14. GENETYKA ZACHOWANIA

System nerwowy, ktory steruje zachowaniem zwierzat powstaje w wyniku ekspresji wielu genow i oddzialywan pomiedzy produktami tych genow w czasie cyklu rozwojowego. To ktore z alleli genow obecnych w populacji biora w tym udzial w przypadku konkretnego osobnika, ma znaczenie dla budowy i funkcjonowania jego sieci neuronowej. A to z kolei ma istotne znaczenie dla ekspresji wzorcow zachowan w tym sensie, ze organizmy skonstruowane przy udziale produktow okreslonego kompletu alleli reaguja podobnie w tych samych okolicznosciach. Na zachowanie jednak, oprocz genow, ma rowniez wplyw doswiadczenie osobnicze. Nawet sama struktura systemu nerwowego jest przez doswiadczenie osobnicze modyfikowana, co dotyczy szczegolnie wczesnego etapu rozwoju, gdy budowa sieci neuronow nie jest jeszcze zakonczona. Trudno jest wiec oddzielic wplyw skladnika genetycznego na zachowanie od skladnika zaleznego od doswiadczenia.

Mimo tej i innych komplikacji osiagnieto ogromny postep w dziedzinie badan genetyki zachowania, w czym spory udzial maja badania na modelu drosofili. Drosofila wbrew pozorom wykazuje wiele zachowan niekiedy dosc skomplikowanych zwiazanych z poszukiwaniem pozywienia, rytmem dobowym, zalotami czy uczeniem sie, ktorych komponenty genetyczne zaczynamy rozumiec. Ogolne zasady wypracowane podczas tych badan stanowily w pewnych przypadkach model, na ktorym oparto sie badajac genetyke zachowan zwierzat bardziej ewolucyjnie zaawansowanych. Okazalo sie, ze, tak jak wzrostowi komplikacji systemu genow Hox podczas ewolucji (Ryc. 13 - 21) towarzyszyl wzrost stopnia komplikacji budowy ciala zwierzat, tak tez i ich zachowanie komplikowalo sie w wyniku komplikacji struktur (genow i ich produktow) za nie odpowiedzialnych.

Szukanie pozywienia. Prostym przykladem zachowania uwarunkowanego genetycznie jest szukanie pozywienia przez larwy drosofili. Wyroznia sie dwa typy zachowan: typ wloczegi, "r" (rover) i typ osadnika, "s" (sitter). Roznice w zachowaniu obserwuje sie tylko wtedy, gdy larwy szukaja pozywienia (Ryc. 14 - 1).

Ryc. 14 - 1. Zachowanie larw drosofili typu wloczega (r) i osadnik (s). (a) osadnicy nie odchodza od miejsca w ktorym jest pozywienie i maja mniejsza tendencje do wedrowania gdy pokarm znajduje sie na calej plytce. Gdy pozywienia nie ma (agar) zarowno typ "r" jak i "s" wedruja. (b) Dlugosc sciezki na plytce z pozywieniem wynosi okolo 6 cm dla typu "s" i okolo 16 cm dla typu "r".

Osobnik typu "r" zostawia dluzsza sciezke i wykazuje wieksza tendencje do odejscia od miejsca, w ktorym znalazl juz pozywienie niz osobnik typu "s". Wykazane zostalo, ze zachowanie to jest genetycznie uwarunkowane. Gen odpowiedzialny za nie ("for" od ang. foraging, szukanie jedzenia) zostal zlokalizowany w genomie i sklonowany. Allel for^R jest dominujacy w stosunku do for^s i obydwa mozna uwazac za allele dzikie. W populacjach naturalnych "r" i "s" wystepuja w proporcjach 70 : 30. Stosujac presje selekcyjna mozna te proporcje zmienic. W populacjach o duzej gestosci "r" maja przewage nad "s" natomiast w populacji o niskiej gestosci larw, przewaga ewolucyjna jest po stronie "s". Nalezy zwrocic uwage, ze obydwa fenotypy sa plastyczne, gdyz zarowno larwy jak i dorosle owady typu wloczega zachowuja sie tak jak osadnicy, gdy otrzymaja pozywienie po pewnym okresie glodowki, natomiast osadnicy zachowuja sie jak wloczegi przy braku pozywienia. Klonowanie wykazalo, ze produktem genu for jest kinaza bialkowa zalezna od cGMP zwana PGK (protein cGMP dependent kinase). Jego calkowita delecja jest letalna. Fenotyp "s", moze byc spowodowany kilkoma roznymi mutacjami genu for^R m.in. wstawieniem transpozonu w odpowiedniej pozycji genu (jego wyciecie powoduje rewersje do fenotypu "r"). Fenotyp "s" zwiazany jest ze zmniejszona aktywnoscia enzymatyczna PGK w glowie drosofili. Enzym ten jest typowym skladnikiem sciezek transdukcji sygnalu (Ryc. 13 - 12) i wykazuje plejotropie (kilka roznych niezwiazanych z soba pozornie efektow fenotypowych). Wplywa on na przewodnictwo membrany neuronow u slimakow i u ssakow ale ma rowniez wplyw na proliferacje komorek miesni. Fenotypy podobne do "r" i "s" obserwuje sie tez u C. elegans. Roznice w zachowaniu odpowiadaja w tym przypadku roznym allelom genu npr-1 (neuropeptide receptor), ktory jest homologiem genu kodujacego receptor neuropeptydu Y u ssakow.

