A quien corresponda:

Pongo a consideración del jurado del “Encuentro de Investigación 2007” la siguiente investigación promovida y asesorada por la Dra. Lourdes Ma. Barrera Ramírez, profesora titular de la materia de Biología V en el Colegio Green Hills e Investigador en Ciencias Médicas del Sistema Nacional de Salud en el Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.

La realización de esta investigación fue posible gracias al apoyo del laboratorio de Inmunoquímica ubicado en el INER y a la infraestructura académica del Colegio Green Hills. Cabe destacar la participación activa y constante de los alumnos, Fernanda Sofía García Miranda, Julio Eduardo Peters Vázquez, Bertha Patricia Díaz Sanginés, Jesús Guillermo Lagunas Garza y Mayte Lara Ruiz, quienes en todo momento dieron seguimiento puntual a la realización de la investigación. La vinculación de ambas Instituciones permitió el enriquecimiento académico del programa de Biología V durante el curso escolar 2006-2007.

La motivación para la creatividad en la ciencia que promueve este Encuentro de Investigación forma ya parte fundamental de las actividades complementarias en nuestra Institución.

Sin más por el momento, quedo de usted

Lic. José Arnulfo López Rincón

Director Técnico Preparatoria

Colegio Green Hills

Mecanismos efectores de células T CD8 citotóxicas en la defensa inmune

Fernanda Sofía García Miranda, Julio Eduardo Peters Vázquez, Bertha Patricia Díaz Sanginés, Jesús Guillermo Lagunas Garza, Mayte Lara Ruiz

Colegio Green Hills

Resumen

El sistema inmune protege al organismo de una amplia variedad de agentes infecciosos que ocasionan diferentes enfermedades. Las principales células que participan en las respuestas inmunitarias son los leucocitos siendo los principales los linfocitos y fagocitos. El sistema de reconocimiento de infecciones es mediado por los linfocitos TCD8+ ó citotóxicos. Una vez activado, se generan mecanismos efectores encaminados a la destrucción de la célula infectada. El principal mecanismo efector de los linfocitos TCD8+ es la citotoxicidad donde mediante exocitosis se liberan sustancias como perforina. Los defectos funcionales en las vías citotóxicas involucran la desregulación de la homeostasis o la inducción de enfermedades autoinmunes. Los métodos tradicionales para la detección de la capacidad efectora de los linfocitos citotóxicos son poco sensibles o indirectos. Recientemente se desarrolló un método por citometría de flujo que permite la caracterización funcional de estas células mediante la expresión superficial del marcador CD107a/b y la disminución intracelular de perforina. La Neumonitis por Hipersensibilidad es una enfermedad pulmonar intersticial producto de la exposición repetida a antígenos aviarios. Las etapas crónicas son irreversibles y frecuentemente mortales. Se han detectado alteraciones en etapas crónicas de la NH en la proporción normal de los linfocitos TCD8+, lo que hace indispensable estudiar dicha subpoblación celular desde el punto de vista funcional. Este estudio implemento el método descrito recientemente para describir la función efectora de estas células. Los resultados demostraron alteraciones funcionales de los linfocitos TCD8 en pacientes crónicos, lo cual puede estar relacionado directamente con el avance de la enfermedad.

Mecanismos efectores de células T CD8 citotóxicas en la defensa inmune

Introducción

Sistema inmune

El término inmunidad proviene del término latino immunitas, atis que significa privilegio de exención o `estar libre' y que hace referencia a la capacidad que poseen los seres vivos de no sufrir continuamente las enfermedades que ocasionan la agresión de los microorganismos (Janeway CJ, 1997). El sistema inmune (SI) protege al organismo de una amplia variedad de agentes infecciosos (bacterias, hongos, parásitos y virus) que pueden ocasionar en el organismo que los recibe diferentes enfermedades. Para ello es capaz de reconocer a los componentes del agente patógeno e iniciar una serie de respuestas encaminadas a eliminarlo cuyas características fundamentales son la especificidad y la memoria (Janeway CJ, 1997). Desde una concepción clásica se ha hablado de inmunidad humoral cuando la respuesta inmunitaria está mediada por anticuerpos y de inmunidad celular cuando está mediada por células. Ambos tipos de respuesta pueden tener la característica de ser específicas a un determinado patógeno o por el contrario producirse de un modo general e inespecífico; mientras que los anticuerpos son los efectores específicos de la inmunidad humoral, el complemento y algunos interferones lo son inespecíficos; mientras que los linfocitos T citotóxicos son los efectores específicos de la inmunidad celular, la fagocitosis, las células asesinas naturales, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos y los mediadores solubles son efectores inespecíficos de la inmunidad celular (Barry M, 2002 ).

Las principales células que participan en las respuestas inmunitarias son los leucocitos, los glóbulos blancos de la sangre, de los que se distinguen varios tipos siendo los principales los linfocitos y los fagocitos que, mediante su presencia y la secreción de diferentes sustancias solubles que son capaces de producir, median en la respuesta del SI ante una agresión.

Se entiende como antígeno (Ag) cualquier molécula que puede ser reconocida específicamente por cualquiera de los componentes del SI; en un sentido más estricto se entiende como Ag cualquier molécula capaz de inducir la producción de anticuerpos específicos ( Goldsby R, 2002).

