencji metabolicznych. Zmiana preferowanego kierunku syntezy w punkcie rozgałęzienia szlaków przez hamowanie jednego z nich fizjologicznym nadmiarem produktu tego rozgałęzienia
B. Dodatek prekursorów
Nadprodukcja określonych związków (aminokwasów) uzyskuje się przez dodanie do podłoża prekursora poza miejscem regulacji (przeciwciała to h hamowaniu syntezy przez hamowanie zwrotne)
C. zmiana aktywności enzymów
Zwiększenie aktywności enzymów limitujących proces biosyntezy w obrębie szlaku lub na etapie biosyntezy prekursorów
D. Mutanty auksotroficzne
tj mutanty z zablokowaną syntezą, np. pierwszego enzymu danego szlaku (rozgałęzienia). Mutanty tego typu wymagają wzbogacenia podłoża w końcowe produkty szlaku. Ograniczenie poziomu metabolitu w pożywce sprzyja nadprodukcji metabolitów pośrednich szlaku czy produktów poprzedzających rozgałęzienie
E. Mutanty regulatorowe
- mutanty, w których została wyeliminowana kontrola na poziomie syntezy enzymu - mutanty konstytutywne - bez względu na to, czy jest fizjologiczna ilość związku, która kasowałaby enzym, czy nie, zawsze jakiś poziom enzymu jest.
- mutanty niewrażliwe na hamowanie przez produkt końcowy (mutacja w miejscu allosterycznym), niewrażliwe ana inhibicję zwrotną. Końcowy związek może jednocześnie wyłączać syntezę, być inhibitorem allosterycznym, a może być tak, że działa tylko na jeden z procesów.
F. Zmiana przepuszczalności przez błonę cytoplazmatyczną - w przypadku mikrobów nie ma wydzielonych stref wewnątrzkomórkowych, jedyne, co jest wydzielone to wnętrze i błona + to, co do niej przyczepione.
Ważne jest ,czy związki zostają w środku, czy wychodzą. Jeżeli błona będzie przepuszczać związek na zewnątrz, a nie będzie go wpuszczała z powrotem, to automatycznie nadprodukcja może iść dalej.... do momentu ustalenia się równowagi między tym, co jest na zewnątrz, a co jest wewnątrz. Czasami związki poprzez przejściu przez błonę zmieniają swoją jonizację, co uniemożliwia im powrót.
Jeżeli związek usuwany jest z wnętrza na zewnątrz, nie ustala się równowaga i zachodzi biosynteza.
Nadprodukcja warunkowana usuwaniem produktu ze środowiska reakcji tj. wzmożonym transportem produktu końcowego szlaku (odgałęzienia) na zewnątrz komórki w wyniku modyfikacji właściwości błony komórkowej
G. Otrzymywanie wysokowydajnych szczepów metodami inżynierii genetycznej.
Zmiana preferencji metabolicznych: zmiana preferowanego kierunku syntezy w punkcie rozgałęzienia szlaków przez hamowanie jednego z nich fizjologicznym nadmiarem produktu tego rozgałęzienia. Preferencje metaboliczne u Brevibacterium flavum
RYSUNEK W ZESZYCIE [???]
W warunkach kontrolnych jak wykazują stosunku poziomu enzymów związanych z rozgałęzieniem szlaków z największą wydajnością są syntetyzowane treonina i izoleucyna
Wprowadzenie do podłoża nadmiaru endogennej metioniny powoduje represje dehydrogenazy homoserynowej (3-krotne obniżenie poziomu) oraz transacylazy homoserynowej i dehydratazy homoserynowej, a w konsekwencji nadprodukcji lizyny.
L-asparaginian
|
|
|
semialdechyd asparaginowy
| |
| |
pirogronian =======| |
| |
dihydroksypikolinian |
| |
| |
L-lizyna |
|
L-homoseryna
- metionina / \ -metionina
/ \
/ \
metionina Ltreonina- L-zoleucina
Różnego rodzaju prekursory mogą wpływać na biosyntezę związków. Często związki końcowe odgałęzień są inhibitorami allosterycznymi pierwszych enzymów szlaku. Gdy pojawia się jakieś określone stężenie związków w komórce, zostaje zahamowania jego synteza. Gdy doda się związek z zewnątrz, który jest metabolitem pośrednim w szlaku, to ostatni związek będzie zawsze powstawał.
Np. możemy albo dostarczać L-treoninę, która jest przekształcana w 2-oksomaślan
U Seratii D-treonina zwiększa aktywność enzymu. Obecność D-treoniny będzie sprawiać, że ilość oksomaślanu będzie stała - a ten oksomaślan jest wykorzystywany do syntezy izoleucyny... enzym poprzedzający oksomaślan nie jest w tym wypadku potrzebny, więc nie obchodzi nas, czy go mamy, czy nie, bo oksomaślan jest dostarczany alternatywnie.