Zegar dobowy zwierzat. Przelomem w dziedzinie genetyki zachowania bylo zrozumienie molekularnej podstawy rytmow dobowych u zwierzat. Stwierdzono mianowicie, ze takie wskazniki stanu fizjologicznego zwierzat (i czlowieka) jak temperatura ciala, cisnienie tetnicze, stezenie hormonow czy aktywnosc miesni i ukladu nerwowego wykazuja cyklicznosc skorelowana z cyklem dobowym. Obserwujac w ktorym momencie dnia nastepuje linka imaginalna drosofili (przeksztalcanie sie larwy w imago, co w przypadku szczepu dzikiego ma miejsce nad ranem), a takze badajac rytm spoczynku i aktywnosci owada, stwierdzono, ze zachowania te sa genetycznie uwarunkowane.

Pierwszyszym genem scharakteryzowanym przez badaczy byl gen per, i jego trzy mutanty per^l, per^s i per⁰ (lenghtening, shortening i arrythmicity). Nastepnie zidentyfikowano gen tim (timeless), w ktorym mutacje rowniez dawaly efekt fenotypowy, a takze wplywaly na ekspresje genu per. Obydwa geny sa transkrybowane wczesnie rano, ale najwyzsze stezenie ich mRNA obserwuje sie w nocy. W tym czasie nastepuje tez synteza bialek PER i TIM, ktore tworza heterodimer. Bialka PER i TIM oddzielnie nie wnikaja do jadra komorkowego, natomiast ich heterodimer posiada te wlasnosc. W jadrze heterodimer wiaze sie z czynnikami transkrypcyjnymi dClk (drosophila Clock) i CYC (CYCLE). Utworzenie kompleksu PER-TIM z dClk i CYC utrudnia tym czynnikom transkrypcyjnym wiazanie sie z promotorami genow per i tim. W wyniku tego transkrypcja tych genow jest zmniejszona, ale nie zahamowana calkowicie. Calkowite zahamowanie ekspresji genow per i tim powoduje natomiast monomer PER. Tak wiec aby represor PER mogl w pelni wykazac swoja aktywnosc musi nastapic dysocjacja heterodimeru PER-TIM w jadrze komorkowym.