Los anticuerpos (Ac), también conocidos como inmunoglobulinas, son un grupo de moléculas séricas que producen los linfocitos B. Los diferentes tipos de Ac tienen una estructura básica común a todos ellos, pero el sitio por el que se unen al Ag es específico de cada uno. La zona de la molécula del Ag a la que se une el Ac se denomina epítopo y una molécula de Ag puede tener varios de ellos por lo que los Ac en realidad son específicos de un epítopo y no de la molécula completa de Ag (Goldsby R, 2002).

El sistema inmunitario dispone de diferentes mecanismos de defensa que se denominan genéricamente sistemas efectores; ejemplo de ellos son la neutralización, la fagocitosis, reacciones citotóxicas o la apoptosis celular (muerte celular programada).

Todas las células del SI tienen su origen en células madres pluripotenciales de la médula ósea que originan fundamentalmente dos tipos de diferenciación, la linfoide, que da lugar a los linfocitos, y la mielode, que da origen a los fagocitos. Existen por lo tanto en el SI dos grandes tipos de células que intervienen en los procesos de inmunidad.
Los fagocitos, que son capaces de ingerir y degradar antígenos y microorganismos.
Dentro de ellos encontramos los fagocitos mononucleares y los neutrófilos polimorfonucleares. El representante de este tipo celular lo constituye el monocito de sangre periférica que es capaz de emigrar a los tejidos transformándose en los macrófago tisular (sistema monocito-macrófago).

La otra clase de células la constituyen los linfocitos B y T según donde se desarrollan; en los humanos, las células B se diferencian en la médula ósea y en el hígado fetal y las células T en el timo. En estos órganos en los que se diferencian los linfocitos, órganos linfoides primarios, las células B y T adquieren la capacidad para reconocer Ags por medio de la adquisición de receptores de superficie específicos. Existe una tercera clase de linfocitos que no expresan receptores de Ags y que se denominan células asesinas naturales (NK, natural killer).

Además existen otras células, como las células presentadoras de antígeno (CPA) a las células T, mastocitos, células endoteliales, etc. que también intervienen en las respuestas inmunitarias y que no pertenecen a ninguno de estos grupos.

Se calcula que en el organismo humano existen del orden de 10¹² células linfoides y que aproximadamente 10⁹ linfocitos se producen diariamente; la mitad de ellos se renuevan en poco más de un día, sin embargo otros persisten durante años e incluso algunos, probablemente, de por vida (Sher A, 1992).

Los linfocitos T tienen diversas funciones. Algunos interactúan con las células B y los fagocitos mononucleares y se denominan células T colaboradoras (células Th, de helper); otras destruyen células infectadas por agentes intracelulares y se denominan células T citotóxicas (Tc). La mayoría (más del 90%) de las células T son células Th.

La expresión de una gran cantidad de moléculas de superficie diferentes ha permitido, mediante el empleo de anticuerpos monoclonales específicos, reconocer diferentes poblaciones. Uno de los sistemas desarrollado y empleado en la actualidad es el de `denominación de grupo' o CD (cluster designation) que permite la agrupación de Ac monoclonales de características similares, aunque puede presentar el inconveniente de que un mismo marcador lo puedan tener líneas celulares diversas o la misma línea en fases funcionales diferentes (Altman JD, 1996).

El marcador más utilizado de las líneas celulares T es el denominado receptor de células T (TCR) y se agrupan a su vez en dos subpoblaciones diferentes, las que poseen el marcador CD4 que actúan como colaboradoras e inductoras de la respuesta inmune (Th, T helper) y las que poseen el marcador CD8 que tienen una función principalmente citotóxica (Tc, T cytotoxic). Según expresen o no el marcador se suelen referir con los símbolos + o - a continuación del número de CD asignado (CD4 + o CD4-).

Las células T CD4+ reconocen Ags específicos asociados con moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, major histocompatibility complex) clase II mientras que las células T CD8+ reconocen Ags asociados a moléculas MHC de clase I en células presentadoras de antígeno. Solo una pequeña fracción de las células T circulantes son CD8+.

Las células T CD8+, o citotóxicas, también ese han dividido en diferentes subpoblaciones funcionales que expresan diferentes moléculas CD.

Los linfocitos T CD8+ en la respuesta inmune celular

Los conocimientos generados en el campo de la función y la actividad de los linfocitos T CD8+ han sido fundamentales para determinar los mecanismos inmunes celulares que actúan en el control de procesos infecciosos y tumorales.

