KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Kinetyka reakcji chemicznych to badanie szybkości przebiegu reakcji zależ­nie od różnych czynników:

stężenia reagujących substancji, temperatury, obecności kata­lizatorów itp.

Poznanie tych zależności po­zwala podać szybkość reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu substratu. Szybkość reakcji chemicznej jest w każdej chwili proporcjonalna do stężenia substancji reagujących i oznacza stosunek przyrostu stężenia produktu reakcji (lub ubytku stężenia substratu) do czasu, w którym ten przyrost (ubytek) nastąpił. Miarą szybkości reakcji w danym momencie jest więc przyrost stężenia produktu (lub ubytek stężenia substratu), jaki by nastąpił w jednostce czasu, gdyby szybkość reakcji w tym okresie była niezmienna.

Właściwością reakcji I rzędu jest to, że w jednakowych odstępach czasu reagują jednakowe wartości substratu. W reakcji I rzędu czas potrzebny do zmniejszenia stężenia substratu z 1 M do 0,5 M jest taki sam, jak do zmniejszenia stężenia z 0,01 M do 0,005 M.

Równanie kinetyczne reakcji I rzędu stosuje się najczęściej do reakcji, w której bierze udział tylko jedna substancja (reakcje jednocząsteczkowe). Zgodnie z tym równaniem przebiega również wiele reakcji dwucząsteczkowych, np. inwersja sacha­rozy, ponieważ stężenie wody można przyjąć za stałe, a więc mimo że 2 substraty wchodzą w reakcję, zmienia się stężenie tylko jednego z nich. Takie reakcje nazywane są pseudomonomolekularnymi.

Gdy stężenie obydwu substratów zmienia się w wyniku reakcji (A + B -> produk­ty), mamy równanie kinetyczne reakcji II rzędu. Badając wpływ zmiany początkowego stężenia na czas połowiczny można w prosty sposób odróżnić kinetykę reakcji I i II rzędu.

O reakcji trójcząsteczkowej mówi się, gdy biorą w niej udział 3 cząsteczki; szybkość takiej reakcji wyraża równanie kinetyczne III rzędu.

Z podanych przykładów wynika, że rzędem reakcji nazywa się sumę wykład­ników potęgowych, w jakich występują stężenia w równaniu kinetycznym (liczba atomów lub cząsteczek, których stężenie wpływa na charakter kinetyczny reakcji).

Mogą istnieć również reakcje zerowego rzędu, których szybkość nie zależy od stężenia substratu, a decyduje o niej jakiś inny czynnik, np. stężenie enzymu.

Szybkość początkowa reakcji jest niezależna od rzędu reakcji. Podaje ona przyrost produktów, jaki uzyskano by w dowolnym czasie, gdyby stężenie substratu nie ulegało zmianie i było równe stężeniu początkowemu. Reakcje enzymatyczne, w odróżnieniu od nieenzymatycznych, mogą w określonych warunkach przebiegać ze stałą szybkością niezależnie od zmian stężenia substratu. Szybkość mierzona w danym czasie jest równa szybkości początkowej.

Badanie rzędu reakcji i wyznaczanie stałej szybkości k na przy­kładzie hydrolizy sacharozy

Zasada: Sacharoza ulega hydrolizie w środowisku kwasowym i stopień jej hydrolizy mierzy się ilością cukrów redukujących pojawiających się w czasie trwania hydro­lizy. Oznaczać można albo ilość powstającego produktu, albo ubytek substratu w trakcie reakcji. Stężenie produktu lub substratu wyraża się w dowolnych jedno­stkach.

Odczynniki:

1. Około 0,2% roztwór sacharozy (świeżo przyrządzony).

2. 6 M roztwór HCl

3. 10% roztwór NaOH

4. 0,25% roztwór glukozy-fruktozy (jednakowe ilości glukozy i fruktozy).

5. 1% roztwór kwasu pikrynowego.

Wykonanie: Do 8 probówek wprowadzić po 3 ml 10% roztworu NaOH. Zmieszać 5 ml 0,2% roztworu sacharozy z 5 ml 6M roztworu HCl i natychmiast po wymiesza­niu przenieść 1 ml do pierwszej probówki z roztworem NaOH (czas t = 0). Do następnych probówek z 10% roztworem NaOH wprowadzić po 1 ml hydrolizatu po upływie 5, 10, 20, 30, 45, 60 i 90 min.Dodać po 2 ml roztworu kwasu pikrynowego, wymieszać zawartość probówek i wstawić je do wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Po oziębieniu uzupełnić wodą do 10 ml i oznaczyć wartości absorbancji przy λ= 530 nm, wobec próby kontrolnej (probówka pierwsza). Odczytać z krzywej kalibracyjnej ilości mg glukozy-fruktozy wyzwolonych po określonym czasie hydrolizy.