Cykl zegara dobowego drosofili mozna przedstawic nastepujaco: w pierwszym etapie nastepuje synteza mRNA z genow per i tim aktywowana przez dClk i CYC. Powstajacy w wyniku informacyjny RNA jest transportowany do cytoplazmy, gdzie ma miejsce synteza bialek PER i TIM. Po osiagnieciu odpowiedniego stezenia tych bialek w cytoplazmie nastepuje utworzenie sie heterodimeru PER-TIM, co jest etapem stosunkowo powolnym. Heterodimer jest transportowany do jadra gdzie tworzy kompleks z dClk-CYC co prowadzi do spowolnienia ekspresji genow per i tim. Rownoczesnie PER-TIM powoli ulega dysocjacji w wyniku czego pojawia sie bialko PER, ktore jest silnym represorem genow per i tim. Gdy stezenie tego bialka osiagnie odpowiedni poziom, transkrypcja per i tim ustaje. Jednakowoz nastepujaca powoli degradacja PER zarowno w cytoplazmie jak i w jadrze powoduje powrot do stanu wyjsciowego, co z kolei umozliwia ekspresje genow per i tim i cykl rozpoczyna sie od nowa. Dwa dodatkowe czynniki maja wplyw na przebieg cyklu. Jednym z nich jest bialko DBT (produkt genu dbt doubletime), ktore jest produkowana konstytutywnie kinaza, obecna zarowno w cytoplazmie jak i w jadrze. Kinaza ta fosforyluje bialko PER, co pociaga za soba jego degradacje. Aktywnosc DBT opoznia wiec akumulacje PER w cytoplazmie i tym samym utworzenie kompleksu PER-TIM natomiast w jadrze powoduje derepresje transkrypcji per i tim. (Ryc 14 - 2). Aktywnosc genu dbt zapewnia utrzymanie rytmu dobowego niezaleznie od oswietlenia. Drugim skladnikiem systemu zegara dobowego drosofili jest swiatloczuly flawoproteid CRY (CRYPTOCHROME). Umozliwia on synchronizacje zegara przez swiatlo. Sadzi sie, ze ten flawoproteid wyewoluowal z fotoliaz (Patrz rozdzial 2). Jego obecnosc pociaga za soba fosforylacje i ubikwitynacje TIM i jego degradacje proteolityczna. Gdy nad ranem, heterodimer PER-TIM nagromadzony w jadrach komorkowych spowalnia ekspresje genow per i tim, nawet krotka ekspozycja na swiatlo pociaga za soba degradacje TIM, uwolnienie PER i calkowita represje transkrypcji genow zaleznych od dClk i CYC, co przyspiesza cykl dobowy. Natomiast duzo wczesniejsza ekspozycja na swiatlo (np. wkrotce po zachodzie slonca) opozni ten cykl dlatego, ze w tym czasie kompleks PER-TIM jest jeszcze w cytoplazmie i dzialanie CRY spowoduje jego rozklad przed transportem do jadra.

Ryc. 14 - 2. Zegar okolodobowy drosofili. per i, tim geny period i timeless, ulegaja transkrypcji z utworzeniem odnosnych informacyjnych RNA (owale P i T opatrzone znakiem "~"). aktywowane przez czynniki transkrypcyjne dClk (C) i CYC (B). Bialka P i T tworza dimer wnikajacy do jadra komorkowego. Stezenie bialka P zarowno w cytoplazmie jak i w jadrze jest regulowane przez produkt genu double-time (D), ktory powoduje fosforylacje P.

Geny zegara dobowego ulegaja ekspresji w wielu typach komorek u drosofili, w ktorych jest on w zasadzie autonomiczny. Rytm utrzymuje sie nawet w kulturach komorkowych. Mozna w takich kulturach spowodowac zmiane cyklu przez zmiane rytmu swiatlo-ciemnosc.

U ssakow sytuacja jest nieco inna. O ile ekspresja genow zegara dobowega zachodzi w tkankach wielu roznych organow takich jak miesnie, pluca czy watroba o tyle oscylatory te nie sa synchronizowane przez swiatlo tak jak u drosofili, jako ze tkanki ssakow w odroznieniu od tkanek drosofili sa nieprzezroczyste. U ssakow synchronizacja zegarow tkankowych odbywa sie w wyniku aktywnosci obecnej w mozgu struktury zwanej jadrami ponadskrzyzowaniowymi, SCN (suprachiasmatic nuclei, Ryc. 14 - 3). Oscylatory, ktore sie w nich znajduja sa synchronizowane przez sygnaly przekazywane z oka. Swiatlo wpadajace do oka jest rejestrowane przez neurony zawierajace barwnik melanopsyne (a nie przez klasyczne komorki swiatloczule, czopki i preciki) co powoduje przekazanie sygnalu do SCN. Biora w tym udzial neurotransmitery, PACAP (pituary adenylate cyclase activating peptide) i glutaminian. Centralny zegar w SCN z kolei synchronizuje zegary drugorzedowe w mozgu przy pomocy neurotransmiterow oraz zegary znajdujace sie w tkankach zewnetrznych w stosunku do mozgu, przy pomocy nerwow obwodowych oraz przez system wydzielania wewnetrznego w czym biora udzial glukokortykoidy.

Ryc. 14 - 3. Zegar okolodobowy ssakow. Centralny oscylator u ssakow znajduje sie w jadrach ponadskrzyzowaniowych (SCN - suprachiazmatic nuclei). Zawieraja one wiele komorek, ktore otrzymuja informacje z oka poprzez wiazke nerwowa (RHT - retinohypothalamic tract) dotyczaca zewnetrznego oswietlenia. Sygnal ten powoduje ich synchronizacje. Komorki centralnego oscylatora przekazuja informacje do innych czesci mozgu oraz do oscylatorow drugorzedowych (w nerkach, watrobie itp.)