La inmunidad posee un sistema de reconocimiento específico de antígenos producidos dentro de la célula hospedera como el caso de las infecciones virales, algunas infecciones bacterianas y parasitarias y también en antígenos producto del cambio neoplásico de las células (Kägi D, 1996). Dicho sistema de reconocimiento es mediado por los linfocitos TCD8+. Una vez activado, se generan en el linfocito TCD8+ una serie de mecanismos efectores encaminados a la destrucción de la célula infectada o tumoral. El principal mecanismo efector de los linfocitos TCD8+ es la citotoxicidad donde mediante exocitosis se liberan sustancias almacenadas gránulos pre-formados. Estos gránulos contienen proteínas como la perforina y las granzimas o fragmentinas (Kägi D, 1994). La perforina, se polimeriza en la membrana biológica de la célula blanco generando poros que permiten el paso de agua y electrolitos, induciendo lisis osmótica. Las granzimas son proteínas pertenecientes a la familia de proteasas de serina. Estas enzimas, que entran a la célula a través de los poros formados en la membrana por la perforina, tienen la capacidad de inducir la muerte celular mediante la fragmentación del ADN de las células blanco, probablemente induciendo el mecanismo de la apoptosis o muerte celular programada (Peters PJ, 1991). Existen otros mecanismos efectores de las células T CD8+ como la interacción de una molécula denominada Fas (CD95) y su ligando del Fas (FasL). Esta última molécula se expresa en la superficie de los linfocitos TCD8+. La interacción Fas/FasL induce en la célula blanco la muerte celular programada mediante la apoptosis (Lichtenheld MG, 1988). Finalmente éstas células activadas producen de forma específica citocinas como IFN-γ (interferón-γ) y el FNT-  (factor de necrosis tumoral ) (Sher A, 1992).

Clínica y experimentalmente, el papel fundamental de este tipo de linfocitos involucra tanto la prevención como la atenuación de enfermedades debido a su capacidad para eliminar a una o varias células sospechosas de estar infectadas en un proceso conocido como vigilancia inmunológica, así como la eliminación de células que ya hayan sido infectadas con patógenos intracelulares durante una enfermedad establecida o la diseminación de una infección (Kägi D, 1994). Las disfunciones del SI se pueden entender en una triple vertiente, respuesta inmunitaria exagerada (hipersensibilidad), respuesta inmunitaria ineficaz (inmunodeficiencia) y reacción inadecuada frente a autoantigenos (enfermedad autoinmune).

Los defectos congénitos o funcionales en las vías citotóxicas de las células T CD8+ involucra la desregulación de la homeostasis linfoide (particularmente la proliferación de linfocitos, lo cual afecta a las células T y B), así como la inducción de enfermedades autoinmunes (Gallimore A, 1988).

Evaluación de la respuesta inmune mediada por los linfocitos T CD8+

Se han realizado numerosos estudios que han caracterizado las vías citolíticas de las células T citotóxicas, así como su especificidad ante el antígeno con el cual reaccionan. Dichas técnicas experimentales incluyen: a) la prueba de citotoxicidad por liberación de cromo, b) la valoración de citocinas por ELISPOT, c) la tinción intracelular de citocinas mediante citometría de flujo (Jung T, 1993), y de forma mas reciente, la producción de tetrámeros solubles de clase I del MHC (Altman JD, 1996; Betts M, 2003; Gallimore A, 1988). Esta técnica tiene la ventaja sobre otras como el análisis por ELISPOT, que permite la caracterización fenotípica precisa de la subpoblación de células T CD8+ de interés, sin embargo se sigue utilizando la técnica de liberación de cromo 51 (⁵¹Cr) para determinar si las células citotóxicas son funcionales (Brunner et al., 1968). Estas técnicas son semi-cuantitativas y potencialmente poco sensibles. De manera importante, ninguno de estos métodos examinan directamente las células T CD8+ que median el proceso de citólisis, si no que detectan las células blanco que han sido destruidas, es decir, no la función efectora de las células T CD8+ (Betts M, 2003 ).

Recientemente se ha descrito una técnica que permite cuantificar células T CD8+ antígeno específicas por citometría de flujo utilizando un marcador que se expresa en la superficie de la célula después de la activación como consecuencia de la degranulación, lo cual es un antecedente a la citólisis. La adquisición del receptor denominado CD107 a y b esta asociada con la pérdida de perforina intracelular indicando que la expresión de este receptor depende de la degranulación de la célula (Betts M, 2003; Kannan K 1996).

Neumonitis por hipersensibilidad

De lo anterior se deduce la importancia del estudio de los mecanismos efectores de las células T citotóxicas, en particular de la caracterización de células que reaccionen de manera antígeno específica y de técnicas que permitan cuantificar de manera individual y simultánea la expresión de ciertos marcadores de superficie e intracelulares que identifique aquellas subpoblaciones que son funcionales en enfermedades en las cuales dichas células tengan un papel determinante para el desarrollo o la resolución de la misma.

Con este objetivo, en este trabajo estudiamos el papel que juegan las células T citotóxicas en la Neumonitis por hipersensibilidad (NH) que se estudia en el laboratorio de Inmunoquímica en el Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias (INER), utilizando para ello técnicas de cultivo celular y citometría de flujo para la caracterización fenotípica y funcional de dichas subpoblaciones celulares.