Hydroliza sacharozy jest reakcją I rzędu. Po zwiększeniu stężenia substratu osiąga się maksymalną szybkość reakcji, niezależ­ną od stężenia substratu. Wytłumaczenie tego jest następujące: gdy stężenie substratu jest małe, niektóre cząsteczki enzymu w danej chwili nie są połączone z substratem i niecałkowite wysycenie enzymu jest przyczyną tego, że nie wykazuje on maksymal­nej aktywności katalitycznej. W miarę zwiększania stężenia substratu dochodzi się do momentu, kiedy wszystkie cząsteczki enzymu będą z nim połączone, i wtedy dopiero enzym pracuje z maksymalną szybkością. Wobec tego, że enzym jest już całkowicie wysycony substratem, dalsze zwiększanie stężenia substratu nie może już wpłynąć na zwiększenie szybkości reakcji. Reakcja przebiega ze stałą szybkością.

Wyznaczanie stałej Michaelisa dla reakcji hydrolizy sacharozy

kata­lizowanej przez inwertazę

Szybkość reakcji zależy od stężenia kompleksu [ES] i szybkości jego rozkładu,

a stała równowagi rozważanego układu nazywa się stałą Michaelisa (K_m).

Jeśli stężenie substratu jest tak duże, że następuje zupełne wysycenie enzymu substratem, to szybkość reakcji enzymatycznej jest maksymalna. W takim stanie po zwięk­szeniu stężenia substratu szybkość się nie zmieni, natomiast zależy od stężenia enzymu. Stałą Michaelisa - K_m można wyrazić jako stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji stanowi połowę szybkości maksymalnej. Można ją wyznaczyć graficznie. Wartości stałej Michaelisa, oznaczonej dla wielu enzymów, wahają się w granicach od 10^-2 do 10^-8 M (przeważnie 10^-3 -10^-5). Charakteryzują one enzym w odniesieniu do danego substratu, określając liczbowo powinowactwo enzymu do substratu (małe wartości K_m wskazują na duże powinowactwo enzymu do substratu oraz dużą szybkość procesu i odwrotnie).

Pomiary stałej Michaelisa K_m dokonane z użyciem różnych substratów po­zwalają wnioskować o sposobie wiązania się enzymu z substratem. Zastosowanie różnych aktywatorów i inhibitorów umożliwia wyciąganie wniosków dotyczących budowy centrum katalitycznego enzymu oraz warunków powstawania kompleksów enzym-substrat. Znane jest wiele związków hamujących działanie różnych enzymów przez blokowanie określonych grup w białku. Na przykład formaldehyd blokuje grupy aminowe, cysteina i wersenian hamują działanie enzymów, których aktywność uwarunkowana jest obecnością w ich cząsteczce metali ciężkich, sole metali ciężkich blokują grupy -SH w cząsteczce białkowej. Dokonując zatem pomiarów K_m z użyciem różnych inhibitorów i aktywatorów, można wiele powiedzieć o charakterze grup czynnych enzymu lub grup aktywujących go.

Zasada:

(Stała Michaelisa określa liczbowo powinowactwo enzymu do substratu. Stała Michaelisa jest to takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej).

Hydrolizę sacharozy nazywa się inwersją i stąd nazwa enzymu - inwertaza. Inwertaza (sacharaza, β-fruktofuranozydaza, nazwa systematyczna: fruktohydrolaza β-D-fruktofuranozydu, E.C. 3.2.1.26)) należy do hydrolaz rozszcze­piających wiązania β-glikozydowe w sacharozie, hydrolizując ją do glukozy i fruk­tozy. Optymalne pH działania tego enzymu wynosi około 4,7; przy pH 10 jest on już zupełnie nieaktywny.

Miarą aktywności sacharazy jest ilość produktów hydrolizy tj. cukrów redukujących. Aktywność inwertazy można mierzyć oznaczając produkty metodą redukcyjną (np. z kwasem pikrynowym), ponieważ w miarę postępowania hydrolizy sacharozy wzrasta ich stężenie. Pozwala to wyznaczyć szybkości początkowe reakcji przy różnych stężeniach substratu (sacharozy) i wyznaczyć stałą Michaelisa.