U myszy i u czlowieka zidentyfikowano osiem podstawowych genow zegara okolodobowego. Sa to geny Clock, (ortologiczny do genu dClk drosofili) kinaza kazeinowa CKIε, kryptochrom 1 i 2 (Cry1, 2) Period 1, 2 i 3 (Per1 - 3) oraz Bmal1 (ortologiczny do genu CYC drosofili).

Ryc. 14 - 4. Schemat przedstawiajacy funkcjonowanie zegara okolodobowego u ssakow.

Rytmy okolodobowe sa u ssakow generowane przez sprzezenia zwrotne obejmujace geny cyklu okolodobowego i ich produkty Ryc. 14 - 4). Stezenie bialka Clock w komorce jest stale w okresie 24-ro godzinnym, natomiast stezenie bialka Bmal1 oscyluje. Na poczatku subiektywnego dnia ekspresja genu kodujacego Bmal1 jest wysoka a na poczatku subiektywnej nocy jest niska. Wysokie stezenie Bmal1 powoduje utworzenie kompleksu Bmal1-Clock. Kompleks ten wiaze sie z kasetami E (CACGTG) obecnymi w promotorach genow Cry, Per i Rev-Erbα aktywujac transkrypcje tych bialek na poczatku dnia. Kompleks Bmal1-Clock zaczyna z opoznieniem inhibowac transkrypcje genu Bmal1 poniewaz bialko Rev-Erbα (o charakterze receptora hormonu) po wejsciu do jadra inhibuje jego transkrypcje. Inhibuje ono rowniez transkrypcje genu Cry. Produkty genow Per (takie jak bialko Per2) gromadza sie w cytoplazmie gdzie sa fosforylowane przez kinaze kazeinowa CKIε i po fosforylacji degradowane. Jednak w miare syntezy i gromadzenia sie bialka Cry w cytoplazmie w ciagu dnia powstaje stabilny kompleks CKIε/Per/Cry, ktory wnika do jadra na poczatku nocy. Bialko Cry1 rozbija kompleks Bmal1-Clock co powoduje inhibicje transkrypcji genow Cry, Per i Rev-Erbα Powoduje to z kolei derepresje transkrypcji genu Bmal1. Dzieki tym sprzezeniom zwrotnym na poczatku nowego dnia stezenie bialek Per i Cry jest niskie a Bmal1 wysokie.

Podobienstwo do zegara drosofili jest uderzajace mimo ze system jest bardziej skomplikowany. Ewolucja zegara nastepowala jak widac m. in. poprzez szereg duplikacji, czego dowodzi istnienie trzech genow Per i dwoch genow Cry u ssakow. Cykl okolodobowy jest sprzezony z cyklem komorkowym m. in. pooprzez bialko Wee1, ktorego promotor zawiera sekwencje nukleotydow rozpoznawane przez Bmal1-Clock i który jest kinazą fosforylującą Tyr14 i Thr15 w CDK1.

Mutacje w genach zegara wplywaja bardzo na zachowanie nosicieli. W populacjach ludzkich zidentyfikowano na przyklad szereg alleli genu hPer3 ktore koduja rozne sekwencje aminokwasow. Jeden z tych alleli jest skorelowany z DSPS (delayed sleep phase syndrom). Jest to syndrom, ktory polega na tym, ze osoby nim dotkniete nie moga zasnac do pozna w nocy a rano nie potrafia zbudzic o takiej porze aby zdazyc na czas do szkoly czy do pracy. Natomiast mutacja w genie hPer2, w regionie odpowiedzialnym za tworzenie kompleksu przez bialko hPER2 z kinaza kazeinowa, powoduje syndrom zwany FASPS (familial advanced sleep phase syndrom). Nosiciele tego zmutowanego allelu sa "rannymi ptaszkami" i maja rytm snu, poziomu melatoniny we krwi i temperatury ciala przesuniety o cztery godziny w stosunku do rytmu dobowego przecietnej osoby. Odczuwaja one sennosc we wczesnych godzinach wieczornych i budza sie rano znacznie wczesniej niz inni.

