BIOLOGIA MOLEKULARNA Ćwiczenie 1

BIOLOGIA MOLEKULARNA Ćwiczenie 1

IZOLACJA RNA, DNA I BIAŁKA Z HODOWLI KOMÓRKOWYCH

Izolacja kwasów nukleinowych z materiału biologicznego wymaga przeprowadzenia lizy komórek, inaktywacji komórkowych nukleaz oraz oddzielenia izolowanego kwasu nukleinowego od pozostałości komórkowych. RNA izolowane jest w kwaśnym pH, DNA w pH ok.8.

Izolacja RNA z komórek linii nowotworowych

Z otrzymanej szalki z komórkami zlać medium.
Powierzchnię komórek zalać odpowiednią ilością Trizolu (wskazaną przez prowadzącego) i pozostawić na ok. 2 minuty. Trizol zawiera m.in. fenol, lizuje komórki, jednocześnie chroniąc RNA przed rozpadem.
Komórki zawiesić w Trizolu przez kilkakrotne pipetowanie i przenieść do probówek typu Eppendorf.
Wytrząsnąć na shakerze, pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.
Dodać 200 µl chloroformu i delikatnie wymieszać.
Pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 minut.
Odwirować w 4°C przez 15 minut, 14 000 rpm. Białka i peptydy muszą być oddzielone od RNA przy pomocy substancji powodujących denaturację i wytrącanie białek (tzw. odbiałczanie). Takimi substancjami mogą być organiczne rozpuszczalniki: fenol i chloroform. Związki te, cięższe od wody, pozostawiają w roztworze kwasy nukleinowe i drobnocząsteczkowe zanieczyszczenia, natomiast powodują wytrącanie białek, które zbierają się na granicy faz, pomiędzy fazą wodną i organiczną.
Ostrożnie przenieść górną wodną fazę zawierającą RNA do wcześniej przygotowanych nowych probówek.
Dodać 2 µl liniowego poliakrylamidu (PAA, dodawany w celu zwiększenia efektywności wytrącania kwasu nukleinowego), delikatnie wymieszać.
Dodać 0,5 ml izopropanolu (strąca kwas nukleinowy z roztworu), wymieszać.
Pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 min.
Odwirować w 4°C przez 10 minut, 14 000 rpm.
Odpipetować supernatant.
Dodać 1ml zimnego 75% etanolu i delikatnie zamieszać w celu przemycia osadu.
Odwirować w 4°C przez 10 minut, 14 000 rpm.
Odpipetować supernatant.
Wysuszyć próbki w temperaturze pokojowej aż osady staną się przejrzyste (około 10 min, zbyt mocno wysuszone RNA bardzo trudno się rozpuszcza).
Rozpuścić RNA w H₂O DEPC (DEPC inaktywuje RNazy) w podanej przez prowadzącego objętości.
Rozpuszczony osad zamrozić w -20° C lub -80° C pozostawiając do pomiaru spektrofotometrycznego na następnych ćwiczeniach.
Resztki po Trizolu zamrozić w temperaturze -80°C.

Izolacja DNA z pozostałości po izolacji RNA

Do pozostałości po Trizolu dodać odpowiednią ilość buforu do reekstrakcji (REB)
Wytrząsnąć.
Wirować 15 min w 4°C, 12000×g.
Do nowej probówki zebrać górną frakcję zawierającą DNA.
Dodać 2 µl PAA i 0,5 ml izopropanolu.
Pozostawić na 5 minut w temperaturze pokojowej.
Wirować 15 min w 4°C, 12000×g.
Osad przemyć 75% etanolem.
Wirować 10 minut w 4 °C, 12000×g.
Otrzymany osad wysuszyć i rozpuścić w 200 µl LoTE.
Dodać 200 µl PCI (mieszanina fenol : chloroform : alkohol izoamylowy w proporcjach 25:24:1).
Wytrząsnąć i odwirować 5 min w 4°C, 12000×g.
Zebrać górną frakcję, dodać 2 µl PAA i 100 µl 10 mM octanu amonu, następnie dodać 900 µl 96% EtOH. Roztwory DNA po odbiałczaniu zawierają jeszcze szereg zanieczyszczeń drobnocząsteczkowych. Ich usunięcie, oraz zagęszczenie DNA jest możliwe poprzez wytrącenie DNA z roztworu przy pomocy alkoholu etylowego. Alkohol etylowy odwadnia DNA, co w niskim pH ułatwia wypadanie kwasu nukleinowego z roztworu.
Pozostawić na noc w temperaturze -20°C
Po nocy, wirować 10 min w 4°C, 12000×g
Otrzymany osad przemyć 1 ml 75% EtOH
Zwirować 5 min 4°C, 12000×g
Wysuszyć i rozpuścić w 100 µl buforu LoTE. LoTE zawiera Tris, odpowiedzialny za utrzymanie stałego pH roztworu, a także EDTA, wiążący jony dwuwartościowe, które są kofaktorami enzymów nukleolitycznych stanowiących zagrożenie dla przechowywanego DNA.

Izolacja białka z pozostałości po izolacji DNA

Do pozostałości po izolacji DNA dodać 3 objętości acetonu, zworteksować 10-15 sekund, inkubować w temp. pokojowej 10 min, zwirować przy 12 000 x g
10 min w 4⁰C.
Zlać supernatant, do osadu dodać 0,5 ml roztworu 0,3 M chlorowodorku guanidyny, zawiesić osad przez pipetowanie.
Dodać kolejne 0,5 ml 0,3 M chlorowodorku guanidyny, zworteksować
i pozostawić w temp. pokojowej 10 min, wirować przy 8 000 x g przez 5 min
Powtórzyć raz jeszcze kroki 2 i 3.
Do osadu dodać 1 ml etanolu z 2,5 % glicerolem.
Zamrozić na noc.
Po rozmrożeniu próbkę zwirować przez 5 min w 8000 x g.
Supernatant usunąć, osad rozpuścić w 500 µl mieszaniny (TRIS pH=8, EDTA pH=7,5 i 1% SDS) oraz 25 µl β-merkaptoetanolu.
Wymieszać, inkubować 20 min w 56°C.
Zebrać supernatant zawierający wyizolowane białka do nowych probówek.