Biologia molekularna

Wykłady ogrodnictwo 2014

Geneza biologii

molekularnej - odkrycia

Co daje biologia

molekularna?

• Badanie i wyjaśnianie zjawisk biologicznych na

poziomie molekularnym:

– Molekularne podłoże odziaływania patogen-roślina
– Badanie pokrewieństwa
– DNA
– Białko-toksyna bakteryjna

• Biologia molekularna zajmuje się badaniem

zjawisk biologicznych na poziomie

molekularnym w szczególności badaniem

struktury DNA i informacji, która koduje ta

cząsteczka DNA, podstawami biochemicznymi

ekspresji genów i jej regulacji.

Literatura

• „Biologia molekularna – krótkie

wykłady” Turner, McLennan, Bates,
White

• „Podstawy biologii molekularnej”

Allison

• „Genomy” Brown
• „Genetyka molekularna” Węgleński

Zakres

1.

Geneza biologii molekularnej – geneza

2.

Struktura DNA i jego właściwości

3.

Struktura genu i genomów Plazmidu. Organizacja genomów

mitochondrialnych i chloroplastowych

4.

Replikacja DNA i jej podstawowe etapy

5.

Molekularne aspekty zmienności genetycznej – mechanizmy

mutacji i naprawy DNA

6.

Rekombinacja DNA i jej znaczenie

7.

Struktura RNA i jego właściwości

8.

Transkrypcja: polimerazy RNA, promotory, aktywatory transkrypcji,

składniki kompleksu transkrypcyjnego, etapy transkrypcji

9.

Dojrzewanie RNA. Budowa informacyjnego mRNA

10.

Mechanizmy regulacji ekspresji genów

11.

Kod genetyczny. Struktura i rola rRNA oraz tRNA. Budowa

rybosomów

12.

Transkrypcja, jej przebieg i regulacja

13.

Składanie białek i ich kompartmentacja. Modyfikacje po

translacyjne i degeneracja białek

14.

Technologia rekombinowanego DNA

Dlaczego biologia

molekularna?

• Przewodnia rola w badaniach biologicznych
• Pozwala zrozumieć zjawiska biologiczne na

poziomie molekularnym (podstawowym)

• Zastosowanie w genetyce, medycynie,

rolnictwie i ogrodnictwie, przemyśle

spożywczym – odkrycia biologii

molekularnej tworzą podstawy współczesnej

biotechnologii

• Rozumienie funkcjonowania organizmów

żywych

Definicja

Definicja (Rose … 1993)
Oddziaływania między kwasami
nukleinowymi, a białkami

Genetyk
a

Biochemia

Biologia
molekularna

• Centralny dogmat biologii

molekularnej (Crick) – schemat
przekazu informacji genetyczne

• Rysunek 1

Geneza biologii

molekularnej

1. Mendel – natura dziedziczności [Pisum

sativum]

– Dziedziczeniem nazywamy przekaz potomstwu,

poprzez geny, charakterystycznych cech

rodziców

– Odkrycia Mendal:

•

Prawo segregacji

•

Prawo niezależnego dziedziczenia się cech

•

Idea cech dominujących i recesywnych

2. F. Miescher – nośnik dziedziczności (opisał

nukleinę)

3. T. H. Morgan (zmienność muszek

owocowych – chromosomy i rekombinacja)

• Rysunek

Jakim związkiem chemicznym

są geny?

• Substancje mogące potencjalnie być

nośnikami genów:

– Polisacharydy
– Białka
– Kwas deoksyrybonukleinowy

• Substancje o zbyt małej złożoności:

– Substancje nieorganiczne
– Cukry proste
– Aminokwasy
– …

Griffith 1928 – Transformacja

genetyczna (reguła czynnika

transformującego)

• Bakteria

Pneumococc

us – szczepy

o różnych

antygenach

powierzchni

owych I, II,

etc.

– S –

patogenne

– R –

niepatoge

nne

– IIR mysz

żyje

– IIIS mysz

nie żyje

Avery, MacLeod, Oswald,

MacLeod 1944

DNA jest czynnikiem transformującym IIR do IIIS
•Test odróżniający które komórki uległy transformacji,

a które nie (komórki stransformowane nie ulegały

aglutynacji (zlepianiu się) przez podanie surowicy

zawierającej przeciwdziała skierowane przeciwko

komórkom R.
•Oczyszczone DNA wystarcza by doszło do

transkrypcji
•Czynnik transformujący można zniszczyć dodając

enzymy degradujące DNA (deoksyrybonukleazy)
•Nie zniszczy się tego czynnika przez dodanie proteaz

lub rybonukleaz (nie są to ani białka, ani RNA)

Beadle, Tatum 1941 – „jeden

gen – jeden enzym”

Hershey i Chase - 1952

• Tylko DNA jest niezbędne do

produkcji fagów potomnych

Watson i Crick - 1953

• Struktura DNA

– Replikacja
– transkrypcja

• 1961 – Odkrycie informacyjnego RNA
• 1966 – „złamanie” kodu

genetycznego” [Khorana, Nirenberg]
RNA (4 zasady)  Białka (20

aminokwasów)

Inżynieria genetyczna

• 1970 – Hamilton i Smith – enzymy

restrykcyjne

• 1972 – Berg – 1-sza rekombinacja

DNA in vitro

• 1973 – Herb Boyer i Stanley Cohen –

klonowanie DNA

Genomika

• 1977 – Sangen Frederick –

sekwencjonowanie DNA

• 1995 – Craig Venter, Hamilton Smith

– poznanie sekwencji genomów

(sekwencje 2 pierwszych bakterii)

• 2000 – Craig Venter i Francis Collins

(poznanie genomu człowieka)

• 2003 – pierwszy genom rośliny

Arabidobsis thaliana

Struktura DNA i jego

właściwości

Dna jako materialny nośnik

dziedziczności

• dsDNA – nośnik informacji

genetycznej u Eucariota i Procariota
(2 niciowe)

• ssDNA – niektóre wirusy
• RNA – kwas rybonukleinowy
• DNA – kwas deoksyrybonukleinowy

Budowa nukleotydu

• Kwasy nukleinowe są polimerami

nukleotydów

• Monomery – nukleozydy:

–

Zasady azotowe:

• Puryny
• Pirymidyny

–

Pentozy:

• Ryboza
• Deoksyryboza

Nukleozyd + reszta fosforanowa =

nukleotyd

Zasady azotowe

• Puryny (2 pierścieniowe)

– Adenina (A)

– Guanina (G)

• Pirymidyny (1 pierścieniowe)

– Tymina (T)

– Cytozyna (C)

– Uracyl (U) [RNA]

• Budowa:

– Zawierają atomy azotu

– Charakter zasadowy (przyjmują w roztworze proton)

• Reguła Chargaffa – [A] =[T] i [G] = [C] [stężenie molarne

zasady jest przedstawione jako symbol zasady ujęty w

nawias kwadratowy]

– Czyli [A] + [G] = [T] + [C]

– Udział % par G+C różni się między gatunkami, ale jest stały dla

wszystkich komórek danego organizmu w obrębie jego gatunku

Pentozy

• β-D-ryboza (w RNA)

• β-D-2’-deoksyryboza (w DNA)

• Znaki „prim” by odróżnić je od atomów

pierścieni zasad

• Deoksyryboza – bez grupy hydroksylowej (de

oxy) w pozycji 2’

• Deoksynukleozydy – zasada azotowa

pentoza i co najmniej jedna grupa

fosforanowa

• Nukleozydy – wiązanie N-glikozydowe

pomiędzy D-rybozą (1’) i zasadą azotową (N)

Grupy fosforanowe

• Obecność tej grupy powoduje że DNA i

RNA w pH fizjologicznym zachowują się

jak kwasy (w roztworze oddają proton)

• Wiązania estrowe (stabilne, ale podatne

na hydrolizę enzymatyczną) [z cukrem]

• Wiązanie fosfodiestrowe (cukier-reszt.

fosf.-cukier)

– Ujemnie naładowana reszta fosforanowa (nie

rozpuszczalny w tłuszczach charakter zwiąku)

Wiązania w cząsteczce

nukleotydu

• Nukleozydy – wiązanie N-glikozydowe

pomiędzy D-rybozą (C1’) [cukier] i
zasadą azotową cytozyną (N)

– Nukleozydy purynowe/pirymidynowe

• Wiązanie estrowe [wiązanie grupy –OH

przy C3’ jednego nukleotydu z grupą
fosforanową przy C5’ innego nuklotydu]

• Wiązanie fosfodiestrowe

Powstawanie DNA

• Polimer deoksyrybonukleotydów
• Składa się z 3 etapów:

1. Przyłączenie zasady azotowej do cukru

(przy węglu C1’) [powstanie nukleozydu]

2. Przyłączenie grupy fosforanowej do

węgla C5’ cukru [powstanie nukleotydu]

3. Łączenie nukleotydów (polimeryzacja)

[uwolnienie cząsteczki wody i
pirofosforanu]