Geny cyklu okolodobowego reguluja fizjologie czlowieka w dwojaki sposob. Po pierwsze reguluja wydzielanie hormonow, ktore z kolei kontroluja proliferacje oraz apoptoze w sposob tkankowo specyficzny. Z drugiej strony wplywaja na funkcjonowanie roznych tkanek poprzez system nerwowy. Zaburzenia zegara okolodobowego powoduja zaburzenia w fizjologii komorek. W szczegolnosci, u osob z zaburzonym rytmem (np. na skutek pracy "na zmiany") stwierdza sie wyzsza zapadalnosc na nowotwory.

Funkcja receptora glukokortykoidu w neuronach. Jak wspomniano powyzej, jednym z elementow sygnalizacyjnych w ukladzie nerwowym sa glukokortykoidy. Receptory glukokortykoidow koordynuja odpowiedz ukladu wydzielania wewnetrznego, ukladu imunologicznego i ukladu nerwowego na bodzce zewnetrzne w sytuacjach takich jak stress. Kontroluja one transkrypcje genow albo bezposrednio, oddzialywujac z DNA promotorow, albo posrednio, wplywajac na aktywnosc innych czynnikow transkrypcyjnych. Z pleiotropii dzialania glukokortykoidow wynika jedna z trudnosci na jakie napotyka sie przy probach badania ich funkcji w ukladzie nerwowym i ich wplywu na zachowanie. Stwierdzono np, ze delecja genu kodujacego receptor Grl1 myszy jest letalna. Podobnie ma sie z innymi elementami ukladow sygnalizacyjnych funkcjonujacych w ukladzie nerwowym. Proby konstrukcji homozygot typu "knock out", z delecja w genach, ktorych wplyw na zachowanie chciano badac, konczyly sie czesto smiercia organizmu na etapie embrionu. Delecje takie prowadza do utraty zbyt wielu, zbyt istotnych funkcji, aby organizm mogl sie bez nich obyc. W celu ominiecia tej przeszkody zaprojektowano specjalna technike, przy pomocy ktorej konstruuje sie organizmy z tkankowo specyficznymi delecjami genow. Oparta ona jest na systemie rekombinacji Cre/loxP u faga P1.

W celu skonstruowania szczepu myszy u ktorych nastepuje utrata funkcji Gr w systemie nerwowym skonstruowano dwa szczepy pomocnicze. Pierwszy szczep zawieral allel genu receptora glukokortykoidu Grl1 oflankowany sekwencjami loxP (locus of X-ing over, "X" nalezy czytac "cross", ang. krzyz). Sa to gorace miejsca rekombinacji bakteriofaga P1, zawierajace dwie 13 nukleotydowe odwrocone sekwencje powtarzajace, przedzielone 8 nukleotydowa wstawka (ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT). Sekwencje loxP sa rozpoznawane przez rekombinaze Cre z tegoz bakteriofaga. Drugi szczep myszy niosl gen kodujacy te wlasnie rekombinaze. Jego ekspresja znajdowala sie pod kontrola specyficznego tkankowo promotora i wzmacniacza.

Ryc. 14 - 5 Kolejne etapy konstrukcji allelu genu Grl^loxP (a) od gory : allel szczepu dzikiego, konstrukcja wyjsciowa w plazmidzie, allel zmodyfikowany, allel po rekombinacji usuwajacej geny neo i tk sluzace do selekcji rekombinantow ( korzystny wynik rekombinacji), allel po delecji calego konstruktu (niekorzystny wynik rekombinacji) (b) gen Cre pod kontrola promotora i wzmacniacza nestyny.

Aby otrzymac pierwszy z tych szczepow, w komorkach ES (embrionic stem) myszy zastapiono allel szczepu dzikiego genu Grl1 konstrukcja zawierajaca obok allelu Grl1^loxP rowniez geny kodujace opornosc na antybiotyk neomycyne, neo^r oraz gen kinazy tymidynowej tk wirusa HSV (herpes simplex virus) (Ryc. 14 - 5). Aby wyselekcjonowac komorki w ktorych nastapila rekombinacja hodowano je na pozywce zawierajacej antybiotyk G418, na ktory komorki zawierajace gen opornosci na neomycyne sa niewrazliwe. Nastepnie wyselekcjonowane komorki poddano transfekcji plazmidem zawierajacym gen Cre kodujacy rekombinaze faga P1. Transfekcja plazmidem powoduje tylko przejsciowa ekspresje rekombinazy. Komorki te hodowano nastepnie w obecnosci gancykloviru. Jest to nukleozyd, analog guanozyny, ktory jest fosforylowany w komorkach przez kinaze tymidylowa wirusa HSV a nastepnie jest zamieniany na trojfosforan. Dokladny mechanizm dzialania gancycloviru nie jest znany, ale w formie trojfosfonukleotydu jest on dla komorek toksyczny. Przezywaja tylko te z nich w ktorych rekombinaza spowodowala delecje genu tk. Zwazywszy ze w konstrukcie sa obecne trzy sekwencje loxP mozliwe sa dwa produkty rekombinacji : jeden z delecja calego konstruktu i drugi, ktory posiada pozadany allel Grl1^loxP ale juz bez genow tk i neo. Komorki zawierajace ten allel wszczepione zostaly do embrionu na etapie blastocysty i implantowane myszom u ktorych wywolano pozorna ciaze. W pierwszym pokoleniu otrzymano chimery (byly one laciate gdyz komorki ES pochodzily od myszy rozniacej sie kolorem futra od myszy od ktorej pochodzil embrion), w drugim pokoleniu zidentyfikowano te, ktore niosly gen Grl1^loxP w linii zarodkowej (mozna je bylo zidentyfikowac po kolorze).