La NH también conocida como alveolitis alérgica extrínseca, es una enfermedad inflamatoria difusa del parénquima pulmonar provocada por la inhalación repetida de partículas orgánicas y que afecta a bronquiolos, alveolos y espacio intersticial (Selman M, 2004). La respuesta inflamatoria está mediada principalmente por una respuesta inmunológica exagerada que puede ocurrir en un hospedero susceptible (Semenzato G, 1991). La secuencia de los eventos inmunopatológicos no se conoce con precisión aunque las evidencias apoyan el concepto de que se trata de una hiperreactividad mediada por linfocitos T. La NH se caracteriza por un incremento de linfocitos en el lavado bronquioalveolar , principalmente células T, las cuales pueden representar más del 50% del contenido celular. Por esta razón es útil evaluar el patrón de las células T para distinguir las diferentes etapas de la enfermedad. Se han evaluado previamente los fenotipos celulares principales, linfocitos T CD4+ y T CD8+, dichos estudios demuestran que existen diferencias importantes en la relación de ambos tipos de linfocitos en las diferentes etapas de la enfermedad (subaguda y crónica). Conforme la enfermedad se vuelve crónica, el número de linfocitos T CD8+ disminuye, infiriendo que dichas células dejan de ser funcionales y por tanto favorable para el estado de cronicidad. Se ha reportado también que un 20% de los pacientes que desarrollan etapas crónicas de NH estas se vuelven irreversibles y fallecen a consecuencia de la misma (Pérez-Padilla R, 1993)

Para evaluar dicho comportamiento hemos utilizado el método de detección de la molécula CD107+ a/b en la superficie de las células T CD8+ así como la detección intracelular de perforina por citometría de flujo primero en células de sangre periférica de sujetos normales y posteriormente en células de lavado bronquioalveolar y de sangre periférica de pacientes con NH subaguda y crónica.

A continuación describiremos brevemente el principio de la citometría de flujo, principal técnica utilizada en esta investigación.

Citometría de flujo

La citometría de flujo es una técnica destinada a la cuantificación de componentes o características estructurales de las células, fundamentalmente mediante métodos ópticos. A pesar de que las mediciones son realizadas sobre células individuales y por unidad de tiempo, permite procesar miles de células en pocos segundos. La citometría de flujo puede utilizarse para el análisis de los diferentes tipos celulares en una mezcla o suspensión, en base a la particularidad en que los diferentes tipos celulares pueden distinguirse mediante cuantificación de las características estructurales.

En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo, las células pueden estar vivas o fijadas, pero obligadamente en suspensión celular y en forma de célula única. Se las hace pasar alineadas una a una frente a un haz láser mediante un flujo continuo, a modo de una delgada corriente de la suspensión celular. Cada célula, a la vez que dispersa la luz, emite luz fluorescente como consecuencia de la excitación láser a la que es sometida. Los parámetros que típicamente se miden de forma simultánea por cada célula son: dispersión frontal de la luz (forward scatter), valor proporcional al tamaño celular, dispersión lateral de la luz (side scatter), proporcional a la cantidad de estructuras granulares o complejidad de la célula, así como intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.

La dispersión de la luz por si sola resulta ser de bastante utilidad. Comúnmente se utiliza en la exclusión de las células muertas, agregados celulares, restos celulares, así como para reducir el ruido de fondo en la medición de la fluorescencia. Es suficiente para discriminar linfocitos de monocitos y granulocitos en muestras leucocitarias. La dispersión de la luz también puede utilizarse en la cuantificación de la agregación de las células vivas.

Convencionalmente, las intensidades de fluorescencia se miden a diferentes longitudes de onda y de manera simultánea para cada una de las células. A fin de medir los componentes de interés de cada una de las células, pueden ser utilizadas diversas sondas fluorescentes. Los anticuerpos conjugados a fluorocromos son utilizados muy a menudo en la cuantificación de la densidad antigénica de determinados marcadores, y distinguir subpoblaciones de tipos celulares diferenciados.

También pueden analizarse componentes intracelulares mediante sondas fluorescentes específicas, como por ejemplo el contenido celular de ADN (permitiendo estudios de ciclo celular y ploidía), el ADN sintetizado de novo, secuencias nucleotídicas específicas, ARNm, filamentos de actina, y en definitiva cualquier estructura para la que exista un anticuerpo o una sonda fluorescente disponible. La citometría de flujo puede utilizarse además en la monitorización de cambios en el calcio intracelular, del potencial de membrana, el pH, o en el contenido de ácidos grasos.

Los citómetros de flujo consisten de complejos sistemas de fluidos, óptica láser, detectores electrónicos, convertidores analógico-digitales y digitales, y ordenadores. Los sistemas ópticos permiten el enfoque láser en un haz con un diámetro reducido para impactar sobre el menor número de partículas posibles simultáneamente. El sistema de fluidos permite un enfoque hidrodinámico del flujo celular hasta conseguir el alineamiento de las partículas o células. Se produce posteriormente una rotura del flujo en gotas de tamaño uniforme para conseguir la separación de células individuales. El sistema electrónico se encarga de la cuantificación de los destellos de fluorescencia y de la luz dispersada. El ordenador permite por último almacenar datos de miles de células por cada muestra, y representar los resultados gráficamente (Shapiro H, 2003).