Struktura DNA

• 2 niciowy- nici powiązane przez

wiązania wodorowe (łatwa
denaturacja)

• Pojedyńcze deoksyrybonukleotydy są

połączone wiązaniami
fosfodiestrowymi – łączą węgiel 3’
deoksyrybozy (replikacja) z węglem 5’
kolejnej deoksyrybozy

• Nici są antyrównoległe

Nazewnictwo nukleotydów i

długość DNA i RNA

• Po wcieleniu do kwasu nukleinowego każdy

nukleotyd zawiera jedną resztę fosforanową

(monofosforan), a wolne nukleotydy są zazwyczaj w

formie trifosforanów

• dNTP – trifosforany deoksynukleozydów
• NTP – trifosforan nukleozydów
• Liczba nukleotydów (nt)/zasad [opis długości

cząsteczki w RNA]

• Liczba par zasad (pz) [opis długości cząsteczki

DNA]

–

Kpz [1000 zasad/par zasad]

–

Mpz [milion zasad/par zasad]

• Oligonukleotydy – 1 niciowe łańcuchy DNA

(zazwyczaj krótsze niż 50 nukleotydów)

Zakończenie końców 5’ i 3’

• 5’ – węgiel reszty cukru, do którego

przyłączona jest funkcjonalna grupa
(PO

4

)

• 3’ – węgiel reszty cukru, do którego

przyłączona jest grupa (-OH)

• Każdy z końców wykazuje polarność ( –

PO

4

/-OH)

– Polarność 5’  3’ [kierunek syntezy kw.

Nukleinowych]

Struktura pojedynczej helisy

• Ujemnie naładowane łańcuchy cukrowo-

fosforanowe znajdują się na zewnątrz

• Jedna oś symetrii
• Nici ułożone są antyrównolegle (5’  3’ i 3’

 5’)

• Komplementarne
• …
• RNA – 1 niciowy łańcuch polinukleotydowy
• Kod genetyczny jest sekwencją zasad, która

jest różna w różnych cząsteczkach DNA

• 10 nukleotydów na 1 skręt 2-jnej helisy
• Średnica 2 mm
• Polarność DNA
• Stabilność struktury DNA:

– wiązania wodorowe
– Komplementarność
– Wiązania fosfodiestrowe i N-glikozydowe są

bardzo silne

– Zasocjowanie warstwowo ułożonych płaskich

i hydrofobowych par zasad (hydrofobowe)

Duży i mały rowek

• Wiązania, które łączą parę zasad z ich resztami

cukrowymi, nie znajdują się dokładnie

naprzeciwko siebie (reszty fosforanowe są z jednej

strony cząsteczki zbliżone do siebie, z drugiej

oddalone) [powstanie dużego i małego rowka]

• Duży rowek:

– Miejsce odziaływań DNA –białko [zasady odsłonięte

dla cząsteczek w roztworze – szczególnie atomy O i N

*]

– Informacja w formie czytelnej dla białek wiążących

DNA

• Mały rowek:

– Wzór grup zdolnych do tworzenia wiązań wodorowych

jest niemal zawsze taki sam (niezależnie od pary)

– Różnica tylko pomiędzy AT i GC

Wiązania wodorowe

• Termodynamicznie stabilne
• Między zasadami przeciwnych

łańcuchów – parowanie na zasadzie

komplementarności

• Bardzo słabe – sumaryczna liczba w

cząsteczce zapewnia stabilność

• „wspólne korzystanie z wodoru przez 2

ujemnie naładowane atomy – O i N”

• Mają stałą długość w całej cząsteczce

[regularny, symetryczny zrąb]

Odziaływania warstwowe

• Zasady azotowe – charakter hydrofobowy,

niepolarny [asymetryczny rozkład ładunku –

wymuszenie budowy cząsteczki]

• Z chwilą przyłączenia cukru i reszty fosforanowej –

zasady azotowe mają charakter rozpuszczalny w

wodzie) [ich hydroforowość nadal nakłada

ograniczenia co do budowy]

• Zasady azotowe (płaska powierzchnia) mają

tendencję do nakładania się na siebie [wymuszenie

skręcania cząsteczki helikalne]

– Eliminują pojawianie się wolnych przestrzeni pomiędzy

zasadami

– Eliminacja jak największej liczby cząsteczek wody z

wnętrza podwójnej helisy

– Hydrofobowy rdzeń

Struktura podwójnej helisy

• Stabilność – zasady są chronione

• Łatwość replikacji (rozplatanie do

replikacji – rozplecenie ułatwia i umożliwia

odczytywanie informacji genetycznej –

funkcja nośnika informacji genetycznej) –

„talerze upakowane na półce”

• Białka odszukają obszary promotorowe

głównie robiąc wgląd w duży rowek

– Duży rowek – jest bogaty w informacje

chemiczne – białka mogą rozpoznawać

poszczególne zasady nie rozplatając DNA

Formy dwuniciowej helisy

DNA

A-DNA

B-DNA

Z-DNA

Kierunek skrętu

Prawoskrętna

Prawoskrętna

Lewoskrętna

Duży rowek

Głęboki i wąski

Średnio głęboki,

szorstki

Bardzo płytki, w

zasadzie

nieobecny,

czasami zwany

rowkiem

Mały rowek

Płytki i szeroki

Średnio głęboki,

wąski

Bardzo głęboki i

wąski

Liczba par zasad

na pełny obrót

helisy

11

10,5

12

Warunki

Mała wilgotność

(75%), duże

stężenie soli

Duża wilgotność

(95%), małe

stężenie soli

Duże stężenie

MgCl

2

(>3M)

NaCl lub etanolu,

Jeśli obecne są

metylowane

cytozyny: duża

wilgotność i małe

stężenie soli

DNA może ulegać

odwracalnemu rozpleceniu

• Każda z nich może stanowić matrycę do

syntezy drugiej (replikacja, transkrypcja i
translacja)

• W czasie replikacji i transkrypcji zachodzi
• Rozerwanie wiązań wodorowych – silne

podgrzanie cząsteczki [„topienie się”]

• Denaturacja DNA wywołuje zmiany we

właściwościach absorpcyjnych światła
ultrafioletowego (260 nm)

– Efekt hiperchromowy [w czasie denaturacji

DNA jego absorbcja wzrasta]

Inne czynniki powodujące

denaturację

• Zmniejszenie stężenia soli w roztworze

(usuwanie kationów, które zapobiegają
odpychaniu się ujemnych ładunków obu
nici)

• Słaba siła jonowa (wzmocnienie

odpychania ujemnych ładunków)

• pH
• Rozpuszczalniki organiczne:

– formamid

Chemiczne i fizyczne

właściwości kwasów

nukleinowych

• Średnio silnie kwaśne (bardzo niskie pH) –

hydroliza kwasów nukleinowych do zasad,
cukrów i fosforanów

• Środowisko umiarkowane kwaśne (pH 3-4)

– hydroliza wiązań glikozydowych pomiędzy
cukrem i zasadami purynowymi –
DENATURACJA

• Środowisko zasadowe (pH > 7-8) – zmiany

tautomeryczne zasad i zerwanie wiązań
wodorowych - DENATURACJA

• Rys

Spetroskopowe właściwości

kwasów nukleinowych

• Zasady aromatyczne absorbują światło 260

nm (wykrywanie, oznaczanie ilościowe i
określanie czystości)

• dsDNA jest hipochromiczny w stosunku do

ssDNA

• Pomiar ilościowy DNA i RNA – Absorbcja A

260

(1-niciowe więcej absorbuje niż 2-niciowe)

• Czystość preparatów DNA i RNA – stosunek

A

260

/A

280

=1,8

– Czyste RNA= 2
– Białka A

260

/ A

280

poniżej 1 (ok. 0,5)

• Denaturacja termiczna (topnienie)

dsDNA

– Ma charakter kooperatywny – zaczyna

się od denaturacji końców i bardziej
labilnych obszarów bogatych w A=T

• Temperatura topnienia DNA – T

m

– Temperatura przy której dochodzi do

utraty połowy heliakalnej struktury przez
daną cząsteczkę DNA

Krzywa denaturacji (topnienia)

DNA [T

m

]

Wpływ na T

m

• Zależy od zawartości G-C i stężenia

soli w roztworze

Spetroskopowe właściwości

kwasów nukleinowych

• Renaturyzacja – ochładzanie roztworu

zawierającego DNA:

– Szybkie – splatanie się krótkich fragmentów
– Powolne – odnalezienie się w całości nici

komplementarnych i odzyskanie struktury 2-
niciowej helisy

• Hybrydyzacja – renaturyzacja

komplementarnych regionów między
różnymi nicimi kwasu nukleinowego (z
różnych źródeł)

Zawartość A, T oraz G i C

• Zawartość A=T i G≡C (parametry

charakteryzujące DNA)

• Ogólnie zawartość G≡C ≈50%

[gdyby było losowe – ale NIE JEST!]