Gdy mamy mutanty regulatorowe, to gdy związek wpływa na syntezę enzymu, to jeśli zostanie wprowadzona mutacja konstytutywna, to ostatni związek nie będzie wpływał na pierwsze przekształcenie, natomiast, gdy będzie to mutacja dotycząca hamowania zwrotnego, to nie będzie wpływał też na aktywność enzymów. Jeśli związek wykazuje obie te aktywności, to należy sprawić,aby obie mutacje były wprowadzone: czyli aby byłą odpowiednia ilość cząsteczek enzymu, jak i był on blokowany.
Czy można osiągnąć nadprodukcję dwóch związków jednocześnie? Nie można - istnieje zawsze konkurencją o jakiś metabolit - czy to energię. Można osiągnąć zwiększoną produkcję, ale nie nadprodukcję.
Przykład na zmianę właściwości błony.
Nadprodukcja warunkowana usuwaniem produktu ze środowiska reakcji tj. wzmożonym transportem produktu końcowego szlaku na zewnątrz w wyniku modyfikacji właściwości błony komórkowej.
Dodatek kwasów nasyconych do pożywki, czy też mutacje w biosyntezie kwasu oleinowego (nienasycony), czy też glicerolu, lub detergenty powodują zmianę - okazuje się, że produktywność się zmienia. Na 1 gram świeżej masy powstaje 2300 mg kwasu glutaminowego. Rozłożenie w tych dwóch przestrzeniach się drastycznie zmienia. Około 0,5 mg jest wewnątrz komórki, natomiast cała reszta na zewnątrz.
W przypadku niemodyfikowanej komórki ustala się równowaga.
Gdy mamy około 20 mg/1g świeżej masy, 7mg zostaje w komórce, 13 wypada poza błonę.
Tak więc wydajność wzrasta w pierwszym przypadku przynajmniej stokrotnie.
Jeżeli mamy obniżoną ilość glicerolu, to ilość fosfolipidów też jest mniejsza. Zatem ważna jest zmiana składu fosfolipidów, jeśli chodzi o ich skład, a więc zwiększenie nasycenia kwasów w fosfolipidach,a z drugiej strony ilość fosfolipidów w błonie. Detergenty wpływają podobnie - mogą usuwać z błony część lipidów.
Jeśli w komórce jest dużo ATP = dużo NADH, to wtedy poziom energetyczny komórki jest wysoki i należało się spodziewać, że komórka nie potrzebuje energii.
Obecność szczawiooctanu jest niezbędna, aby szlak zachodził. Mało szczawiooctanu -> cykl Krebsa nie działa, bo niemożliwa jest kondensacja z acetylo-CoA. Szczawiooctan możliwy do wykorzystania asparaginianu, który może wpływać hamująco na syntezę szczawiooctanu, czyli na karboksylację fosfoenolopirogronianu (PEP), czy pirogronianu.
Pirogronian może być przekształcany w alaninę.
Nadprodukcja kwasu cytrynowego
Niektóre metabolity przemian biochemicznych mogą działać hamująco. Jeśli jest dużo cytrynianu lub fosfoenolopirogronianu (PEP), świadczy to, że procesy zużywania związków są upośledzone i nie ma sensu metabolizować kolejnych cząsteczek w celu wyprodukowania fosfoenolopirogronianu.
Aspergillus niger - do nadprodukcji kwasu cytrynowego.
Enzymy fosfofruktokinaza, czy dehydrogenaza przekształcająca pirogronian w acetylo-CoA są niewrażliwe na cytrynian. Nie zahamuje to glikolizy, czy powstawania acetylo-CoA, a więc związku, który jest potrzebny dla cytrynianu.
Jeśli jest wysoki poziom jonów amonowych przy deficycie manganowych na drugim stopniu utlenienia w szczepach wrażliwych na hamowanie przez cytrynian fosfofruktokinazy, to również nie obserwujemy wpływu kwasu cytrynowego na ten enzym.
Należy zablokować akonitazę, która wykazuje niską aktywność i jest hamowana w warunkach niskich stężeń jonów manganu, czy żelaza na II stopniu utlenienia.
Dodatkowo stwierdzono, że w przekształcenie fosfoenolopirogronianu w pirogronian nie podlega regulacji przez poziom energetyczny.
Niski poziom jonów cynku powoduje, że pirogronian nie odpływa do innych przemian w komórce, a może być wykorzystany do wytwarzania kwasu mlekowego, jeśli jest nadmiar zredukowanych nukleotydów. W momencie, gdy cytrynian jest intensywnie produkowany, ilość zredukowanych nukleotydów jest wysoka.