Drugi szczep myszy uzywany w doswiadczeniach tego typu zawiera gen Cre bedacy pod kontrola tkankowo specyficznego promotora i wzmacniacza. W przypadku, w ktorym badano wplyw tkankowo specyficznej delecji genu kodujacego receptor glukokortykoidu uzyto promotor i wzmacniacz genu nestyny szczura. Jest to jedno z bialek wchodzacych w sklad filamentow posrednich. Jest ono obecne wylacznie w komorkach ukladu nerwowego.

Myszy o genotypie Grl1^loxP/loxPNesCre otrzymane w wyniku serii krzyzowek pomiedzy tymi dwoma szczepami nie wykazywaly ekspresji Gr w mozgu, natomiast wykazywaly ja w innych organach. Natomiast myszy Grl1^loxP/loxP nie roznily sie pod tym wzgledem od myszy szczepu dzikiego.

Wykonano szereg doswiadczen w celu stwierdzenia jaki jest wplyw braku ekspresji Gr w mozgu na zachowanie zwierzat a w szczegolnosci na ich reakcje na stres. Myszy, ktore z reguly wola przebywac w zamknietym i ciemnym pomieszczeniu po wyjsciu na oswietlona i otwarta przestrzen szybko wracaja do "nory", gdzie przez pewien czas przebywaja zanim zdecyduja sie na ponowne wyjscie. W jednym z przeprowadzonych doswiadczen myszy byly umieszczane w ciemnym pomieszczeniu z mozliwoscia wyjscia na oswietlona przestrzen. Mutanty NesCre przebywaly przecietnie 50 sekund na przestrzeni oswietlonej w ciagu 5 minutowego testu podczas gdy myszy kontrolne przebywaly tam tylko okolo 30 sekund. Po wyjsciu na oswietlona przestrzen mutanty chowaly sie w ciemnym pomieszczeniu przez okolo 80 sekund podczas gdy myszy kontrolne potrzebowaly ponad 150 sekund na odzyskanie odwagi i powtorne wyjscie na swiatlo. Podobnie, majac do wyboru przebywanie w zamknietym pomieszczeniu albo na otwartej przestrzeni myszy kontrolne przebywaly na otwartej przestrzeni przecietnie 5 sekund podczas gdy myszy NesCre okolo 20 sekund. Te i podobne doswiadczenia pokazaly, ze brak ekspresji genu Grl1 w ukladzi nerwowym zmniejsza reakcje tego ukladu na stress (Ryc. 14 - 6).

Ryc. 14 - 6. Reakcja myszy transgenicznych pozbawionych receptora glukokortykoidu w ukladzie nerwowym na stres. Czas przebywania : A. w ciemnym pomieszczeniu, B na jasnej przestrzeni, C na otwartej przestrzeni dwiema lapkami, D na otwartej przestrzeni czterema lapkami.

