LABORATORIUM 2.
Temat: OTRZYMYWANIE WYBRANYCH PREPARATÓW BIOCHEMICZNYCH.
Zadanie 1. Krystaliczna albumina jaja.
Wykonanie:
Białko 1 jaja po oddzieleniu od żółtka umieścić w plastikowym cylindrze miarowym (w celu zmierzenia objętości) i przelać do plastikowego pojemniczka (zlewka nr1),
w innym plastikowym cylindrze miarowym odmierzyć taką samą objętość nasyconego roztworu siarczanu amonu i dodać do zlewki nr 1wlewając go cienkim strumieniem równocześnie mieszając szklaną bagietką. Zamknąć pojemnik i wymieszać.
Wypada osad globulin, który należy odsączyć na miękkim, bibułowym sączku fałdowanym zbierając przesącz do szklanego cylindra miarowego.
Zmierzyć za pomocą szklanego cylindra miarowego objętość przesączu i przelać go do plastikowego pojemniczka (zlewka nr 2).
dodać na każde 100 ml. przesączu 14,4 g drobno sproszkowanego siarczanu amonowego (UWAGA ! - 1 płaska łyżeczka to ok. 1,44 g siarczanu amonu). Siarczan amonowy dodawać małymi porcjami stale mieszając bagietką. Powstaje osad.
Powstały osad przesączyć do kolbki ssawkowej przez miękki sączek, korzystając z lejka Büchnera i pompy wodnej.
Osad zebrać z sączka za pomocą plastikowej łyżeczki do zlewki szklanej (szklanej probówki),
rozpuścić w możliwie małej objętości wody
i roztwór doprowadzić do pH 4,7 za pomocą 4 % kwasu octowego korzystając z pH-metru, stale mieszając.
Roztwór przesączyć do kolbki ssawkowej przez miękki sączek, korzystając z lejka Büchnera i pompy wodnej.
Przelać przesącz do plastikowego pojemniczka (zlewki nr 3 - „albumina”),
do klarownego przesączu dodać przy stałym mieszaniu pojedynczymi kroplami nasycony roztwór siarczanu amonowego aż do powstania trwałego, delikatnego zmętnienia.
Próbę pozostawić w lodówce. W ciągu 2 dni wypadają z zawiesiny kryształy albuminy jaja w formie igieł.
Wypreparowane białko posłuży do realizacji dalszych ćwiczeń.
Zadanie 2. Izolowanie glikogenu z wątroby - metoda Osterna
Wykonanie:
Wątrobę (25 g) pociąć za pomocą nożyczek na drobne kawałki,
rozetrzeć w moździerzu z 1 łyżeczką piasku, czyli homogenizować (piasek dodawać porcjami).
Odmierzyć do plastikowego cylindra miarowego 10 ml. homogenatu.
do innego plastikowego cylindra miarowego odmierzyć10 objętości (czyli100 ml.) 5 % kwasu trójchlorooctowego,
przelać homogenat i kwas do plastikowego pojemnika (zlewka nr 1)
i wymieszać (wstrząsając zlewką),
odstawić na 3 min.
Ciecz znad osadu przesączyć do szklanego cylindra miarowego przez miękki sączek bibułowy w celu zmierzenia objętości.
w innym szklanym cylindrze miarowym odmierzyć taką samą objętość 95 % etanolu.
Do plastikowego pojemnika (zlewki - przesącz z glikogenem) przelać przesącz i dodawać, stale mieszając 95 % etanol.
Zamknąć zlewkę, wymieszać i oddać prowadzącemu.
Wytracony glikogen po odsączeniu będzie wykorzystany w kolejnych ćwiczeniach.
Zadanie 3. Izolacja kwasów nukleinowych z komórek bakterii.
Wykonanie:
Do probówki Eppendorfa dodać:
0,1 ml gęstej zawiesiny bakterii (E. Coli)
0,4 ml r-ru lizującego: 3 % SDS w buforze TRIS 50 mM o pH 12,6
„eppendorfkę” umieścić w łaźni wodnej o temp. 55 OC na 10 ÷ 20 minut,
następnie dodać :
0,5 ml mieszaniny odbiałczającej: chloroform - fenol 1:1,
odwirować próbę w temp. 4 OC (wirówka Eppendorfa umieszczona w lodówce) przy 6000 obrotów przez 5 minut.
Wytrącone DNA nawinąć na bagietkę i przenieść do nowej probówki Eppendorfa.
Uzyskany materiał zostanie zamrożony i posłuży do dalszych badań (elektroforeza).
Zadanie 4. Otrzymywanie preparatu inwertazy z drożdży.
Wykonanie:
5 g drożdży rozcierać w moździerzu z piaskiem,
przez 5 min dodać około 25 ml. wody i ponownie dokładnie rozetrzeć.
Odwirować w temp. 200C, przez 10 min. przy 6 000 obr/min., lub przesączyć.
Zmierzyć za pomocą szklanego cylindra miarowego objętość supernatantu (cieczy nadosadowej),
Do innego szklanego cylindra miarowego odmierzyć 5-krotną objętość acetonu
przelać do plastikowej zlewki nr 1.
Supernatant też przelać do zlewki nr 1 (tej, w której jest już aceton).
Zakręcić pojemnik i wymieszać. Wytrąca się osad.
Próbę należy przesączyć na miękkim sączku bibułowym.
Na sączku osadza się osad, który następnie należy zebrać za pomocą plastikowej łyżeczki do plastikowego pojemnika (zlewki nr 2)
Osad w zlewce nr 2 należy rozpuścić w 20 ml. wody destylowanej dodawanej porcjami.
Sączyć na miękkim sączku bibułowym do plastikowego pojemnika (zlewki -inwertaza z drożdży).
Uzyskany przesącz zawierający enzym można przechowywać w lodówce przez kilka tygodni. Inwertaza po 50-krotnym rozcieńczeniu będzie wykorzystywana w dalszych ćwiczeniach do badań nad aktywnością enzymatyczną.
3