Denaturacja chemiczna

kwasów nukleinowych

• Mocznik
• Formamid

Formy przestrzenne DNA

• Czynniki transkrypcyjne oddziaływają przez

duży rowek

• Formy przestrzenne DNA

– W kilku formach

• jeśli chodzi o układ helisy - forma B jest preferowana in

vivo

– Forma Z-DNA i trójniciowa są związane z chorobami

genetycznymi

– A – pusta w środku (wyizolowana)

• Trójniciowa helisa – rzadkie (prowadzi do

chorób)

• 4 niciowe DNA (u człowieka) - choroby

Struktury drugorzędowe

• Regulacja ekspresji genów
• Nietypowe:

– Wybrzuszenia (slipped structures) [struktury

powtórzone tandemowo]

– Struktury krzyżowe (cruciforms)
– Trójniciowe helisy DNA

• W czasie rozluźniania napięcia torsyjnego

cząsteczki DNA superhelikalność

gwarantuje zmagazynowanie w jej obrębie

energii potrzebnej do tworzenia struktur

Wybrzuszenia

• Powtórzenia tandemowe – dwie lub więcej

sąsiadujące kopie o identycznej/prawie
identycznej sekwencji nukleotydowej,
połączone ze sobą w sposób określony głowa
– ogon (sekwencja czytana na tej samej nici
w tym samym kierunku jest taka sama)

• Powód przyjmowania niezwykłych struktur

(powtórzenia) [blokowanie replikacji i
transkrypcji – zapoczątkowanie procesów
naprawczych]

Struktury krzyżowe

• Stabilizowanie niewielkich bąbli

niesparowanego jednoniciowego DNA

• „spinki do włosów” (sparowany rejon trzonu i

pętla zamykająca trzon)

• Palindromy (sekwencje

powtórzone/powtórzenia odwrócone) – mają

tę samą sekwencję nukleotydową w

komplementarnych łańcuchach (czytane

wspak znaczą to samo)

– Powtórka paruje się z sekwencją komplementarną

na tej samej nici DNA (zamiast komplementarną)

Trójniciowa helisa DNA

• Tripleks powstaje
• Powstaje w rejonach o symetrii

lustrzanej, w regionach ciągów puryna
(jedna nić) – pirymidyna (druga nić)

• Trzecia nić powstaje z :

– Wewnętrznego (w obrębie tej samej nici)

ciągu puryna-pirymidyna

– Z innej cząsteczki DNA

Formy przestrzenne DNA –

trzeciorzędowa struktura DNA

• Kolista, 2 niciowa cząsteczka DNA jest

zbudowana z dwóch kolistych, jednoniciowych

cząsteczek DNA, a nici te splatają się ze sobą.

• Superhelikalne skręcenie (nadmierne

zwinięcie lub rozwinięcie, w stosunku do

całkowitej liczby skrętów) [działa napięcie

torsyjne]

– Korzystnie energetycznie formy

– Trójwymiarowe struktury

– Mniej stabilne niż forma zrelaksowana DNA

– Napięcie torsyjne prowadzi czasami do lokalnej

denaturacji (rozplatanie na krótkich odcinkach)

Metylacja DNA

• DNA może występować w formie

zmetylowanej

• Grupa metylowa (-CH

3

) przyłączona do

zasady

– N

6

– metyloadenina (m

6

A)

– N

4

- metylocytozyna (m

4

C)

– C

5

– metylocytozyna (m

5

C)

• Chronienie przed restrykacją DNA

(niszczeniu przez enzymy restrykcyjne)

• Regulacja ekspresji genów

• Rys

Zachowanie wzoru metylacji

podczas replikacji

• Metylacja DNA – sposób regulacji

ekspresji genów. Zachowanie wzoru
metylacji podczas replikacji.
Przekazywany w czasie podziału
komórce potomnej.

• Chroni DNA bakterii przed enzymami

restrykcyjnymi

• Wyspy Cpb – obszary DNA bogate w

CG, najczęściej promotorowe o
wielkości około 300-3000 pz (nie
podlegają metylacji)

• Rejony regulatorowe genów typu

„housekeeping” zabezpieczają je
przed metylacją

Imprinting – piętno

rodzicielskie

• Określony wzór metylacji genu zależy od tego

czy dany allel pochodzi od ojca/matki

• Różna metylacja genów w gametach
• Piętnowanie matczyne – allel matczyny jest

nieaktywny na skutek zmetylowania i ekspresjii

ulega jedynie allel ojcowski

• Piętnowanie ojcowskie – allel ojcowski jest

nieaktywny, a matczyny ulega zmetylowany(?)

– Zabezpieczenie przed partenogenezą (dla

prawidłowego rozwoju muszą być geny i ojca i

matki)

Zaburzenia epigenetyczne –

metylacja de novo

• Czynniki środowiskowe prowadzące do

mutacji genów:

– Metale ciężkie – nikiel, kadm, arsen

– Aflatoksyny, czynniki jonizujące, dym

papierosowy

– Czynniki infekcyjne

– Bromek etydyny

– Aktynomecydyna (lek przeciwnowotworowy)

– Pochodne proflawiny

– Aromatyczne aminokwasy (np. fenyloalanina)

• Częściowe rozkręcenie podwójnej helisy!

(bromek)

Związki interkalujące z DNA

• Związki interkalujące z DNA –

wynikają pomiędzy pary zasad w 2-
niciowej helisie

• Rys

Typy cząstek DNA

• Wielkość cząstek DNA określamy

podając liczbę par zasad
wchodzących w skład:

– Pz
– Kpz (kiloparzasad)
– Mpz (megaparzasad)

Kształt cząsteczki DNA

• Koliste (nie mają końców i mają

problemy ze skręcaniem się)

• Linearne (2 końce i nie mają

problemów z obrotami – teoretycznie)

• Czasami koliste, a czasami linearne

(bakteriofag λ – infekuje E. coli)

– W otoczce fagowej linearny, po

wniknięciu do E. coli kolisty

Kolistość i struktury

superhelikalne

• Plazmid kolisty – dominuje forma

superhelikalna (napięcia fizyczne,
spżężenia)

• Struktura superhelikalna - I forma –

bardziej kompaktowa, naturalna

• Struktura zrelaksowana – II forma

Topoizomery

• Izomery topologiczne (topoizomery) –

taka sama sekwencja nukleotydowa,
lecz różna liczba opleceń

• Topoizomerazy (enzymy)

przekształcają (izomeryzują) jeden
topoizomer DNA w drugi [przy
zmianie liczby opleceń]

Topoizomerazy

• Rozwiązują problemy topologiczne DNA
• Topoizomerazy typu I – nacinają

przejściowo 1 nić (nie wymagają ATP)

– Typ I A – przeciąganie nienaruszonej nici

poprzez nacięcie – usuwają tylko negatywną
superhelisę

– Typ I B – obrót drogiej helisy …

• Topoizomerazy typu II – nacinają

przejściowo obydwie nici (wymagają ATP)

• Rozszczepianie kolistych plazmidów

po replikacji (katenany) – dekantacja
układu

• Splecenie dwóch osobnych

cząsteczek DNA – superzwinięcie

• Węzeł (rozwiązywanie

Rola topoizomeraz

• Udział w replikacji, rekombinacji i

upakowaniu DNA

– Usuwanie superhelisy
– Wprowadzenie negatywnej superhelisy

(topoizomeraza typu II – gyraza)

– Rozwiązywanie węzłów
– Regulacja „gęstości” superhelisy

• Kamptotecyna – alkaloid izolowany z

„happy tree” Camptothela acuminata

Struktura genu i

genomów. Plazmidy.

Organizacja genomów

mitochondrialnych i

chloroplastowych

DNA u Prokariontów

• Upakowane DNA u prokariota – na

przykładzie budowy chromosomu E.
coli

– 1 kolisty chromosom (nie jest odizolowany

błoną od reszty komórki – nukleoid – rejon
zajmowany przez chromosom bakteryjny)

– Wymiary 1-1,5 mm
– Objętość bakterii 1µm

3

(musi być

upakowane)

DNA u prokariontów

• DNA jest podzielone na 30-50 pętli
• Tworzy superhelisę – topoizomerazy

(superzwinięcie i gyraza)

• Swobodna (?)
• Stabilizowana przez białka

histonopodobne:

– HU
– IHF
– H-NS
– F/S

DNA u Eucariota

• Chromatyna

– DNA w kompleksie z białkami –

kompleksy te tworzą chromosomy

• Cząsteczki DNA ludzkiego 46 –

długość 2 m

• Jądro komórkowe – średnica 10 µm

Struktura chromatyny -

Dynamiczna

• Nukleosomy – podstawowa struktura

organizacyjąca eukariotycznego DNA

– Około 146 bp DNA nawinięte na dysk

oktameru histonowego – „paciorki

nawinięte na sznurek” (upakowanie 6 x)

– Struktury wyższego rzędu – włókno 30 nm

(upakowanie 40 x)

– Pętle chromosomowe – dalsze poziomy

upakowania (nie jest jasne jak się dokonuje)

– Chromosom interfazowy

– Chromosom metafazowy (10 000 x

upakowanie maksymalnie)