Métodos

Poblaciones de estudio

Se estudiaron los siguientes grupos de sujetos: 1) 5 sujetos sanos para la obtención de células de sangre periférica para la estandarización de las técnicas de cultivo y detección del marcador CD107 a/b y perforina; 2) 5 sujetos con NH subaguda y 3) 5 sujetos con NH crónica, ambos grupos para la obtención de células de sangre periférica y células de lavado bronquioalveolar. Cabe mencionar que el LBA de los pacientes estudiados se realizó como parte del diagnóstico en su ingreso al INER, se obtuvo su consentimiento por escrito y dicho protocolo fue aprobado por los Comités Científico y Ético del INER. Las células aquí estudiadas, se encontraban congeladas al momento de iniciar nuestro estudio por lo que no tuvimos intervención en dichos procedimientos, sin embargo se describe mas adelante la técnica de obtención de células de LBA, ya que tuvimos la oportunidad de observarla como complemento metodológico de nuestro estudio

Así mismo se revisaron los criterios previamente validados (3,6) en los cuales se basó el diagnóstico de NH y resumimos lo siguiente: 1) exposición a aves con relación causa-efecto; 2) cuadro clínico, radiológico y funcional compatible, 3) anticuerpos circulantes específicos contra antígeno aviario determinados por ELISA; 4) más de 40% de linfocitos en el LBA y 5) hallazgos histológicos compatibles con la enfermedad.

Los pacientes con NH subaguda presentaron menos de 6 meses de evolución, mientras que los pacientes con NH crónica presentaron mas de 24 meses de evolución.

Materiales

Medio de cultivo

El medio de cultivo usado en todos los experimentos fue RPMI-1640 con suero humano al 10%, 100 U/l de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, glutamina 2 mM y aminoácidos esenciales 1% (GIBCO).

Anticuerpos

Los anticuerpos utilizados para todos los experimentos fueron: anti- CD3 FITC, anti CD8 PerCp, anti-perforina PE, anti CD107a/b APC (Pharmingen, San José, Calif.)

Obtención de células de sangre periférica

Las células mononucleares de sangre periférica se aislaron por centrifugación sobre un gradiente de densidad discontinuo de Ficoll-Hypaque; las células se resuspendieron en medio RPMI 1640 suplementado con suero humano AB 10%, glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, piruvato 1 mM y penicilina y estreptomicina 100 U y 100 µg/ml respectivamente para su cultivo.

Obtención de células de lavado bronquioalveolar

Brevemente, se utilizo un broncoscopio de fibra óptica (Olympus FB2) que se dirige al lóbulo medio o a la língula. Se instilaron un total de 200 ml de solución salina estéril al 0.9% en alícuotas de 50 ml. El líquido total recuperado se filtró y se centrifugó durante 10 minutos a 650 x g a 4ºC, para separar el sobrenadante, el cual se guardó a -70ºC hasta su uso. Las células se resuspendieron en 10 ml de PBS y dos alícuotas se usaron para el conteo total y diferencial de células inflamatorias. El resto de las células se resuspendieron en 4.5 ml de suero fetal bovino y 0.5 ml de dimetil sulfóxido (DMSO) y se congelaron en N₂ líquido. Para este estudio se partió de las células previamente congeladas. Para poder llevar a cabo el cultivo y estimulación, se descongelaron a 37°C de manera rápida, se lavaron con medio de cultivo y se centrifugaron para separarlas. Posteriormente se contaron y se colocaron en las placas de cultivo en el número indicado según el tipo de cultivo.

Cultivo y activación celular

Las células de sangre periférica o LBA (2 x 10⁵) por pozo, se estimularon con PMA (Phorbol Myristate acetate) (50 ng/ml) e Ionomicina (1g/ml). Se agregó a cada pozo 5 g/ml de monesina, 5 g/ml de brefeldina, ambos como estabilizadores del anticuerpo CD107 a/b APC, el cual también se agregó a una concentración de 20 l por ml de medio de cultivo durante 6 horas, tomando alícuotas cada hora. Se recuperaron las células de la placa y se tiñeron con anticuerpos de superficie o intracelulares según correspondió. Se agregaron controles de células sin estímulo, sin monesina y brefeldina marcándolas con los mismos anticuerpos y células sin marcar como control negativo para la lectura en el citómetro.

Tinción de superficie e intracelular

Al término de cada cultivo según el protocolo apropiado, las células se cosecharon y se lavaron dos veces con PBS y fueron teñidas con anticuerpos de superficie resuspendiéndolas en 50 μl de solución de teñido (BD Pharmingen, San José CA). Posteriormente fueron incubadas con las cantidades adecuadas de los anticuerpos de superficie (CD3, CD8) por 30 minutos en hielo después de lo cual, se fijaron y permeabilizaron con una solución que contiene parafolmadehído y saponina (cytofix/cytoperm, BD Pharmingen, San José Calif.), por 20 minutos a 4°C. Al terminar el periodo de incubación, las células se lavaron dos veces con una solución que permite mantenerlas permeables (Perm/Wash, BD Pharmingen, San José Calif.). Las células fueron posteriormente teñidas por 30 minutos a 4°C con perforina. Finalmente, se lavaron dos veces con PBS y resuspendieron en paraformaldehído al 1%, después de lo cual fueron adquiridas en el citómetro de flujo.

Análisis por citometría de flujo

Las diferentes preparaciones celulares se adquirieron en el citómetro de flujo. Se leyó primero el tubo con células sin marcar para determinar la región en que se ubicaron los linfocitos. Posteriormente se realizó un gráfico de complejidad celular (side scatter, SSC) contra el marcador CD3+ para determinar únicamente la población de linfocitos T. En el siguiente análisis de graficaron las células T CD3+ y TCD8+ para determinar la población de células citotóxicas y finalmente a partir de esta ventana se analizo la expresión de perforina y CD107a/b. Se adquirieron 100,000 eventos de la ventana de las células T CD3+ y TCD8+. Los datos se analizaron con el software FACSDiva v 4.1 (Becton Dickinson).