Materiał: Drożdże.

Odczynniki: 1 M bufor octanowy o pH 4,7

Aceton

8% roztwór sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7

10% roztwór NaOH.

0,5% roztwór kwasu pikrynowego.

Roztwór wzorcowy glukozy-fruktozy o stężeniu 0,5 mg/ml (50 mg%)

1. Otrzymanie preparatu inwertazy z drożdży.

Drożdże są bogatym źródłem tego enzymu. Izolowanie inwertazy rozpoczyna się od rozbicia komórek przez ucieranie drożdży z piaskiem i ekstrakcji białek wodą. Wytrącanie enzymu przeprowadza się acetonem w niskiej temperaturze (dla ochrony przed denaturacją).

1,0 g drożdży rozetrzeć w moździerzu z piaskiem, dodać ok. 10 ml H₂O i dalej do­kładnie przez kilka minut rozcierać. Preparat odwirować lub przesączyć. Supernatant /ok. 2 ml/ wlać do 5-krotnej objętości acetonu, oziębionego do 4-8°C .Wytrąca się biały osad sacharazy. Preparat odwirować lub przesączyć. Wytrącony osad rozpuścić w 5 ml wody i ponownie przesączyć. Przesącz zawierający badany enzym można przechowywać w lodówce przez kilka tygodni.

Sprawdzenie aktywności otrzymanej sacharozy. Miarą aktywności jest ilość powstałej podczas hydrolizy sacharozy (dwucukier nieredukujący) cukrów redukujących tj. glukozy i fruktozy.

Wykonanie:

Do 2 probówek dodać po 1 ml roztworu uzyskanego enzymu. Jedną z prób zagotować (inaktywacja enzymu). Do obu probówek dodać po 1 ml roztworu 8% sacharozy. Umieścić w łaźni wodnej w temp. 37^ºC na 10 min. Zawartość produktów reakcji wykazać, dodając do każdej po 1 ml odczynnika Benedicta. Po zagotowaniu w próbie dodatniej pojawia się osad tlenku miedziawego, co świadczy o obecności cukrów redukujących. Sacharoza, w próbie z inaktywowanym enzymem, nie redukuje odczynnika Benedicta.

2. Wyznaczanie optymalnego stężenia preparatu enzymatycznego.

Ilościowe oznaczanie redukujących produktów powstałych w wyniku hydrolizy sacharozy.

Zasada: Kwas pikrynowy w środowisku alkalicznym (NaOH) w wyniku działania cukrów redukujących (glukozy i fruktozy) ulega redukcji i po ogrzaniu daje czerwono zabarwiony pikraminian sodu, którego stężenie po oziębieniu można oznaczyć kolorymetrycznie mierząc wartości absorbancji przy λ = 530 nm.

Wykonanie:

Przygotować 12 opisanych probówek, do każdej wlać po 1 ml 10% NaOH. W probówce zmieszać 2 ml enzymu 10x rozcieńczonego z 2 ml 8% sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7. Natychmiast po wymieszaniu pobrać 0,5 ml mieszaniny inkubacyjnej do probówki nr 1₀ /kontrolna/, a następnie (umieścić mieszaninę w łaźni wodnej o 25.0⁰C lub pozostawić w temp. pokojowej) i po 5, 15 i 30 min pobierać po 0,5 ml mieszaniny do kolejnych probówek z NaOH. Dodać do wszystkich prób po 1 ml roztworu 0,5% kwasu pikrynowego i po wymieszaniu wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Po oziębieniu oznaczyć wartości absorbancji A przy λ = 530 nm wobec próby 0. Wartość A dla próby po 30 min inkubacji powinna wynosić ok. 1,5. W razie potrzeby należy zmienić rozcieńczenie roztworu enzymu i podobnie wykonać próbę z roztworem enzymu rozcieńczonym 20x i 40x.