Chromatyna

• Stanowi podłoże dla epigenetycznych

mechanizmów regulacji ekspresji genów

• Epigenetyka wszelkie potencjalne

stabilne i dziedziczne zmiany w
ekspresji genów, które nie są związane
ze zmianami w sekwencji DNA

– Metylacja cytozyn w DNA
– Modyfikacje histonów
– Remodeling chromatyny zależy od ATP

• Odkrycie nukleosomów – trawienie

chromatyny nukleazą

• Nukleosom – oktamer składający się

z histonów rdzeniowych, po 2 histony
rdzeniowe (H2 a i b, H3, H4…) spięty
histonem łącznikowym (H1)

Histon H1

• Różni się od pozostałych
• Łącznikowy
• Większy od pozostałych
• Wykazują zmienność sekwencji
• Rola w dziedziczeniu epigenetycznym

Histon

• 5 klas histonów eukariotycznych:

– Rdzeniowe (H2A, H2B, H3, H4 – małe

białka 10-20kDa)

– Łącznikowe (H1 – 23 kDa)

• Bogate w lizynę i argininę (20-30%)

ładunek (+) więc może silnie wiązać
się z DNA (-)

• Silnie konserwatywne – szczególnie

histony rdzeniowe

Modyfikacje histonowe

• Mogą ulegać:

– Acetylacji

– Fosforylacji

– Metylacji

– Ubikwitynacji (ubikwityna – białko wiązane

z degradacją)

– Sumoylacja

• Gdzie:

– Modyfikacje w pobliżu pozbawionego

stabilnej struktury N końca

– N końce

• Pętle chromosomowe – sekwencje

MAR-DNA bogate w A=T łączące się z
matriks jądrową

Chromosomy

• Rys

Kondensacja chromosomów

• Kondensacja – kompleks białkowy

odpowiedzialny za kondensację
chromosomu

• Kinaza Aurora – fosforyluje histon H3

na ser10

• Topoizomeraza II - …
• Kohezyna – utrzymanie chromatyd

razem

Organizacja Chromosomu

• Metacentryczne – centromer

pośrodku

• Akrocentryczne – w pobliżu jednego z

końców

• Telocentryczne – na końcu

chromosomu

Człowiek - kariotyp

• 23 pary chromosomów = 46

chromosomów

• 44 autosomy i 2 chromosomy płci

• Kariotyp – liczba i wygląd

chromosomów specyficzna dla
danego gatunku

• Chromosom Philadelfia – wydłużony

chromosom 9 wydłużony o
chromosom 22 – translokacja
chromosomu (diagnostyka chorób
nowotworowych)

• Dlaczego geny występują jako

pojedyncze jednostki, ale są
zorganizowane w chromosomy?

• Elastyczność segregacji
• Ograniczenia co do długości (nie za

krótkie, nie za długie)

Struktura genów i genomów

• Genom – pełna informacja genetyczna

żywego organizmu (też sekwencje

niekodujące)

• Chromosom – podstawowa

makromolekularna struktura genomu

(występuje w jądrze komórkowym – z

DNA i białka)

• Chromatyna – kompleks złożony z DNA i

białek histonowych podlegających

dynamicznym zmianom (kondensacji)

Struktura genomów

• Organizmy prokariotyczne

– Chromozsom bakteryjny – upakowany w

nukleoid

– Plazmidy (pozachromasomalne DNA)

• Organizmy eukariotyczne

– DNA jądrowe (chromosomowe)
– DNA organeralne (mitochondrialne,

chloroplastowe)

• Większość chromosomów

bakteryjnych – kolista, zwykle zawiera
1 miejsce ori (startu replikacji), ale są
wyjątki np. Borrelia (Borelioza) z kilku
chromosomów liniowych

• Chromosomy eukariotyczne – liniowe

cząsteczki DNA zawierają kilka miejsc
ori (wyjątki drożdze)

Porównanie

Cecha

Prokariota

Eukariota

Błona jądrowa

-

+

Liczba chromosomów

1

>1

Histony

-*

+

Jąderko

-

+

Wymiana genetyczna

Jednokierunkowa

Fuzja gamet

Mitoza

-

+

Introny w genach

Rzadko

powszechnie

Co znajduje się z genomach

• DNA kodujące – geny

• Gen – fragment DNA odpowiedzialny za

kodowanie funkcjonalnego produktu

• Białka

• RNA:

– tRNA

– rRNA (rybosomalny)

– snRNA

– miRNA (mikroRNA – interferencja)

• Dna niekodujące

DNA niekodujące

• Pseudogeny (zdegradowane
• Sekwencje powtórzone

• Inne niestrukturyzowane rodzaje DNA

(najczęściej)

Procariota

• Geny prokariotyczne są

zorganizowane w operony

• Operon – podstawowa jednostka

transkrypcyjna u Procariota

– Monocistronowy (1 ramka odczytu = 1

białko)

– Policistronowy

• Nie posiadają intronów

Eucariota

• Geny eukariotyczne posiadają

introny:

– Dłuższe
– Długie sekwencje regulatorowe

(znacznie dłuższe)

• Rysunek

Geny eukariotyczne posiadają

introny

• Introny – sekwencje regulatorowe

– Cis regulatorowe sekwencje

1.Początek rozplatania TATA – głównie

rejony bogate w A i T

Od tego miejsca DNA może zostać

przepisany na RNA (mRNA)

Powstaje najpierw Pre-mRNA
Pre-mRNA jest przerabiany na mRNA

szybko.

Końce są zabezpieczone mRNA w jądrze i

jest transportowany do cytoplazmy

Geny eukariotyczne posiadają

introny

2. Początek transkrypcji
3. Wiązanie rybosomu
4. AGT
5. Egzon 1
6. Intron
7. Egzon 2
8. Stop
Większość genów w różnych organizmach.
Udział genów o określonej wielkości (%)

Wielkość egzonów

• Przecięte geny mają wielkość 100- 400

pz

• Introny od 100 do 5000 pz
• C – value para box
• Związek między złożonością organizmu,

a wielkością genomu:

– Istnieje u niektórych organizmów
– U organizmów bardziej złożonych tej

korelacji nie ma – Paradoks zawartości DNA

Rodziny genów i

Pseudogeny

• Rodziny genów:

– Grupy genów o identycznej lub podobnej

sekwencji

– Grupy rRNA
– Globiny – rodzina globin α i β

• Pseudogeny:

– Geny któtkie z jakiegoś powodów są

niefunkcjonalne, STOP kodony,
uszkodzenia/ zmiany genów

Sekwencje powtórzone

• Telomerowo DNA
• Rozproszone

– Mikrosatelitarne DNA (elementy strukturalne

chromosomu)

– Transpozony typ I (Retroelementy).

Przemieszczenie dzięki odwrotnej transkrypcji

1Retrotranspozon  sekwencja RNA

konwertacja 2 nici DNA (dopisanie 2 nici)

2 retrotranspozony

• Retroelementy (posiadające LTR-y)

• Retrotranspozony endogenne:

– LINE/SINE (retroelementy – nie posiadające

LTR-ów) – namnażanie

• Transpozony typ II – transpozony DNA

(skańczące geny)

– Zawierają odwrócone powtórzenia i gen

kodujący transpozazę – autonomiczne

(rozpoznaje, wycina i wbudowuje w inne

miejsce)

– Wbudowanie się transpozonu w gen

prowadzi do inaktywacji genu

• Dysocjator (zdegenerowany aktywator)

Organizacja genów różnych

organizmów

• Transpozony – wbudowane w gen

prowadzi do inaktywacji

• Ramiona chromosomów –

częstotliwość genów największa

Replikacja DNA i jej

podstawowe etapy

Replikacja DNA = synteza

DNA

1. Semikonserwatywny charakter

replikacji DNA

2. Etapy i enzymy
3. Regulacja replikacji genomu

eukariotycznego

4. Telomery i telomeraza

Replikacja DNA

• Replikacja DNA – proces prowadzący do

podwojenia ilości DNA w komórce

• Synteza 2 komplementarnych helis DNA z

jednej wyjściowej (obydwie helisy mają

sekwencje nukleotydową identyczną z helisą

wyjściową (z wyjątkiem rzadko występujących

błędów)

• Replikon (niezależne/autonomiczne replikująca

się cząsteczka DNA):

– Chromosomu

– Plazmidu

– Chromosomu mitochondrialnego
[jednostka replikacyjna]

Replikacja:

• Kopiowanie informacje genetyczne
• Decydowanie o stabilności genetycznej

organizmów – jeden z bardziej złożonych

procesów w komórce

• Zachodzi zanim komórka się podzieli

(potomne)

• Błędy prowadzą do mutacji – zmiany w

informacji genetycznej

• Z rekombinacją związane są systemy

rekombinacji i naprawy DNA

• Zachodzi w kierunku 5’ 3’ przez

dołączenie nowych nukleotydów do grupy
–OH do końca 3’ syntetyzowanej
cząsteczki

• Substrat – trójfosforan nukleotydów
• Enzym – polimerazy DNA zależne od DNA

– Polimeraza DNA – potrafi dobudowywać

nukleotydy do istniejącego już fragmentu
łańcucha kwasu nukleinowego (na matrycy
DNA)