Análisis estadístico

Los datos fueron sometidos a una prueba estadística denominada T de student para corroborar la validez de los datos. Estos se consideraron estadísticamente significativos con una p < 0.05.

Resultados

1. Estrategia de análisis por citometría de flujo.

El análisis de las células que se adquieren en el citómetro de flujo requiere la elaboración de diversos gráficos que permitan delimitar las subpoblaciones que son de interés para el estudio. Para propósitos de esta investigación es necesario realizar como primer paso un gráfico que determine al posición respecto al tamaño y complejidad celular (FSC, forward scatter y SSC side scatter) (Figura 1a). Posteriormente se grafican los marcadores CD3 y CD8 para determinar el número de células T citotóxicas (Figura 1b). De esta última ventana se realiza el análisis para la expresión de superficie del marcador CD107a/b así como para la expresión intracelular de la perforina (Figura 1c).

2. Estandarización de la tinción de superficie e intracelular con células de sangre periférica de sujetos normales.

Las células de sangre periférica se estimularon con una enterotoxina de staphilococus aureus (SEB) que induce la activación inespecífica de las células T CD8+ y promueve la degranulación, por lo tanto es posible medir la expresión en la superficie del marcador CD107 a/b+ así como la expresión intracelular de la perforina. Ambas expresiones son inversamente proporcionales, es decir, que mientras se libera perforina y con el paso de las horas se detecta menos contenido intracelular de la misma, se incrementa la expresión en la superficie del marcador CD107 a/b. Este cultivo se llevó a cabo durante 6 horas, tomando la primera alícuota a la primera hora de cultivo asignándole el tiempo cero. Este experimento se llevo a cabo con 5 muestras de sujetos normales obteniendo resultados estadísticamente iguales. Los resultados se muestran en la Figura 2.

3. Perfil citotóxico en pacientes con NH.

Por último se analizó la expresión de los mismos marcadores con células de 5 pacientes con NH subaguda (Tabla 1a) y 5 crónica (Tabla 1b) tanto en células de sangre periférica como en células de LBA descongeladas. Los resultados muestran que únicamente las células de LBA de pacientes subagudos presentan un perfil parecido al control realizado con sangre periférica de sujetos normales, lo que sugiere que únicamente estas células son funcionales ya que muestran una correlación inversa entre el incremento de la expresión del marcador CD107 a/b y la disminución de perforina intracelular en una cinética de tiempo. Cabe señalar que dicho patrón se presenta de manera más tardía que en condiciones de control. Lo cual también podría sugerir que el tiempo de respuesta de las células T citotóxicas es mayor (Figura 3).

Discusión

El desarrollo de este método de detección del perfil funcional de células T CD8+ permitió por primera vez caracterizarlas en el contexto de la NH. Se puede observar que únicamente en células de LBA de pacientes en etapas subagudas es posible detectar un cuadro similar al obtenido en la estandarización con células de sangre periférica, lo cual indica que estas células son funcionales, es decir que liberan perforina y degranulan como consecuencia de la activación. Sin embargo también se observó que dicha correlación se lleva a cabo a las 4 horas de cultivo, es decir, en el doble de tiempo que las células normales. Esto puede tener dos posibles causas. Las células de LBA pudieran tardar más tiempo en activarse y por tanto en llevar a cabo su función, lo cual no podemos demostrar, ya que para ello se necesitaría realizar un experimento con células de sujetos sanos de LBA, el cual no se realiza por motivos éticos y no contar con dichos LBA. O bien, estas células comienzan a ejercer su función efectora de manera mas tardía debido a la presencia constante del antígeno agresor, lo que después de un tiempo las convierte en anérgicas, es decir, que son incapaces de responder ante un estimulo de activación y por tanto de ejercer su función efectora. Esta situación es la que parece predominar en pacientes crónicos de LBA, donde se observa que la correlación que debiera existir entre la expresión del marcador CD107 a/b y la liberación de perforina no se lleva a cabo. Por otro lado, el perfil funcional de las células de sangre periférica en ambos pacientes, tanto subagudos como crónicos es opuesto a lo encontrado en células de sujetos sanos, lo que sugiere que las células circulantes se ven afectadas por el desarrollo local de la enfermedad y que cuando estas células migran o proliferan en el pulmón son incapaces de llevar a cabo su función efectora. Mecanismos locales sin embargo parecen permitir la funcionalidad parcial en el caso de los pacientes con NH subaguda. De lo anterior se deduce que estudios posteriores podrán completar un perfil funcional de las células T citotóxicas, extendiendo la cinética de estudio así como el posible papel que pudieran jugar otros factores como la producción de citocinas ya sea por parte de las mismas células T CD8 o de aquellas que provienen de otros tipos celulares como las células T CD4, que desempeñan un papel fundamental en la activación de las células T CD8.