Czas inkubacji	Nr	Wartość A dla preparatu enzymu rozcieńczonego 10 x	Nr	Wartość A dla preparatu enzymu rozcieńczonego 20 x	Nr	Wartość A dla preparatu enzymu rozcieńczonego 40 x
0	10	-	20	-	30	-
5 min	15	0,065	25	0,046	35	0,056
15 min	115	0,364	215	0,248	315	0,135
30 min	130	0,749	230	0,464	330	0,297

Krzywa zależności A (absorbancji) od stężenia enzymu

przy różnych czasach inkubacji

A
	0,8
	0,7
	0,6
	0,5
	0,4
	0,3
	0,2
	0.1

0 0,5 1,5 3.0 mg/ml glukoza-fruktoza

3. Wykreślanie krzywej kalibracyjnej.

Pobrać 0,0 (próba kontrolna); 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1 ml roztworu wzorcowego glukozy-fruktozy o stężeniu 0,5 mg/ml, uzupełnić wodą do 1 ml, dodać 2 ml 10% NaOH, 2 ml roztworu kwasu pikrynowego i po wymieszaniu wstawić na 5 min do wrzącej łaźni wodnej. Po oziębieniu oznaczyć wartości absorbancji (A) przy λ = 530 nm wobec próby kontrolnej i wykreślić krzywą zależności A od ilości mg glukozy-fruktozy.

Numer próby	roztwór wzorcowy (5mg/ml) ml	woda ml	10% NaOH ml	0,5% kw. pikrynowy ml	Wartość A λ = 530 nm
1	0,0	1,0	2	2
2	0,2 (0,1 mg)	0,8	2	2	0,125
3	0,4 (0,2 mg)	0,6	2	2	0,249
4	0,6 (0,3 mg)	0,4	2	2	0,387
5	0,8 (0,4 mg)	0,2	2	2	0,513
6	1,0 (0,5 mg)	0	2	2	0,645

Krzywa zależności A (absorbancji) od stężenia glukozy-fruktozy

1,2
1,1
1,0
	0,9
	0,8
	0,7
	0,6
	0,5
	0,4
	0,3
	0,2
	0.1

A

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 mg/ml (glukoza-fruktoza)

4. Wyznaczanie szybkości początkowych przy różnych stężeniach substratu

Wykonanie: Przygotować 20 probówek z 1 ml 10% NaOH oznaczonych następująco:

1₀, 2₀, 3₀, 4₀ : 1₅, 2₅, 3₅, 4₅ : 1₁₀, 2₁₀, 3₁₀, 4₁₀ : 1₁₅, 2₁₅, 3₁₅, 4₁₅ : 1₂₀, 2₂₀, 3₂₀, 4_20.

Przygo­tować 4 probówki. Do pierwszej wlać 3 ml 8% roztworu sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7, do drugiej 3 ml sacharozy i 3 ml buforu, a do 2 następnych po 3 ml buforu octanowego o pH 4,7. Z probówki drugiej przenieść 3 ml roztworu do trzeciej, a z tej po wymieszaniu do czwartej, z której 3 ml po wymieszaniu należy wylać. Uzyskuje się w ten sposób stężenia: 8%; 4%; 2,0% i 1,0% sacharozy.

Do wszystkich prób dodać po 3 ml rozcieńczonego enzymu (Optymalne stężenie. Temp.pokojowa.) i natychmiast po wymieszaniu (t = 0) pobrać z każdej probów­ki po 0,5 ml mieszaniny inkubacyjnej do 1 ml 10% NaOH w celu zatrzymania reakcji hydrolizy. Następnie próbki (0,5 ml) pobrać po upływie 5, 10, 15 i 30 min, wprowadza­jąc je do uprzednio przygotowanych probówek z 1 ml 10% roztworu NaOH. Do wszystkich prób dodać po 1 ml 0,5% roztwór kwasu pikrynowego i wstawić na 5 minut do wrzącej łaźni wodnej. Po oziębieniu oznaczyć wartości absorbancji (A) przy λ = 530 nm wobec próby kontrolnej. Po odczytaniu z krzywej ilości mg glukozy i fruktozy sporządzić wykres dla każdego stężenia sacharozy, odkładając na osi rzędnych ilość mg produktu, a na osi odciętych czas w minutach. Tę ilość mg można (niekoniecznie) przeliczyć np. na 1 ml rozcieńczonego enzymu, na 6 ml mieszaniny inkubacyjnej, na 1 ml roztworu enzymu nierozcieńczonego itp.