Proponowane modele replikacji

DNA

1. Konserwatywna
2. Semikonserwatywna
3. Rozdzielna (dyspersyjna)

• Rysunek

Replikacja

semikonserwatywna

• Rysunek

• Rysunek

• W każdej rundzie replikacji każda z 2

nici DNA jest wykorzystywana jako
matryca do syntezy
komplementarnego łańcucha DNA

• Etapy:

1. Inicjacja
2. Elongacja
3. Terminacja

• Zaczyna się w miejscach „startu

replikacji” [origin of replication – ORI]

– Procariota – 1 miejsce
– Eucariota – kilkadziesiąt tysięcy (człowiek

10 000)

• Rozplecenie 2 nici DNA i

przygotowanie do syntezy nowych nici

• Uformowanie widełek replikacyjnych

• rysunek

Replikacja u bakterii

• rysunek

Maszyneria replikacyjna

1. Topoizomeraza – usówa naprężenia DNA
2. Helikaza – rozdziela komplementarne nici
3. Białka typu SBS – stabilizują 1 niciowe DNA
4. Prymaza (?) – syntetyzuje startery

(primery)

5. Polimeraza (-y) – synteza DNA i korekta

błędów

6. Ligaza – łączy fragmenty Okazaki

• Rysunek

Inne modele replikacji u

Procariota

• Replikacja przemieszczającej się pętli

D (chloroplasty, mitochondria)

• Model toczącego się koła – rolling

circle (plazmidy też podczas
koniugacji)

Replikacja u Procariota

• Regulacja replikacji:

– Na etapie inicjacji:

• Masa
• Długość komórki

– Metylacja miejsca ori

1. Inicjacja

• Rozpoczęcie nowej rundy replikacyjnej

• Powstanie widełek replikacyjnych

(replisomu) – miejsce ori [skompletowanie

maszynerii]

Kiedy czas na podział?  wielkość

Ori – bogate w AT [285 pz] (mniej wiązań

wodorowych to mniej energii na rozplatanie)

ATP-aza – nawija na siebie NA (DNA A) –

inhibitor replikacji

Helikaza (DNA B) – przyłącza do DNA

(rozkręca podwójną nić)

DNA C – funkcja transportowa DNA B – białko

opiekuńcze (helikazy)

1. Inicjacja

• Przyłączenie Prymazy (DNA G) –

syntetyzuje starter

• RNA, który polimeraza wydłuża – 1-na

nici wiodoncej, wiele dla opóźnionej

• Dołączenie polimerazy III

• Białka SBS – ochrona

• Skompletowanie replisomu

• Polimeraza III DNA – 2 aktywności

– Polimerazy 5’  3’

– Egzonukleaza 3’  5’

1. Inicjacja

• Holoenzymy (Polimeraza III DNA), podjednostki:

– α – aktywność

– ɤ - (tau ??) – decyduje o procesywności

– Procesywność – zdolność do replikacji DNA bez

odłączania się od matrycy:

• Wzrasta podczas syntezy nici wiodącej

• Spada podczas syntezy nici opóźnionej

– Kompleks kontrolujący przyłączanie i odłączanie się

od matrycy, synteza nici opóźnionej:

• ɤ

• σ

• x

• ϕ

– ε - aktywność egzonukleazy

– ϐ (theta)

– Β (obręcz)

2. Elągacja

• Uczestniczą białka:

– Helikaza DNA B

– Prymaza DNA G (rozplata)

– Białka SBS – ochronne

– Polimeraza III DNA

– Polimeraza I (wyjada RNA i dosyntezywuje nici

oraz łączy fragmenty Okazaki)

– Ligaza polinukleotydowa

– Gyraza DNA (topoizomeraza typu II)

– Polimeraza I DNA [kornbergowska] (usuwanie

starterów RNA i zabudowywanie krótkimi

odcinkami DNA, izolowana z bakterii

termofilnych jest stosowana w PCR)

3. Terminacja – zakończenie

rundy replikacyjnej

• Region Ter i białka Tus – wiążą się z

sekwencją ter i zatrzymuje ruch widełek
replikacyjnych – inhibitor helikazy

• Antybiotyki – hamujące syntezę DNA

– Mogą:

• Hamować działanie enzymów replikacyjnych np.

topoizomerazą II – gyrazy

• Uszkadzać matrycę
• Blokować syntezę nukleotydów

Replikacja u Eucariota

1.

Etapy – takie same

2.

Liczba Ori, białek uczestniczących w
procesie

3.

Aparat cyklu komórkowego kontroluje
replikację

4.

Rozplatanie chromatyny

5.

Problemy z replikacją końców
chromosomów (niedoreplikowanie nici
opóźnionej)

Cykl komórkowy

• rys

• ORC, inicjacja – faza G1

– Kompleks ORC – 6 białek (DNA A)

[związane z ori]

– Cdc 6 i Cdt 1 – umożliwiają zapakowanie

do kompleksu helikazy MCM (DNA C)

– MCM – kompleks 6 białek o aktywności

helikazy (DNA B u bakterii)

– Kontrola CDK (kinazy zależne od cykin ….)
– Początek fazy S …

• Nie wszystkie ori wykorzystywane są

w każdym cyklu

• Ori ulokowane bliżej centromeru są

uruchamiane wcześniej niż te w
pobliżu telomerów

Replikacja eukariotyczna

1. Kompleksy ORC powstają w wielu miejscach
2. Licencjonowanie ORC polega na przyłączeniu Cdc 6 i

Cdt 1

3. Kompleks MCM (helikaza) jest następnie załadowany

na nić

4. Powstaje kompleks pre-replikacyjny (pre-RC)
5. W fazie S cyklu komórkowego, kinazy regulowane

przez cykl komórkowy inicjują replikację

6. Po replikacji kompleks preRC jest tak blokowany, by

nie doszło do re-replikacji bez podziału

komórkowego

7. Replikacja rozpoczyna się z różnych miejsc ori –

wczesnych i opóźnionych

8. Miejsca ori są słabo zdefiniowane

Wierność replikacji

• Zależy od polimerazy

– Polegając tylko na chimerycznym parowaniu

zasad

– Polimeraza III E. coli, σ i ε ssaków (10

6

i 10

8

)

• 1 błędna na 10

1

-10

3

włączonych

nukleotydów

• Duża wierność syntezy DNA:

– Ze środowiska – wykluczona woda
– Korekcyjna aktywność polimeraz I i III E. coli, σ

i ε ssaków

Rozplatanie chromatyny

• W replikacji musi ulegać cała chromatyna

– W tym strukturalnie zdefiniowane rejony eu- i

heterochromatynowe

– DNA eukariotyczne jest spakowane i tworzy w

chromatynie:

1.Białka wiążące z ori muszą dotrzeć do DNA

w tych miejscach

2.Chromatyna musi ulec rozmnożeniu na

drodze przesuwających się widełek
replikacyjnych

Problem telomerów

• Problem telomerów podczas replikacji

liniowej cząsteczki DNA:

• Polimeraza nie może odtworzyć odcinków

DNA w miejscu wyciętego primera

ostatniego fragmentu okazaki –

niedoreplikowanie nici opóźnionej

• 1 niciowe fragmenty DNA są degenerowane

przez maszynerię naprawczą (nukleazy)

• Mogą komplementować ze sobą prowadząc

do fuzji chromosomów

• Efekty: skracanie telomerów i rearanżacje

chromosomów

Telomery

1. Końce chromosomów
2. Zawierają sekwencje powtórzone
3. Skracają się przy każdym podziale

komórkowym – komórki somatyczne mają

ograniczoną liczbę możliwych podziałów

4. Telomeraza odbudowuje fragmenty

telomerów

Białko + fragment RNA = Telomeraza
Aktywna konstytutywnie u 1-kom. Eukariotów
Telomery – markery nowotworzenia

Molekularne aspekty

zmienności genetycznej –

mechanizmy mutacji i

naprawy DNA

Molekularne aspekty

zmienności genetycznej

1. Mutacje
2. Naprawa DNA
3. Rekombinacja

Różnorodność żywych organizmów i ich

sukcesy w zasiedlaniu prawie każdego

skrawka powierzchni ziemi są wynikiem

zmian genetycznych, które stopniowo

akumulują się w ciągu milionów lat

umożliwiając organizmom adaptację do

zmieniających się warunków środowiska

Z perspektywy organizmu

„Jednak w krótkim czasie i z perspektywy

indywidualnego organizmu każda zmiana genu

jest często szkodliwa, szczególnie w przypadku

organizmów wielokomórkowych, w których

zmiana genu może z dużym

prawdopodobieństwem wprowadzić zaburzenia

w niezwykle złożonym i perfekcyjnie

regulowanych procesach rozwojowych i

fizjologicznych.” Albertś i inni

Mutacje

Np. Kolor papryki (2 szlaki – związane z

ostrością)