Conclusiones

Los métodos tradicionales para la detección del perfil citotóxico de las células T CD8+ como el método de liberación de cromo, únicamente permiten una medición indirecta de la funcionalidad de éstas. De igual manera el método de ELISPOT no proporciona datos precisos sobre el número de células que degranulan como consecuencia de la activación ya que el conteo es visual, lo que lo hace impreciso. El método estudiado en esta investigación permite cuantificar con exactitud el número de células TCD8+ que incrementan su expresión del marcador CD107 a/b producto de la activación y degranulación, así como la disminución del contenido de perforina intracelular. Este método permite además caracterizar fenotípicamente a las células T citotóxicas tanto como se requiera ya que es posible agregar más marcadores de superficie o anticuerpos contra citocinas intracelulares como IFN-g o TNF-a. El estudio de estas células nos permitió conocer con mayor detalle el desarrollo de técnicas inmunológicas como la citometría de flujo, la cual es ampliamente utilizada tanto para fines de diagnóstico clínico, como en el conteo de linfocitos TCD4+ en VIH o bien con fines de investigación.

También nos permitió manejar y cultivar células en condiciones de esterilidad lo que nos acercó a los métodos formales de investigación celular.

Por último y de manera relevante pudimos profundizar sobre el entendimiento de las funciones efectoras de un tipo de células fundamental en la defensa inmune. El balance de las funciones efectoras de todas las células del sistema inmune permite la eliminación adecuada de patógenos potenciales así como de células cancerosas, si este delicado balance se rompe como consecuencia de la disfunción de algún tipo celular, se desarrollan padecimientos que al volverse crónicos se vuelve difícil su eliminación y como en el caso de la NH pueden llevar a la muerte de los pacientes.

Referencias

1. Altman JD, Moss PAH, Goulder PJR, et al. (1996) Phenotypic analysis of antigen-specific T. Science, 274: 94-6.

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Figura 1.

Análisis para la expresión de CD107 a/b y perforina

1. b)

Gráficos de puntos (dot plots) representativos de 5 experimentos. a) Representación del tamaño contra la complejidad celular. Se circula la población de interés que corresponde a la región de linfocitos. b) Gráfico de puntos obtenido de la expresión de superficie del marcador CD3 y CD8 para caracterizar a los linfocitos T CD8. El recuadro marca la población de interés. De esta última ventana se obtiene el análisis de la expresión simultánea del marcador CD107 a/b y perforina intracelular. Se observa un incremento en la expresión del CD107 a/b y una disminución en el contenido intracelular de perforina. Los gráficos son representativos de cinco experimentos independientes.

Figura 2.

Expresión del marcador CD107 a/b y perforina en cultivo de células de sangre periférica de sujetos sanos

Gráfico representativo de cinco experimentos independientes realizados con células obtenidas de sangre periférica de sujetos normales. En los cultivos celulares se agrega directamente el anticuerpo CD107 a/b, que es estabilizado en la membrana gracias a la presencia de monesina y brefeldina agregadas al cultivo. Este procedimiento se lleva a cabo debido a que la expresión del marcador CD107 es transitoria como consecuencia de la activación.

Tabla 1.

Expresión celular del marcador CD107 a/b y perforina en pacientes con NH subaguda y crónica

1. Subagudos

LBA		Sangre periférica
% CD107a/b	% Perforina	% CD107 a/b	% Perforina
11.2 ± 3.6%	39.5 ± 3.1%	4.3 ± 3.6%	40.3 ± 3.7%
16.9 ± 4.6%	38.2 ± 4.7%	5.7 ± 2.6%	34.5 ± 4.3%
27.6 ± 2.8%	34.5 ± 2.8%	9.5 ± 1.7%	32.3 ± 3.3%
32.3 ± 3.1%	31.8 ± 0.3%	14.3 ± 3.7%	29.1 ± 5.8%
35.3 ± 1.8%	29.7 ± 2.3%	15.9 ± 2.4%	28.9 ± 3.4%

2. Crónicos

LBA		Sangre periférica
% CD107a/b	% Perforina	% CD107 a/b	% Perforina
11.2 ± 3.6%	39.5 ± 3.1%	4.3 ± 3.6%	40.3 ± 3.7%
16.9 ± 4.6%	38.2 ± 4.7%	5.7 ± 2.6%	34.5 ± 4.3%
27.6 ± 2.8%	34.5 ± 2.8%	9.5 ± 1.7%	32.3 ± 3.3%
32.3 ± 3.1%	31.8 ± 0.3%	14.3 ± 3.7%	29.1 ± 5.8%
35.3 ± 1.8%	29.7 ± 2.3%	15.9 ± 2.4%	28.9 ± 3.4%

Los resultados mostrados son el promedio de cinco experimentos independientes, se muestran los porcentajes de células que expresan los marcadores CD107 a/b y perforina de células de LBA en pacientes con NH subaguda (a) y crónica (b) así como sus desviaciones estándar (% ± D.E.).

Figura 3.

Expresión del marcador CD107 a/b y perforina en una cinética en pacientes con NH subaguda y crónica

Comentario al trabajo realizado.