Nr próby	Stężenie sacharozy	Absorbancja/
				Ilość mg produktu (cukru inwertowanego)
		Czas inkubacji t = 0 min/odc		Czas inkubacji t = 5 min		Czas inkubacji t = 10 min		Czas inkubacji t = 15 min		Czas inkubacji t = 20 min		Czas inkubacji t = 25 min
1	8%	10	1.118	15	0.228 0,18	110	0.610 0,47	115	0.782 0,62	120	1.029 0,79	125	1.322 1,02
2	4%	20	0,984	25	0.217 0,17	210	0.429 0,33	215	0.613 0,47	220	0.878 0,68	225	1.145 0,88
3	2%	30	0.761	35	0.174 0,14	310	0.392 0,30	315	0.588 0,45	320	0.790 0,61	325	0.991 0,76
4	1%	40	0.668	45	0.124 0,10	410	0.285 0,22	415	0.437 0,37	420	0.595 0,46	425	0.705 0,54
5	0,5%	40	0.612	45	0.000	410	0.081 0,06	415	0.208 0,16	420	0.339 0,26	425	0.432 0,33

Graficzne przedstawienie wyznaczania szybkości reakcji

Dla każdego z użytych stężeń sacharozy wykreślić krzywą wyrażającą zależność ilości produktu reakcji od czasu inkubacji i obliczyć szybkości początkowe reakcji w mg cukru inwertowanego na minutę. Miarą tej szybkości w czasie t jest tg kąta α utworzonego między styczną do krzywej w punkcie zero a osią odciętych. Na każdym wykresie przeprowadzić styczną do krzywej w punkcie odpowiada­jącym stężeniu produktu w czasie t = 0 i wyznaczyć szybkość początkową reakcji równą tgα₀. Przeprowadzając styczne do krzywej w punkcie odpowiadającym stężeniu produktu w czasie t równym 5, 10, 15 czy 20 min, można wyznaczyć szybkość reakcji po 5, 10, 15 czy 20 min, której miarą będzie wartość tgα dla odpowiedniego czasu. Wartości tgα nie można obliczać z tablic na podstawie wartości kąta w stopniach, ponieważ wartości nanoszone na osi rzędnych i odciętych nie są tej samej wielkości. Oblicza się go ze stosunku wielkości przyprostokątnej przeciwległej, podanej w wartościach odkładanych na osi rzędnych (w mg glukozy), do przyprostokątnej przyległej do danego kąta, podanej w wartoś­ciach odkładanych na osi odciętych (czas w min).

Ilości mg glukozy i fruktozy wyzwolone przy różnych stężeniach substratu

(8%; 4%; 2,0% i 1,0% sacharozy) zależnie od czasu

A
	1,1
	0,9
	0,7
	0,5
	0,3
	0,1

5 10 15 20 25 min. inkubacji mg glukozy/fruktozy

Z szybkości początkowych v₀, wyliczonych dla każdego stężenia substratu, wykreślić zależność tych szybkości od stężenia substratu (krzywa Michaelisa-Menten,) tzn. odkładając na osi rzędnych szybkości początkowe V , a na osi odciętych końcowe stężenia substratu w inkubowanych próbach. Oznaczyć na wykresie V max. Odczytać odpowiadające tej szybkości stężenia sacharozy (przeliczyć stężenia procentowe na molowe tj. 3,6g% = 0,1 mol/l) i wyznaczyć stałą Michaelisa tj. takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej.

Szybkość początkowa V tgα = y/x dla stężenia sacharozy 8% 0,22 mol/l	Szybkość początkowa V tgα = y/x dla stężenia sacharozy 4% 0,11 mol/l	Szybkość początkowa V tgα = y/x dla stężenia sacharozy 2% 0,055 mol/l	Szybkość początkowa V tgα = y/x dla stężenia sacharozy 1% 0,0275 mol/l	Szybkość początkowa V tgα = y/x dla stężenia sacharozy 1% 0,014 mol/l
0,042	0,034	0,030	0,021	0,011

Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Menten

Szybkość reakcji

V

0,05
	0,04
	0,03
	0,02
	0,01

0,025 0,050 0,100 0,22 stężenie sacharozy (mol/l)

K_{m 0,03}

Stała Michaelisa K_m ma wartość 0,033 M = 3,3 • 10-² M, a szybkość maksymal­na wynosi 0,27 mg glukozy-fruktozy na minutę.

Wyznaczanie energii aktywacji hydrolizy sacharozy

Energię aktywacji można mierzyć na podstawie różnicy prędkości reakcji w różnych temperaturach. Zależność między prędkością reakcji i temperaturą określa równanie Arrheniusa.

Przy nadmiarze substratu szybkość maksymalna reakcji nie zależy od stężenia substratu, jest natomiast proporcjonalna do stężenia enzymu i stałej szybkości reakcji.

Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych

Oprócz stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycz­nych wpływają jeszcze:

stężenie enzymu, temperatura, pH środowiska, obecność aktywatorów i inhibitorów.

Wpływ stężenia inwertazy na szybkość hydrolizy sacharozy .

Zależność szybkości reakcji od stężenia enzymu najdogodniej jest obserwować przy dużych stężeniach substratu, kiedy szybkość ta nie zależy już od stężenia substratu (reakcja zerowego rzędu) i jest proporcjonalna do stężenia enzymu (przy niezbyt dużych stężeniach enzymu).

Zasada: Badanie szybkości hydrolizy sacharozy zależnie od stężenia enzymu wyko­nuje się przy ustalonym stężeniu substratu (dostatecznie dużym), stałym optymal­nym pH, stałej temperaturze i stałych innych parametrach. Po wyznaczeniu szybko­ści początkowych (v₀) dla każdego stężenia enzymu wykreśla się zależność tych szybkości od stężenia enzymu; wykres powinien być linią prostą.

Wykonanie: Do pierwszej z 4 probówek wprowadzić 6 ml roztworu enzymu, a do następnych — po 3 ml H₂0. Z probówki pierwszej przenieść 3 ml do drugiej, z tej po wymieszaniu przenieść 3 ml do trzeciej itd. (z ostatniej po wymieszaniu 3 ml wylać). Uzyskuje się w ten sposób rozcieńczone roztwory enzymu (1, ¹/₂, V₄, ¹/₈), do których dodaje się po 3 ml 0,2 M roztworu sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7. Następnie należy wykonać wyznaczenie szybkości początkowych dla każdego stężenia enzymu. Sporządzić wykres zależności szybkości v₀ od stężenia enzymu.

Wpływ temperatury i energia aktywacji.

Ze wzrostem temperatury zwiększa się szybkość reakcji en­zymatycznej (jak każdej reakcji chemicznej). Po osiągnięciu pewnego optimum w danych warunkach szybkość reakcji zaczyna maleć w następstwie denaturacji cieplnej enzymu. Szybkość inaktywacji enzymów w roztworze wzrasta gwałtownie w miarę podwyższania temperatury. Większość enzymów traci nieodwracalnie aktywność po przekroczeniu temp. 65°C i tylko nieliczne wytrzymują krótkie gotowanie (rybonukleaza czy pepsyna w pH 1). Szybkość inaktywacji cieplnej enzymów przeważnie zależy od pH roztworów. Wyższą temperaturę bez utraty aktywności wytrzymują enzymy suche i dlatego przechowywanie enzymów zliofilizowanych może zapobiegać zbyt szybkiej ich inaktywacji. Jeśli działanie enzymów (w roztworze) jest ograniczone do kilku sekund, temperatura może być wysoka, ale do działania enzymu przez kilka dni musi być ona znacznie niższa (enzym musi być długo czynny). Optymalne temperatury są więc zależne od czasu inkubacji i od pH, a ponadto od stężenia soli, obecności aktywatorów czy inhibitorów (np. w postaci śladowych zanieczyszczeń odczyn­ników jonami metali). W zakresie temperatur, w których denaturacja enzymu jest praktycznie nieistotna, a więc do ok. 37°C, podniesienie temperatury o 10°C zwiększa szybkość reakcji mniej więcej 2x. Na podstawie teorii kinetyczno-cząsteczkowej wiadomo, że reakcja chemiczna może zajść wówczas, gdy cząsteczki są efektywne i prowadzą do powstania produktu reakcji. Do reakcji dochodzi wtedy, gdy cząsteczka ma energię kinetycz­ną większą od pewnej określonej wartości (cząsteczki aktywne). Dopiero po osiągnięciu energii aktywacji (różnej dla różnych reakcji) cząsteczki stają się zdolne do reagowania.