Inne drogi wykorzystania cytrynianu
liaza izocytrynianowa - rozszczepienie na glioksalan i bursztynian. W momencie nadprodukcji ten enzym jest wyłączany (normalnie jest włączony). Należy również spowodować, aby stężenie asparaginianu nie mogło hodować biosyntezy szczawiooctanu, i zahamować aktywność enzymów, które przekształcają cytrynian w inne metabolity Krebsa - obniżenie aktywności akonitazy przez deficyt jonów, czy też
dehydrogenaza 2-oksoglutaranowa hamowana przez glukozę i jon NH4+ z podłoża.
Problem pojawia się w tym, że komórka ma wysoki potencjał energetyczny... komórka ma sporo NADH.. związki te hamują glikolizę. Jeśli hamują, to nie ma nadprodukcji kwasu cytrynowego, a trudno sobie wyobrazić, aby komórki w fazie intensywnej produkcji cytrynianu były w sanie zużyć nadmiar energii. Szkielet węglowy -glukoza, może być wykorzystywana do różnego typu szkieletów węglowych i jest zużywana w 90% do produkcji cytrynianu.
Jak zużyć związki wysokoenergetyczne?
Jak zużyć to tak, aby nie dawało to energii?
Istnieją dwie drogi w łańcuchu przenoszenia elektronów.
Jeden przez łańcuch cytochromów, gdzie pozostaje ATP, które hamuje glikolizę ,a stymuluje glukoneogenezę - symulacja cytrynianu do glukozy.
Droga alternatywna przenosi bezpośrednio elektrony na tlen bez wytwarzania wiązań o wysokiej energii. A droga wymaga tego, by tlenu było dużo. Jeśli natlenienie takiej zawiesiny komórkowej zacznie szwankować, to droga ta jest wyhamowana i ciężko ją przywrócić z powrotem.
Tak więc: w normalnej hodowli mamy czas intensywnego wzrostu, następnie czas stabilizacji. W czasie intensywnego wzrostu glikoliza/cykl pentozowy = 2:1. w czasie równowagi, glikoza/cykl pentozowy = 4:1. - do biosyntezy NADPH
Musi być wysoki poziom glukozy w podłożu, dobre natlenienie hodowli, oraz deficyt PO42-, Mn2+, Zn2+, Fe2+. Deficyt jonów fosforanowych ogranicza powstawanie ATP.
Jak rozdzielić?
Można użyć kwasu siarkowego(VI) - trudno rozpuszczalne sole.
Chromatografia jonowymienna - pojawienie się ładunku zmienia polarność. Istotne dla chromatografii podziałowej. Współczynnik podziału danego związku będzie przesunięty w kierunku fazy o wyższej polarności.
W przypadku aminokwasów istotne są dwie rzeczy - z jednej strony źródło azotu, z drugiej szkielet węglowy. Jeśli chodzi o pozyskiwanie azotu, to aby był on włączany do metabolizmu, musi być zredukowany, w postaci jonu amonowego - jako taki jest wykorzystywany. Powstają wówczas aminokwasy. Grupa amonowa może być przenoszona do różnych związków. Źródłem jonu amonowego może być chlorek amonu.
W wyniku katabolizmu powstają jony amonowe, które muszą być związane, aby nie było zatrucia organizmu. W przypadku roślin i zwierząt, musi być on przekształcony -w przypadku ssaków mocznik, gadów, ptaków - kwas moczowy.
Prekursorami węglowymi mogą być różne ketokwasy.
Jak funkcjonuje proces włączania jonu amonowego do tego typu związku?
Podstawowym mechanizmem jest produkcja glutaminianu, która może się odbywać na dwa sposoby, w zależności od stężenia jonu amonowego w komórce.
Jeśli jest wysokie, to następuje włączenie amoniaku do 2-oksoglutaranu z wytworzeniem glutaminianu z włączeniem dehydrogenazy glutaminianowej.
Jeśli stężenie jonów amonowych jest niskie, to funkcjonuje druga droga, która polega na tym, że jest w pierwszym etapie powstaje glutamina - amid kwasu glutaminowego. Włączenie jonu amonowego wymaga dostarczenia energii. Działa syntetaza L-glutaminowa. Z Glutaminy grupa est przenoszona na 2-oksoglutaran w obecności syntazy glutaminianowej i odtwarzana jest cząsteczka L-glutaminianu.
Powinowactwo dehydrogenazy L-glutaminianu jest mniejsze od synteazy L-glutaminianu
Km dehydrogenazy L-glutaminianowej < Km syntetazy L-glutaminowego.
Biotechnologia, wykład IX, strona 7