Wyznaczanie kinetyki procesów enzymatycznych poprzez pomiar szybkości zużycia tlenu przez mikroorganizmy (aktywność oddechowa).
Wprowadzenie
Jednym z wygodniejszych sposobów pomiaru aktywności oddechowej osadu czynnego jest użycie zestawu składającego się z sondy tlenowej, tlenomierza i rejestratora. Zasada pomiaru jest następująca: specjalne naczynie pomiarowe wyposażone w szczelną przykrywkę z miejscem na zamocowanie sondy tlenowej całkowicie wypełniamy badanym osadem tak, aby wewnątrz nie było powietrza. Sygnał z sondy tlenowej umieszczonej w naczyniu pomiarowym jest wysyłany do tlenomierza, którego wskazania w sposób ciągły odwzorowywane są na taśmie rejestratora. Położenie pisaka rejestratora odpowiada chwilowemu stężeniu tlenu w naczyniu pomiarowym (mg O2/dm3). Taśma rejestratora przesuwa się z zadaną prędkością (np. 1 cm/min). Dzięki temu można w prosty sposób wyznaczyć szybkość zmian stężenia tlenu w naczyniu (mg O2/dm3˙h), czyli aktywność oddechową.
Sprzęt i odczynniki
zestaw do pomiaru aktywności oddechowej:
naczynie pomiarowe z sondą tlenową,
tlenomierz,
rejestrator,
mieszadło magnetyczne;
roztwór glukozy lub innego łatwo przyswajalnego substratu,
strzykawka
Wykonanie doświadczenia
Wykonać pomiary aktywności oddechowej dla różnych stężeń substratu, mierząc za każdym razem:
aktywność podstawową
aktywność po wprowadzeniu substratu
Ilość pomiarów oraz stężenia podaje prowadzący zajęcia.
Opracowanie wyników
1. Wypełnić tabelę wyników dla każdego początkowego stężenia substratu:
Objętość roztworu substratu wprowadzona do naczynia pomiarowego [ml] |
Stężenie substratu w naczyniu pomiarowym S [mg/l] |
Aktywność oddechowa AO [mg O2/dm3˙h] |
1/S |
1/AO |
|
|
|
|
|
3. Wykreślić wykres zależności 1/AO od 1/S dla równania Lineweavera-Burka. Na podstawie współczynników regresji liniowej wyznaczyć stałą Michaelisa Km. i maksymalną szybkość reakcji (akt. oddechową) AOmax. (patrz rys. poniżej).
4. Sporządzić wykres Michaelisa-Menten. Zaznaczyć na wykresie wartości Km. i AOmax.