Energia aktywacji jest więc graniczną, najmniejszą ilością energii, jaką musi mieć cząsteczka, aby zderzenie było skuteczne (np. do rozluź­niania wiązań w reagujących cząsteczkach, pokonania sił odpychania w pierwszym etapie reakcji). W zwykłych warunkach liczba cząsteczek zaktywowanych jest niezmiernie mała i reakcje przebiegają niezwykle wolno, ponieważ musi być przekroczony pewien próg energetyczny. Aby go przekroczyć, trzeba albo dostarczyć energię aktywacji, albo ją obniżyć. Można dostarczyć układowi energii w postaci ciepła, światła (promieniowania) lub energii elektrycznej. Wraz ze wzrostem temperatury wzrasta szybkość reakcji chemicznej, ponieważ podwyższenie temperatury zwiększa energię kinetyczną cząsteczek, a tym samym liczbę cząsteczek zaktywowanych. O wiele szybciej przebiegają reakcje w obecności katalizatorów. Reagujące cząsteczki mogą wchodzić z katalizatorem w nietrwałe połączenia, przy czym bariera energetyczna tej ubocznej reakcji jest dużo niższa niż reakcji głównej. Następuje tutaj jak gdyby obejście wysokiej bariery energetycznej reakcji głównej przez drogę o barierze niższej. Nawet niewielkie obniżenie energii aktywacji prowadzi do znacznego wzrostu szybkości reakcji; zro­zumiałe więc staje się ogromne przyspieszenie szybkości reakcji w obecności katalizatorów. Na przykład energia aktywacji procesu rozkładu H₂O₂ na tlen i wodę wynosi ok. 75 kJ/mol. Dodanie nieorganicznego katalizatora (czerń platynowa) obniża tę energię do 49 kJ/mol, a w organizmie w obecności katalazy energia wynosi tylko 23 kJ/mol. W wyniku takiego obniżenia energii aktywacji szybkość reakcji wzrasta w obecności czerni platynowej 20000 razy, a w obecności katalazy — aż 3 -10¹¹ razy.

Wpływ pH. Szybkość reakcji katalizowanej przez enzym jest maksymalna przy określonej wartości pH, a maleje w miarę oddalania się od niej (zbyt kwasowe lub zasadowe środowisko może powodować denaturację białka). Zmiany aktywności enzymatycznej przy różnym pH są wywoływane zmianami w stopniu zjonizowania składników układu: enzymu, substratu i kompleksu enzym-substrat. Optymalne pH do działania niektórych enzymów zależy z tego powodu i od rodzaju substratu. Grupy czynne centrum aktywnego enzymu tylko w jednej z jonowych form wykazują właściwości katalityczne; podobnie w większości wypadków tylko jedna z możliwych form grup jonizujących substratu jest rzeczywiście aktywna w reakcji enzymatycznej. W tworzeniu kompleksu enzym-substrat duże znaczenie ma ładunek substratu i enzymu, ponieważ siły wiążące te dwa związki mogą mieć charakter elektro­statyczny.

Zależność od pH szybkości hydrolizy sacharozy przez inwertazę.

Zasada: Inwertaza jest aktywna w szerokim kwasowym zakresie pH. Optymalne pH ma wartość 4-6, natomiast przy pH 2 i 9 już jest praktycznie nieaktywna.

Odczynniki: Bufory uniwersalne o pH 3, 5, 7 i 9 i 0,3 M roztwór sacharozy

Wykonanie: Do 5 probówek wprowadzić po 3 ml buforów o pH 3, 5, 7 i 9 i dodać do każdej probówki po 3 ml 0,3 M roztworu sacharozy i enzymu o optymalnym stężeniu ustalonym w ćwiczeniu. Wyznaczyć szybkości początkowe dla po­szczególnych wartości pH i nanieść je na wspólny wykres, odkładając na osi x szybkości początkowe, a na osi y odpowiadające im wartości pH.

Wpływ aktywatorów. Różnego rodzaju aktywatory nie biorące udziału w reakcji katalitycznej uczynniają enzymy lub zwiększają ich aktywność. Można je ująć w 3 grupy: 1) jony niektórych metali, wbudowanych w cząsteczkę apoenzymu, 2) związki wielkocząsteczkowe o charakterze białkowym działające przez odmaskowanie grup czynnych enzymu oraz 3) małocząsteczkowe związki organiczne usuwające wpływ substancji hamujących.