Zmienność rekombinacyjna – pomidory dzikie x

uprawne („tasowanie się” fragmentów

chromosomów)

• Mutacja – zmiana w sekwencji

nukleotydowej DNA

• Rekombinacja – przebudowywanie

struktury części genomu:

– Wymiana fragmentów chromosomów

– Transpozycja ruchomego elementu

• Mutant – termin określający stan

organizmu – w odróżnieniu od formy

„dzikiej” (nizemutowanej)

• Mutagen – środek wywołujący mutacje

• Mutageneza – proces tworzenia mutacji

Hermann, Muller- odkrycie

mutacji

• Promieniowanie X – indukowane

mutacje

• Normalna częstotliwość mutacji jest

znikomo niska

• Przez naświetlanie prom. X uzyskał w

tydzień tyle mutantów muszki, ile
wcześniej zidentyfikowano w 15 lat

Podział mutacji

Różne kryteria
1.Ze względu na zakres/długość
zmienionej sekwencji
2.Konsekwencje fenotypowe
3.Warunki w których się ujawniają
4.Sposób powstawania
5.Inne

1. Ze względu na

zakres/długość zmienionej

sekwencji

• Punktowe (genowe - lokalne):

– Substytucja (najczęstsze –

zastępowanie)

– Delecja (wypadnięcie)
– Insercja (wciśnięcia)
– Inwersja

• Chromosomowe (strukturalne)

Model substytucji

nukleotydów

• Tranzycje

– Puryna  puryne
– Pirymidyna  pirymidynę

• Transwersje

– Puryna  pirymidyna

• Prawdopodobieństwo transwersji jest

niższe niż tranzycji (ok. 2 krotnie więcej)
Tr/Tv >1

RYSUNEK

Mutacje punktowe -

substytucje

• Substytucje ciche (synonimiczne)

– Naturalne, „niezauważalne”, nie prowadzące

do zmiany w sekwencji aminokwasów białka

AGG  CGG (puryna  pirymidyna =

transwersja)

Arg  Arg

• Substytucje missence

– Zmiana kodowanego aminokwasu na inny
CAC  CGC (puryna  puryna = tranzycja)
His  Arg (obydwa aminokwasy są zasadowe –

nie musi prowadzić do zmiany funkcji białka)

Mutacje punktowe -

substytucje

• Substytucja nonsense

– Zmiana kodowanego aminokwasu na kodon

STOP:

• Amber (UAG)
• Opal (UGA)
• Ochre (UAA)

– Silny efekt fenotypowy
UGG (Try)  UAG
GAG (Glu)  UAG
Dojdzie do przerwania syntezy białka –

skrócone ich wersja

– Substancje mogą dotyczyć sekwencji

kodujących

Koniec syntezy
białka!

Mutacje punktowe -

substytucje

• Mogą dotyczyć obszarów

niekodujących, ale wpływających
zasadniczo na ekspresję genu:

– Obróbka RNA (destrukcja miejsca

splicingu, kopiowania, poliadenylacji…)

– Mutacje w obszarach promotorów

SNP

• SNP – single nucleotide polymorphism

(zmienność sekwencji polegająca na

zmianach pojedynczych nukleotydów)

• Marker – wykrywanie chorób

wynikających z mutacji punktowych

• 1 SNP na 300 zasad u człowieka –

zidentyfikowano ponad 10 mimionów

SNP’ów

• Zastosowanie:

– Markery genetyczne
– genotypowanie

Mutacje „frame shift”

• Indele – mutacje punktowe

(insercja/delecja) – dodanie/usunięcie
niewielkiej liczby par zasad

– Mutacje „frame shift” – zmiana ramki

odczytu – liczba nukleotydów indel jest
inne niż 3 lub nie jest wielokrotnością 3

AUA UAU AUA UAA
AUA UAU AUA UAA
AUU AUA UAU AA

Mutacje „loss or gain of

codons”

• Mutacje utraty/uzyskania kodonu

„loss or gain of codons” – liczba
nukleotydów indel jest równa 3 lub
jest wielokrotnością 3
białko straci/zyska 1 aminokws

AUA UAU AUA UAA
AUA AUA UAU AUA UAA

Mutacje chromosomowe

• Zmiany w dużych odcinkach DNA (strukturalne)

• Zmiany w strukturze lub abberacje chromosomowe

– Inwersje

– Duplikacje

– Delecje

– Translokacje

• Zmiany w liczbie chromosomów – mutacje

chromosomowe liczbowe

• Stosunkowo rzadkie u bakterii

• Triploidy, Autoallooktaploid (skompletowane kilka

genomów -truskwawki – częstsze u eukariotów)

• Np. arbuz (diploid żeński X Tetraploid męski –

wydający nasiona = triploid)

• Ewolucja pszenicy

2. Konsekwencje

fenotypowe

• Letalne
• Utraty/nabycia funkcji
• Morfologiczne
• Biochemiczne
• Ciche – kryptyczne (nic nie znaczące)

3. Warunki w których się

ujawniają

• W zależności od ich ujawniania się od

warunków, w których znajduje się

organizm:

– Bezwzględne – obligatoryjne (mają zawsze

efekt fenotypowy)

– Względne – fakultatywne – ujawniają się

tylko w pewnych warunkach np.

podwyższona temperatura

• Mutacja komórek płciowych – są dziedziczne
• Mutacja komórek somatycznych – nie są

dziedziczone, ale mogą mieć wpływ na funkcji

biologiczne organizmu nie przekazywane

potomstwu (np. zmiany nowotworowe)

4. Sposób powstawania

• Spontaniczne – powstają bez udziału

czynników zewnętrznych – tworzenie

zmienności i napędzanie ewolucji

– W trakcie replikacji w wyniku pomyłek

polimerazy

– Na skutek uszkodzenia DNA

• Indukowane – wywoływane przez

czynniki zewnętrzne mutagenne:

– Fizyczne
– Chemiczne

4. Sposób powstawania

• Mutacje spontaniczne
• Pomyłki polimeraz

– Mylą się rzadko (posiadają aktywność

korekcyjną)

1 raz na 10

7

- 10

8

nukleotydów

• Polimeraza – naprawia błędy podczas

replikacji, ale ciągle pozostaje 1

nukleotyd błędny na 10

10

– 1 błąd na 2000 podziałów E. coli – błędy to

najczęściej tranzycje

Mutacje spontaniczne

• Substytucje

• Błędy spowodowane przez poślizg polimerazy

– Tantomeryzacja zasad (występowanie zasad w formie

izomerów strukturalnych)

Izomeryzacja do formy liniowej: replikacja i błędne

parowanie C-A

– Deaminacja np. cytozyny/adeniny (zgubi resztę –NH

2

)

Cytozyna  uracyl paruje się z adeniną

Polimerazy mają aktywność korekcyjną – najczęściej to

substytucję

– Rzadziej indele i frame shift, powstają gdy matryca ma

ciąg zasad tego samego typu

• Technologia markerów satelitarnych - (ślizganie się

polimarazy – gorące miejsca mutacji) [w diagnostyce,

ocenienie zmienności materiału genetycznego]

Mutacje spontaniczne

Uszkodzenia DNA:

– Utrata zasady
– Modyfikacje zasad i deaminacje
– Chemiczne modyfikacje
– Fotouszkodzenia
– Połączenia nici DNA
– Połączenia DNA z białkami
– Pęknięcia DNA

Uszkodzenia DNA

• Utrata zasady – utrata typu „ubytki zęba”

• Depurynadcja/ depurymidynacja – uszkodzenia „ubytek zęba”

– przerwanie nici DNA

– Abasic site [zaburzenie integralności]

• Reaktywne formy tlenu (ROS)

– HO·

– O

2-

– H

2

O

2

Uszkadzaja DNA lub nekluotydy / sygnalizacja
3000-5000 uszkodzeń w komórce E. coli – 1 generacja żyje ok. 40

min)

Przykład uszkodzenia: oksydacja dGTP i dATP

dGTP  8-oxo-dGTP (adenina-8-oksoguanidyna)

8-okso-deodkyguanozynotrifosforan
dATP  2-OH-dATP (cytozyna-guanina)

2-hydroksy-deoksyadenozynotrifosforan)

Mutacje indukowane –

wywoływane przez mutageny

• Mutageny – czynnik jest mutagenny

gdy ok. 1000 razy zwiększa
częstotliwość mutacji w porównaniu z
częstością mutacji spontanicznych

• Typy mutagenów:
1.Chemiczne
2.Fizyczne

Mutacje indukowane

1. Chemiczne

– Analogi zasad (włączenie zamiast zasad w czasie

replikacji – błędne parowanie):

• Bromouracyl (5-Bromouracyl – BU) [tranzycja TA GC]
• Aminopuryna (2-aminopuryna – AP) [tranzycja AT  GC]

– Związki powodujące modyfikację zasad:

• HNO2 [tranzycja CG  AT, AT  GC]
• Hydroksyamina
• Związki alkalizujące (tworzące addukty) [metylujące i

etylujące zasady w DNA]

