LABORATORIUM 5

Temat: WPŁYW INHIBITORÓW I CZYNNIKÓW FIZYCZNYCH NA PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Inwertaza, sacharaza, ß-D-fruktofuranozydaza, enzym z klasy hydrolaz i podklasy glikozydaz, rozkładający cukier sacharozę na glukozę i fruktozę. Występuje głównie w komórkach roślinnych, gdzie związany jest ze ścianą komórkową. Najłatwiej uzyskuje się ten enzym z komórek drożdży.

Sacharoza disacharyd, złożony z fruktozy i glukozy, będący zasadniczym składnikiem cukru trzcinowego i cukru buraczanego. W temperaturze pokojowej sacharoza jest bezbarwnym, krystaliczny ciałem stałym. Jest nietoksyczna, ma słodki smak i bardzo dobrze rozpuszcza się w wodzie. Należy do cukrów nieredukujących. W kwaśnych warunkach hydrolizuje do fruktozy i glukozy wg schematu:

Zadanie 1. Wpływ pH na aktywność inwertazy z drożdży

Szybkość reakcji katalizowanej przez enzym jest maksymalna przy określonej wartości pH, a maleje w miarę oddalania się od niej (zbyt kwasowe lub zasadowe środowisko może powodować denaturację białek). Zmiany aktywności enzymatycznej przy różnym pH są wywołane zmianami w stopniu zjonizowania składników układu: enzymu, substratu i kompleksu enzym- substrat.

Inwertaza jest enzymem aktywnym w szerokim kwasowym zakresie pH od 4 do 6. Optymalne pH ma wartość 4,7. Przy pH 2 i 9 jest już praktycznie nieaktywna.

Wykonanie:

Przygotować 7 probówek. Do 6 probówek wprowadzić po 1 ml odpowiedniego buforu o pH 3; 4,7; 5; 7; 9 i 11. Następnie do każdej probówki dodać 1 ml 0,3M sacharozy oraz 1 ml inwertazy o optymalnym stężeniu. Przygotować także próbę kontrolną w 7-mej probówce zawierającą 1ml buforu o pH 4,7; 1ml 0,3M sacharozy i 1 ml wody zamiast enzymu. Po wymieszaniu wszystkich składników mieszaniny inkubacyjne zostawić na 30 minut. Po tym czasie zalkalizować próby paroma kroplami 1M roztworu NaOH (sprawdzić pH !), a następnie we wszystkich mieszaninach wykonać próbę Benedicta. W tym celu do siedmiu czystych probówek dodać po 1 ml odczynnika Benedicta i do każdej z nich dodać 0,2 ml mieszaniny reakcyjnej. Probówki umieścić na ok. 1-2 minuty we wrzącej łaźni wodnej. Zanotować wyniki i zinterpretować je.

Zadanie 2. Wpływ temperatury na aktywność inwertazy z drożdży

Ze wzrostem temperatury zwiększa się szybkość reakcji enzymatycznej. Po osiągnięciu pewnego optimum w danych warunkach szybkość reakcji zaczyna maleć w następstwie denaturacji cieplnej enzymu. Większość enzymów traci nieodwracalnie aktywność po przekroczeniu temperatury 65 ⁰C i tylko nieliczne wytrzymują krótkie gotowanie (rybonukleaza, żelatyna czy pepsyna w pH 1). W zakresie temperatur, w których denaturacja enzymu jest praktycznie nieistotna, a więc ok. 37⁰ C, podniesienie temperatury o 10 ⁰C zwiększa szybkość reakcji mniej więcej 2- krotnie.

Wykonanie:

Przygotować 6 probówek, a następnie do wszystkich dodać po 0,5 ml sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7 oraz do pięciu z nich 0,5 ml inwertazy drożdżowej o optymalnym stężeniu. Do szóstej probówki zamiast inwertazy dodać 0,5 ml wody. Próby umieścić na 30 minut w temperaturze: 4, 20, 37, 60, 100 ⁰C, a próbę kontrolną w temperaturze 20⁰C. Po zakończeniu inkubacji zalkalizować próby paroma kroplami 1M roztworu NaOH (sprawdzić pH !), a następnie we wszystkich mieszaninach wykonać próbę Benedicta. W tym celu do sześciu czystych probówek dodać po 1 ml odczynnika Benedicta i do każdej z nich dodać 0,2 ml mieszaniny reakcyjnej. Probówki umieścić na ok. 1-2 minuty we wrzącej łaźni wodnej. Zanotować wyniki i zinterpretować je.

Zadanie 3. Wpływ promieniowana UV na aktywność inwertazy z drożdży

Aminokwasy aromatyczne występujące w białkach mają zdolność do absorbowania promieniowania ultrafioletowego, co powoduje wzrost energii w obrębie cząsteczki białka, a tym samym zaburzenia w jego strukturze.

Wykonanie:

Na szkiełko zegarkowe wlać 6 ml inwertazy z drożdży i poddać ją naświetlaniu promieniami ultrafioletowymi. Po czasie naświetlania: 0 sek., 10 sek., 20 sek., 30 sek., 1 min., 2 min., 3 min., 4 min. pobierać do kolejnych probówek po 0,5 ml roztworu inwertazy i do wszystkich ośmiu prób dodać 0,5 ml roztworu sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7. Próby wymieszać i umieścić na 30 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie zalkalizować próby paroma kroplami 1M roztworu NaOH. Następnie we wszystkich mieszaninach wykonać próbę Benedicta. W tym celu do ośmiu czystych probówek dodać po 1 ml odczynnika Benedicta i do każdej z nich dodać 0,2 ml mieszaniny reakcyjnej. Probówki umieścić na ok. 1-2 minuty we wrzącej łaźni wodnej. Zanotować wyniki i zinterpretować je.

---