Liczne pierwiastki śladowe są niezbędnymi składnikami pokarmowymi dla organizmu, ponieważ pełnią rolę swoistych aktywatorów poszczególnych enzymów. Są one najczęściej czynnikami układu aktywują­cego, tzn. białko enzymatyczne jest niezdolne do aktywacji substratu, jeżeli brakuje odpowiedniego jonu metalu. Usunięcie go przez dializę powoduje odwracalną utratę aktywności, a ponowne dodanie przywraca aktywność. Dla niektórych enzymów metale są niezbędne do wytworzenia wiązania między enzymem a substratem lub między enzymem, koenzymem i substratem. W innych enzymach metal stanowi istotną część składową centrum katalitycznego enzymu, który bez metalu jest nieczynny. Jest to typowa funkcja metalu jako koenzymu, np. w enzymach przenoszących elektrony. Enzymy są aktywowane najczęściej przez następujące jony: Mg²⁺ (fosfatazy, fosforylazy, fosfokinazy, syntetazy), Zn²⁺ (anhydraza węglanowa, dehydrogenaza mleczanowa i alkoholowa oraz proteazy),Mn²⁺ (peptydazy, arginaza), Ca²⁺ (lipaza), Cu²⁺ (oksydazy) oraz niekiedy Fe^{2 +} , Fe^{3 +} , Co²⁺, Ni²⁺, Na ⁺ , K ⁺ . Kationy metali ciężkich mają na ogół działanie hamujące. Aniony mają mały wpływ na aktywność enzymów. Wyjątkiem jest amylaza aktywowana przez chlorki.

Enzymy niekiedy są wydzielane w postaci nie wykazującej czynności katalitycz­nej, czyli w postaci prekursorów (proenzymów). Na przykład trypsynogen przeob­raża się w czynną postać — trypsynę pod wpływem aktywatora — proteolitycznego enzymu enteropeptydazy (enterokinazy).

Aktywność wielu enzymów łatwo ulega zahamowaniu pod wpływem łagodnych środków utleniających, np. tlenu atmosferycznego, co jest katalizowane przez metale ciężkie znajdujące się w śladowych ilościach bądź w samym materiale czy odczyn­nikach, bądź też pochodzące z metalowych przyrządów stosowanych w preparatyce enzymów. Zahamowanie takie jest często procesem odwracalnym i aktywność powraca wskutek dodania ciał redukujących lub wiążących kompleksowo metale ciężkie. Na przykład utlenienie grup —SH enzymu bardzo często prowadzi do utraty aktywności; odtwarza ją dodatek cysteiny, zredukowanego glutationu czy merkaptoetanolu wskutek redukcji ugrupowania —S—S— do —SH. Przykładem aktywacji przez usunięcie wpływu inhibitora jest również reaktywacja oksydazy cytochromowej zatrutej tlenkiem węgla. Powstały kompleks enzym-tlenek węgla rozpada się z łatwością na świetle słonecznym, co przywraca aktywność enzymu.

Należy podkreślić, że aktywacja enzymu przez aktywator jest procesem zupełnie różnym od aktywacji substratu przez czynny enzym, która polega na jego połącze­niu z centrum katalitycznym tego enzymu.

Wpływ inhibitorów. Inhibitory są substancjami zmniejszającymi szybkość reakcji enzymatycznej. Zahamowanie aktywności enzymatycznej jest jednym ze sposo­bów regulacji różnych procesów w żywej komórce. Inhibitory enzymów należą do narkotyków, antybiotyków, środków konserwujących, różnego rodzaju trucizn i toksyn.

Aktywność enzymatyczną nieodwracalnie hamują związki chemiczne powodujące denaturację cząsteczki białkowej (również czynniki fizyczne), utlenianie grup —SH lub ich alkilowanie (jodooctan, specyficzny inhibitor dehydrogenazy alkoholowej), tworzenie merkaptydów itp. W inhibicji nieodwracalnej inhibitor łączy się kowalencyjnie z enzymem lub wiąże się z nim tak silnie, że jego dysocjacja jest bardzo powolna.

Przykład — bardzo silna trucizna, paraliżująca układ nerwowy, diizopropylofluorofosforan (DIFP — diizopropyl fluorophosphate), który nieodwracalnie wiąże się z seryną w miejscu aktywnym acetylo-cholinoesterazy (i innych enzymów hydrolitycznych), tworząc nieaktywną katalitycznie pochodną. Także czynniki alkilujące, jak np. amid kwasu jodooctowego, nieodwracalnie hamują aktywność katalityczną enzymów, modyfikując głównie reszty cysteiny.

Wiele enzymów jest wrażliwych na małe stężenie soli metali ciężkich (<10~³ M), co tłumaczy się katalitycznym wpływem metalu na utlenianie, np. grup —SH tlenem atmosferycznym, i jest częstą przyczyną utraty aktywności enzymów w procesach oczyszczania. Wskazane jest więc stosowanie w preparatyce środków kompleksujących metale (wersenian, 8-hydroksychinolina). Działanie tych in­hibitorów cechuje odwracalność. Daje się ono znieść przez nadmiar środków tiolowych, takich jak cysteina czy 2,3-dimerkaptopropanol.

9

---