– EMS - etanosulfonian metylowy (metylujące i etylujące zasady

w DNA)

– MMS (metamosulfonian metylowy)

• Związki powodujące kowalencyjne połączenie zasad

Mutacje indukowane

2. Fizyczne

– Związki interkalucje z DNA

•

Barwniki akrydynowe:

–

Proflawina

–

Oranż akrydynowy

–

Akryflawina

–

Bromek etydyny

– UV

•

UV A 320-400

•

UV B 280 -320

•

UV C 200-280 (ozon je absobuje)

– Promieniowanie o wysokiej energii (α, β, ɤ,

neutrony, promieniowanie X)

Dimery timidynowe

• Tymina paruje się w pionie z sąsiadką

Test Amesa

• Sprawdzanie czy związek jest

mutagenem

• Wykorzystanie 4 szczepów

Salmonella typhinurium

Systemy naprawy DNA

1. Bezpośrednie usunięcie uszkodzenia
2. Naprawa z wycięciem zasady BER (base

excision repair)

3. Naprawa z wycięciem nukleotydu NER

(nucleotide excision repair)

4. Naprawa błędnie sparowanych zasad

MMR (mismatch repair)

5. Naprawa pęknięć 2 niciowych (na

drodze rekombinacji) (recombination

repair)

Bezpośrednie usunięcie

uszkodzenia

• Enzym fotoliza (wykorzystuje światło

do rozcinania dimerów trimidynowych)
[nie występuje u człowieka] – białko
zawiera chromofory

• Białka dealkalizujące
• MGMT – metylotransferaza RNA-06-

metyloguaniny (rozpoznaje i przekłada
resztę –CH

3

na siebie i ulega

degradacji)

Naprawa z wycięciem zasady

BER (base excision repair)

• Mutacja typu „wybicie zęba”

Glikozydy DNA – rozpoznaje uszkodzenia i

przecina wiązania N-glikozydowe między

zasadą i deoksyrybozą – usówanie

błędnej zasady i powstanie miejsca AP.

Wykonane nacięcie obok miejsca AP

przez endonukleazę AP – powstaje wolny

koniec 3’ – OH Polimeraza syntetyzuje nić

komplementarna do końca 3’-OH

wyjadając to co jest przed nią i po niej

Naprawa z wycięciem

nukleotydu NER

• Nucleotide excision repair (A, B i C)

• Białka Uvr (skanuje w miejscach

podejrzanych)

• B i C – wyjada uszkodzenia + polimeraza

 naprawa

• GGR (global genome repair) – człowiek

• Naprawa: rejony nie ulegające transkrypcji

• Nietranskrybowanie nici rejonów

ulegających transkrypcji

• Sprzężona z transkrypcją TCR

(transcription coupled repair)

Naprawa błędnie sparowanych

zasad MMR

• MMR – Mismatch Repair
• Bakterie, ssaki
• Uszkodzenia deaminacji, utleniania,

metylacji zasad, błędy w replikacji

– Mut L
– Mut S
– Mut H (bakterie) – odróżnia nić z błędnie

wstawionym nukleotydem [rozcięcie nici]

Naprawa pęknięć 2 niciowych

(na drodze rekombinacji)

• Rekombinacja (popękanie 2 nici)
• Białka BrC1 & 2 (rak piersi)

Podsumowanie

• DNA – różnego typu uszkodzenia –

naprawa na różne sposoby

• Brak naprawy = mutacja
• Defekty maszynerii naprawiającej są

związane z różnymi chorobami

Rekombinacja DNA i jej

zanaczenie

Rekombinacja

• Proces, przerwanie ciągłości ½ nici

DNA i połączenie z ½ niciowym
innym fragmentem DNA

• Technologia zrekombinowanego DNA
• Breakage and rejoining
• Podstawowa rola:

– Usówanie pęknięć w cząsteczkach DNA
– Umożliwia zmienność genetyczną

Rodzaje rekombinacji

• Homologiczna:

–

Wymaga homologii sekwencji pomiędzy partnerami o

długości rzędu 1 genu (dość długa)

–

Może zachodzić w każdym miejscu chromosomowym

pod warunkiem obecności homologicznej sekwencji

–

Całkowicie zależna od Rec A (procariota – specjalne

białko)

• Zlokalizowana side-specific

–

Zależna od miejsca, partnerzy muszą mieć

homologiczną sekwencję, ale bardzo krótką

(kilkanaście nukleotydów)

–

Nie wymaga białka Rec A, ale innych białek (np.

integralna faza λ lambda)

Rodzaje rekombinacji

• Transpozycja

– Nie wymaga homologicznej sekwencji
– Nie wymaga Rec A, ale wymaga

działania transporazy

• Nieuprawniona – illegitimate

– Wszystkie typy rekombinacji, których nie

mżna wytłumaczyć

Klasy zaburzeń

rekombinacyjnych

• Rekombinacja intermolekularna:

– Single crossover
– Double crossover

• Rekombinacja intramolekularna

(wewnątrzcząsteczkowe)

Może prowadzić do utraty genu:
1.Skierowane w 1 kierunku cząsteczkowym
2.Skierowane w przeciwne strony  może

dojść do inwersji genów

Inwersja genu lub delecji

• Rysunek

Model rekombinacji

• Holiday’a „wakacyjny”

– Zapoczątkowana przynajmniej jednym

pęknięciem w obrębie sekwencji homologicznej

każdego z parametrów (razem 2 napięciach)

– Model inwazji 2 nici DNA

• Wymiana krótkich fragmentów
Lub

• Crossing over – wymiana dużych fragmentów

chromosomów

Szlak Rec B C D (przeciąganie nici)

• A – inicjuje proces

• A i B – odpowiada za przeciąganie, kontrola

wymiany

• C – rozcina struktury Holiday’a

• Rekombinacja site-specific – integracja

faga λ

• Rysunek
• Systemy rekombinacji – trangeneza

roślin zlokalizowanej

• Cre/lox P – z bakteriofaga P1

– Usuwanie genów markerowych
– Umieszczanie transgenów w określonym

miejscu

Niehomologiczna

rekombinacja

• Generuje więcej błędów

• Kompleks KCl zabezpiecza końce i przyciąga

kolejne białka tworzące kinazę zależną od DNA

(DNA- PKcs)

• Kinaza DNA-PKcs grupuje końce DNA naprzeciwko

siebie i powstaje 1 kompleks – synapsa

• Autofosforylacja i fosforylacja białka nie wymaga

homologii

• Gdy pękną 2 nici

• Rekombinacja V(D)J związana z receptorami

układu limfatycznego. Rekombinacja pozwala na

wytworzenie licznych kombinacji miejsc

wiążących się z antygenem – zachodzi we

wczesnych etapach powstawania komórki

limfatycznych (odporność)

Transpozycja

• Wykorzystuje mechanizmy:

– Rekombinacji zlokalizowanej – site

specific

– Rekombinacji niehomologicznej - NHEJ

Podsumowanie

1. Rekombinacja zlokalizowana oraz

niehomologiczne – inaczej niż homologiczne

2. Poste systemy rekombinacji zastosowanie

znalazły w inżynierii genetycznej

3. Transpozony bakterii i eukariotów wykazują

szereg podobieństw – między innymi

posiadają odwrócone powtórzenia oraz

transpozazy

4. Rekombinacja V(D)J jest rekombinacją

fizjologiczną prowadzącą do powstania białek

receptorowych w komórkach limfatycznych

Ekspresja genów

• Odczytywanie informacji genetycznej

zapisanej w DNA:

– Transkrypcja
– Translacja

DNA– transkrypcja Pre-RNA  mRNA

– translacja  Białko – obróbka 

folding/localization submit assembly

(droga do odpowiedzi kompartmentu)

 Biological function  Propagation

Regulacja ekspresji genów

• Mechanizmy + jakie poziomy
• Znaczenie:

– Rozwój i zróżnicowanie
– Odpowiedzi na warunki

środowiskaprocesy chorobowe

– Produktywność organizmów użytkowych

Poziomy regulacji ekspresji

genów

• Transkrypcji:

– Dostęp do DNA (metylacja DNA)

– Inicjacja transkrypcji (metylacja DNA)

– Terminacja transkrypcji

• Potranskrypcyjne:

– Splicing i editing RNA (nie wycięte introny)

– Stabilność RNA

• Translacja:

– Inicjacja translacji

– Terminacja translacji

• Potranslacyjne:

– Transport białka

– Cięcie białka

– Modyfikacje potranslacyjne białka

– Degradacja białka

Wzór modyfikacji histonów

wpływa na ekspresję genów

Struktura zwarta struktura
rozluźniona

Acetylacja lizynowych reszt w ogonkach
histonów rdzeniowych prowadzi do zaburzeń
struktury przestrzennej i reguluje ekspresję
genetyczną u eukariota – umożliwia pracę
czynnikom transkrypcyjnym