Rola receptora NMDA w zapamietywaniu. Uczenie sie jest zwiazane z zapamietywaniem, ktore z kolei jest zwiazane z mozliwoscia modulacji polaczenia synaptycznego pomiedzy neuronami w hipokampie (Ryc. 14 - 7). Efekty dlugotrwalego wzmocnienia lub oslabienia transmisji postsynaptycznych zwane LTP (long term potentiation) i LTD (long term depression) uwazane sa za mechanizmy, ktore na poziomie komorkowym odpowiadaja za zapamietywanie roznego rodzaju bodzcow. Elementami strukturalnymi neuronow postsynaptycznych, ktore sa aktywowane podczas indukcji LTD i LTP sa receptory NMDA (N-metylo-D-asparaginianu). Sa to pory w blonie komorkowej kontrolujace wnikanie jonow wapnia do komorki. Funkcje te spelnia kompleks bialek w ktorego sklad wchodza cztery podjednostki. Zwiazek receptorow NMDA z pamiecia sugerowal wynik doswiadczenia w ktorym wykazano, ze szczury, ktorym zablokowano chemicznie te receptory nie potrafily nauczyc sie przechodzenia przez labirynt najkrotsza droga. Proba otrzymania myszy z calkowita delecja genu kodujacego podjednostke NR1 receptora NMDA nie udala sie poniewaz delecja okazywala sie letalna. W celu otrzymania tkankowo specyficznej delecji tego genu posluzono sie technika Cre/loxP. Gen Cre umieszczono pod kontrola promotora genu CaMKII, ktory jest szczegolnie aktywny w komorkach piramidalnych regionu CA1 hipokampu. Wyniki testow wykazaly, ze myszy z delecja genu kodujacego podjednostke NR1 receptora NMDA w regionie CA1 hipokampu wykazuja bardzo wyraznie zmniejszona pamiec przestrzenna.

Aby udowodnic, ze receptor NMDA jest rzeczywiscie odpowiedzialny za pamiec przestrzenna wykonano doswiadczenie majace na celu usprawnienie pamieci u myszy (Ryc. 14 - 8). W tym celu skonstruowano myszy ze zmodyfikowanymi receptorami NMDA, ktore zamiast podjednostek NR2A, charakterystycznych dla myszy doroslych, posiadaly podjednostki NR2B produkowane w komorkach myszy mlodych. Wiadomo bylo bowiem, ze z jednej strony myszy mlode, ktorych neurony zawieraja receptory NMDA z podjednostkami NR2B ucza sie szybciej niz myszy dorosle, z drugiej strony wykazano, ze receptory z tymi podjednostkami pozostaja otwarte dwa razy dluzej. Istotnie, pamiec myszy transgenicznych z dodatkowym genem kodujacym podjednostke NR2B pod kontrola promotora CaMKII, (co pociagalo za soba intensywna ekspresje tego genu w neuronach hipokampu) byla znacznie lepsza. Na przyklad, mysz wrzucano do naczynia z woda w ktorym na scianie byl znak pozwalajacy zorientowac sie w kierunkach a w jednym miejscu, pod powierzchnia umieszczona byla niewidoczna dla myszy platforma na ktorej mogla ona stanac. Myszy transgeniczne wrzucone do wody drugi raz znacznie predzej znajdowala platforme niz myszy szczepy dzikiego.

Ryc 14 - 8. Glupia mysz (z delecja genu kodującego podjednostke NR1 receptora NMDA) i mądra mysz (w ktorej podjednostka NR2B zastapila podjednostke NR2A w tym receptorze)