La investigación que se presenta por parte de los alumnos Fernanda Sofía García Miranda, Julio Eduardo Peters Vázquez, Bertha Patricia Díaz Sanginés, Jesús Guillermo Lagunas Garza, Mayte Lara Ruiz constituye un acercamiento firme a la investigación formal. Tuve la oportunidad de poner a su alcance las técnicas inmunológicas que se desarrollan en mi laboratorio de Inmunoquímica del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. Resultó particularmente destacable su acercamiento a la citometría de flujo. Esta técnica ampliamente utilizada en el diagnóstico clínico e investigación constituye la última tecnología de que se dispone en México en este campo, ya que el citómetro de flujo ubicado en el INER pertenece a la última generación de citómetros a nivel mundial.

Es pertinente destacar el entusiasmo y participación de todos los alumnos en el desarrollo de esta investigación, en todo momento su espíritu crítico e inquisitivo marcó el ritmo de trabajo durante todo el ciclo escolar.

El aprovechamiento de los conocimientos adquiridos se ve reflejado en el escrito final del trabajo de investigación y considero adecuado su contenido, presentación, dominio de aspectos conceptuales y la pertinencia en la utilización de los métodos.

Por último quisiera mencionar que la realización de estos concursos universitarios permiten a los jóvenes del Sistema Incorporado tener un acercamiento real con la investigación científica formal que se realiza en México, por lo que debe formar parte integral de todos los programas científicos a nivel bachillerato, llevando a cabo proyectos multidisciplinarios que permitan integrar los conocimientos de las materias de ciencias.

Vo.Bo.

Dra. Lourdes Ma. Barrera Ramírez

Asesor principal

Esta prueba de citotoxicidad descrita hace ya más de dos décadas ha sido la técnica de mayor uso para la determinación de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno (Brunner HT, 1968). Sin embargo su limitada sensibilidad y el uso de un isótopo radiactivo como el ⁵¹ Cr, han influenciado la búsqueda de nuevos métodos para su remplazo, aunque la prueba sigue siendo de gran utilidad. El principio básico de la prueba de citotoxicidad radica en la capacidad de los linfocitos T citotóxicos (LTCs) de lisar la célula blanco mediante la liberación de perforina. De un lado, se cuenta con las células efectoras (LT CD8+) que reconocen de forma especifica un antígeno presentado en el contexto de las moléculas de clase I del MHC, y del otro lado se cuenta con la célula blanco que puede estar infectada por un virus o una célula tumoral, en ambos casos los antígenos procesados por la vía de clase I, son expresados en la superficie de esta célula presentadora de antígeno. Una vez que el complejo péptido/MHC es reconocido por la célula efectora (linfocito T CD8+) se induce la lisis mediada por perforina con la liberación del ⁵¹Cr al medio. El sobrenadante es recuperado y leído en un contador de rayos gama, el resultado se obtiene en cuentas por minuto (cpm) de tal forma que la cantidad de ⁵¹ Cr en el sobrenadante es proporcional a la actividad citotóxica presente en el cultivo.

Mediante la técnica de ELISPOT (enzyme-linked immunospot) se evalúa la producción de citocinas por parte de una célula activada, lo que permite no sólo su detección sino también contar cada célula, obteniendo así la frecuencia de linfocitos T específicos de antígeno (Czerkinsny C, 1988). El principio básico del ELISPOT es la captura de una citocina mediante dos anticuerpos en un procedimiento similar a la técnica de ELISA. Para tal fin se utilizan placas de 96 pozos con el fondo recubierto con papel de nitrocelulosa en el que se pega el primer anticuerpo monoclonal específico de la citocina a medir. Seguidamente se depositan las células (LTCs) frescas o previamente estimuladas in vitro, las cuales producirán citocinas (IFN-g y TNF-a) (Kägi D, 1994). Posteriormente se adiciona un segundo anticuerpo monoclonal marcado con una enzima que permite el revelado de la prueba por medio de la adición de un substrato. Los puntos (del inglés spots) obtenidos, reflejan la producción de citocinas y son las huellas dejadas por los LTCs especifico de antígeno activados. El resultado (número de spots) se obtiene de contar los puntos por medio de un estereoscopio y la frecuencia se obtiene de relacionar el número de ellos con le número de células efectoras incubadas en cada pozo. Aunque se puede presentar variabilidad en el tamaño y en la intensidad de los puntos, la valoración visual es adecuada. En la actualidad se cuentan con equipos de conteo automático asistidos por vídeo. Se considera que el ELISPOT es 30 a 100 veces más sensible que la prueba de liberación de cromo.

El lavado bronquioloalveolar (LBA) consiste en la instilación y posterior aspiración de solución salina en las vías aéreas dístales, lográndose la obtención de componentes celulares y no celulares representativos de los fenómenos inflamatorios e inmunológicos que están teniendo lugar en todo el parénquima pulmonar. El lavado encuentra hasta el momento su mayor utilidad en el diagnóstico de las infecciones oportunistas y de algunas neumopatías intersticiales, evitando en ocasiones la realización de procedimientos invasivos. Se constituye también en una herramienta de investigación de primera mano en algunas entidades como el asma, sarcoidosis, NH y fibrosis pulmonar (Welker L, 2004).

Se entiende por NH subaguda aquellos pacientes que tienen menos de 6 meses de evolución y por NH crónica aquellos que tienen más de 24 meses de evolución.

25

Tiempo (horas)

1. LBA b) Sangre periférica

Subagudos

Crónicos

Tiempo (horas)

c)

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