Rola receptora dopaminy DRD4 w zachowaniu czlowieka. Gen kodujacy receptor dopaminy DRD4 jest jednym z najbardziej polimorficznych genow w genomie czlowieka. Polimorfizm wynika z tego, ze w 3 eksonie posiada on sekwencje potarzajaca VNTR (variable number tandem repeat) o dlugosci 48 pz, ktora jest goracym miejscem rekombinacji (Ryc. 14 - 9). Stwierdzono, ze ilosc powtorzen waha sie od 2 do 11, przy czym ilosc alleli, ktore znaleziono w roznych populacjach jest znacznie wieksza jako ze w powtorzeniach wystepuja jeszcze mutacje punktowe. Dodatkowo stwierdza sie rowniez polimorfizm w regionie promotora tego genu. Poniewaz dopamina jest neurotransmiterem, i jej poziom w mozgu ma wplyw na zachowanie, gen kodujacy bialko DRD4 jest intensywnie badany. Najczesciej wystepujacym allelem jest ten, ktory zawiera 4 powtorzenia sekwencji VNTR. Wiekszosc pozostalych alleli powstala przez nierownomierna rekombinacje dwoch alleli DRD4 lyb przez mutacje punktowa w jednej lub kilku podjednostkach. Jeden allel tego genu, zawierajacy siedem powtorzen (7R) wyroznia sie od pozostalych. Aby go wyprowadzic z allelu wiekszosciowego 4R nalezy zalozyc kilka mutacji punktowych oraz szereg duplikacji (Ryc. 14 - 10). Proby oceny okresu w ktorym powstal daly zaskakujacy wynik 20 - 40 000 lat. Wynik ten jest zaskakujacy z tego wzgledu, ze allel 7R jest bardzo rozpowszechniony. Jednym z mozliwych tlumaczen pojawienia sie tego niezwyklego allelu jest hipoteza, ze wyewoluowal on w populacji bardzo dlugo odizolowanej od glownej linii ewolucyjnej prowadzacej do Homo sapiens i stosunkowo niedawno zostal wprowadzony do niej przez krzyzowke (dawca allelu mogl byc np. czlowiek neandertalski). Druga trudna do wytlumaczenia obserwacja to duza proporcja tego allelu w niektorych populacjach. O ile w populacjach ludow wschodnioazjatyckich stwierdza sie stosunkowo niewielka (5%) ilosc allelu 7R, u Indian amerykanskich, ktorzy od nich sie wywodza, allel 7R stanowi ponad 20% wszystkich alleli. Jedna z mozliwosci jest to, ze allel ten daje selektywna przewage jego nosicelom. Proby korelacji pomiedzy allelem 7R a fenotypem daly wyniki niejednoznaczne Niektorzy badacze stwierdzili korelacje z fenotypem ADHD (attention deficit/hyperactivity disorder). Diagnozuje sie tak dzieci (okolo 3% populacji), ktore nie uwazaja na lekcjach, sa impulsywne i hiperaktywne. Poniewaz lek metylfenidat, ktory podwyzsza stezenie dopaminy w mozgu zmniejsza objawy tej dolegliwosci uwaza sie ze ADHD ma swoja przyczyne w zaburzeniu sciezki sygnalizacyjnej zwiazanej z tym neurotransmiterem. Jak w wiekszosci przypadkow korelacja nie znaczy, ze wszyscy nosiciele allelu 7R sa dotknieci ADHD ani, ze wszyscy nosiciele ADHD posiadaja allel 7R. Gdy wyodrebniono z grupy dzieci u ktorych stwierdzono ADHD te, ktore byly nosicielami allelu 7R okazalo sie, ze oprocz braku uwagi i hiperaktywnosci nie wykazywaly one zmniejszonego czasu reakcji w porownaniu z dziecmi normalnymi podczas gdy czesc dzieci ADHD nie bedacych nosicielami tego allelu taki defekt wykazywala. Inne studium pokazalo, ze istnieje korelacja pomiedzy allelem 7R a zmiennoscia emocjonalna wykazywana przez niektore jednoroczne dzieci, w szczegolnosci gdy gen oprocz 7 powtorzen VNTR posiada T w pozycji -521 promotora (Ryc. 14 - 11). Nie wszystkim badaczom udalo sie odtworzyc te wyniki, co moze miec zrodlo w roznicach w genotypach badanych populacji. Niemniej nalezy sie spodziewac, ze badania nad tym genem beda kontynuowane.

Ryc. 14 - 10. Schemat ewolucji alleli genu DRD4

Ryc 14 - 11. Zachowanie niemowlat w zaleznosci od genotypu. D oznacza niekonsekwencje w zachowaniu (disorganised attachment behaviour), CC CT i TT genotyp ze wzgledu na obecnosc allelu zawierajacego C lub T w pozycji -521 promotora genu DRD, +7 oznacza obecnosc allelu zawierajacego 7 powtorzen VNTR w genie kodujacym DRD4.

Genetyka zachowania

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

187

209

187

221

s

r

ilosc osobnikow

Dlugosc sciezki, cm

s

r

Ryc. 14 - 9. Schemat genu kodujacego DRD4. Zaznaczone sa pozycje VNTR (variable number tandem repeats, i SNP (single nucleotide polymorphism). Ponizej zaznaczony jest procentowy udzial poszczegolnych alleli w swiatowej populacji.

A

B

D

C

Ryc. 14 - 7. Synapsa w hipokampie. Uwaza sie, ze pamiec polega na powiazaniu w czasie dwoch zdarzen, wiazania glutaminianu uwalnianego z neuronu presynaptycznego oraz elektrycznej stymulacji przez drugi neuron, ktory wydziela jony magnezu z kanalu receptora. Powoduje to wejscie jonow wapnia do drugiego neuronu co aktywuje kaskade reakcji prowadzacej do wzmocnienia synapsy.

---