Acetylacja

Deacetyla
cja

Ekspresja genów -

transkrypcja

• Przepisywanie informacji genetycznej z

DNA na RNA

• Polimeraza rybonukleotydów katalizowana

przez RNA zależną od DNA, która łączy się

z DNA w rejonie zwanym promotorem

• Prowadzi do utworzenia RNA o sekwencji

komplementarnej do matrycowej nici DNA

• Etapy:

– Inicjacja

– Synteza RNA

– Terminacja i obrobka transkryptów

Transkrypcja

• Zachodzi na matrycy 1 niciowej DNA
• Syntetyzowana w kierunku 5’  3’
• 1 nukleotydem na końcu 5’

transkryptu jest Bpi

• Do inicjacji transkrypcji nie jest

wymagany starter, ale białka inicjujące
transkrypcję (zdolność współdziałania
z DNA – specyficzna budowa)

Białka wiążące z DNA

• Czynniki transkrypt kontynuujące

ekspresjęgenów

• Wiążą się z obszarem promotorowym – cis –

regulatorowym

• Białka posiadają charakter domeny
• Domena typu helisa-skręt-helisa (HTH)

– Np. posiadają represor laktozowy

• Wpasowują się w duży rowek DNA
• Domen homeostatyczna (np. białka

odpowiedzialne za rozwój kwiatów)

– Mutacje hometyczne

Palce cynkowe

• Ok. 1% genów koduje białko z tą

domeną

• Euraryota

Etapy transkrypcji

• Inicjacja – rozpoznawanie sekwencji

cis-regulatorowej

• Kompleks transkrypcyjny

Polimerazy RNA zależne od

DNA

• Procariota 1-na na wszystkie geny
• Eucaryota:

– Pol. RNA I (geny kodujące 28S, 18S rRNA)
– II (geny kodujące białka
– III (geny kodujące tRNA 5 sRNA, U6 – sn RNA,

małe jąderowe RNA i mała cytoplazma RNA)

– Polimeraza mitochondrialna (podobna do

fagowej) [geny mitochondrialne]

– Polimeraza chloroplastowa (geny

chloroplastowe) [podobna do bakteryjnej]

Transkrypcja u procariota i

eucariota

• Procariota:

– Brak kompartmentacji etapów procesu

– Bezpośrednio się wiążą *

– Promotory bardzo proste z miejscami

konserwatywnymi (TSS – miejsce rozpoczęcia

transkrypcji)

• Eucariota:

– Więcej check pointów

– Powstałe platformy białek (czynniki transkrypcyjne)

[dłuższe, bardziej rozbudowane]

– Promotory bardziej złożone i inne dla poszczególnych

genów i polimeraz

• *Polimerazy RNA wiążące się specyficznymi

sekwencjami DNA –promotorami

TATA box (polimeraza II)

• Rozplontanie 2 niciowego DNA aby

mogła zajść transkrypcja

• 1 miejsce konserwatywne ale

dowolność w miejscach
regulatorowych

Inicjacja transkrypcji

1. Zamknięty kompleks promotorowy
2. Otwarcie kompleksu promotorowego

– rozplecenie DNA

3. Rozpoczęcie syntezy
4. Ruch kompleksowy – opuszczenie

promotora, synteza RNA

• Modułowa budowa promotorów –

różnorodność elementów cis-
regulatorowych (specyficzne
eksprymowanie różnych genów)

• Znaczenie dalej położonych sekwencji

enhancerów rozpoznawanych przez
białka aktywatorowe

• Rejon odległy dzięki wyginaniu DNA

może wpływać znacznie…

Regulacja inicjacji

transkrypcji

• Geny konstruktywne
• Geny indukowane

Transkrypcja u Procariota

• Polimeraza DNA

– Tylko 1
– Holoenzym z 5 podjednostek i czynnika σ
– Metaloenzym zawierający 2 atomy cynku

związane z rdzeniem

• Regulacja na poziomie inicjacji

– Struktura promotora i czynniki σ

(załadowane polimerazą)

– Alternnatywne
– Awaryjne – inne sekwencje i położenie boxów

Operon laktozowy

• Operatorowe sekwencje – blokowanie

transkryptu rozpoczętej na
promotorze

• Operator (DNA) i represor (białka)
• Obecnośćlaktozy indukuje ekspresję

operonu lac

• Blokowanie laktozy jeżeli mamy coś

lepszego w środowisku niż laktoza

Operon tryptofanowy

• Operon i represor – obecność

tryptofanu

• Reprymuje ekspresję operonu
• Gdy brakuje – represor bez tryptofanu

nie potrafi zablokować transkrypcji

• Reguluje ekspresję kilku genów –

Regulon [zbiór genów kontrolowanych
na 1 sposób]

Inicjacja transkrypcji

1. Szczególna rola i specyficzne właściwości

białek wiążących się z DNA

2. Typy polimeraz DNA – 1-na u procariota,

3+2 u eucariota

3. Promotory – specjalne sekwencje DNA w

obrębie których powstaje kompleks

transkrypcyjny

4. Regulacja inicjacji jest podstawowym

sposobem kontroli ekspresji genów

5. Można wyróżnić różne sposoby regulacji

inicjacji (białka represorowe, aktywatorowe)

Synteza RNA u Eucaryontów

Transport mRNA

• Transkrypcja NIE JEST sprzężona z

translacją

• mRNA (jądro)  cytoplazma
transkrypcja translacja
• Synteza RNA:
1.Polimeraza RNA (miejsce start)
2.Transkrypcja

• Wytwarzanie czapeczki CAP –

powstaje gdy koniec 5’ opuści
kompleks transkrypcyjny

– Posiadają transkrypty syntezy przez

Polimerazę II RNA

– Odgrywa znaczną rolę w inicjacji

translacji

• Dołączenie GTP (Gppp) + Metylacja

• Terminacja syntezy mRNA jest związana z

poliadenylacją
poliadenylacja – polimeraza Poli (A)

– „ogon” poli A jest związany z inicjacją translacji
CPSF i CSTF (Białka związane z Poly (A)) – dodaje

ciąg adenin (ogon) [łatwo wyławianle

konkretne RNA dzięki ogonkowi]

• Wycinanie intronów – splicing

Splajsosomy – białka +

RYSUNEK

• Korpus składający RNA tworzy małe

jądrowe sn RNP rybonukleoproteiny

– Intron  degradacja

• Alternatywny splicing

– Omijanie/pozostawianie egzonu
– Wycięcie/pozostawienie intronu
– Wybór egzonu początkowego
– Wybór egzonu kończącego

• Editing – redagowanie niektórych

transkryptów

• Deaminacja cytozyny  uracylu

(powstawanie kodonu stop)

• Apolipoproteina (u człowieka)
• Rośliny – geny mitochondrialne i

chloroplastowe

• Regulacja transkrypcji – kodon Stop
• Degradacja RNA – Degradosom

(przyczepia i tnie) – tylko to co
niepotrzebne

• Zachodzi, gdy zlikwidowany zostanie

ogon i czapeczka

Interferencja DNA

• Interferencja DNA (Fire, Mello 1998 Nobel) –

włączanie genów za pomocą zróżnicowanych

fragmentów RNA

– Stary mechanizm wyciszania genów oparty o

homologię sekwencji

– Odgrywa istotną rolę w obronie przed wirusami oraz

regulacji rozwoju (miRNA)

– Jest inicjowana przez 2 niciowe RNA które inicjuje

specyficzną degradację transkryptów (negatywna)

– Może być wykorzystana do ukierunkowanej

mutagenezy prowadzącej do obniżenia poziomu

ekspresji danego genu

– Daje możliwość specyficznego włączenia genów

• Końcowym efektem ekspresji genów jest zestaw

funkcjonowalnych białek w komórce – Proteom

• Ilość i rodzaj białek w komórce odzwierciedla

równowagę pomiędzy syntezą nowych białek,

degradacją już istniejących

• Waiłow badał zmieniające się w wyniku

modyfikacji chemicznej oraz innych obróbki

białek

• Dzięki połączeniu procesów syntezy,

degeneracji i modyfikacji dostosowują się do

zewnętrznych wymagań komórki i odpowiedzi

na czynniki zewnętrzne

Translacja – ostatni etap

ekspresji informacji

genetycznej

• Synteza białka na matrycy mRNA
• Rybosomy
• Za interpretację kilku genów –

odpowiadają tRNA

Kod genetyczny

• Kod 1 nukleotyd 4 aminokwasy
• Kod 2 nukleotydy 4

2

=16

aminokwasów

• Kod 3 nukleotydy 64 aminokwasy
• Kod trójkowy gwarantuje unikalność

niezbędną do kodowania 20
aminokwasów

Odkrycie kodu

genetycznego

• 1961 – Nirenberg i Khorana

• Bezkomórkowy system translacji i syntezy mRNA
1.

Trójkowy – 3 sąsiadujące ze sobą nukleotydy

(kodon) – określają aminokwasy

2.

Nie jest zachodzący na siebie

3.

Nie ma znaków przystankowych

4.

Kodonem start jest ATG (AUG)

5.

Stop kodonem jest TAA, TGA, TAG

6.

Jest odczytywany od ściśle określonego miejsca

7.

Odczyt ma sens tylko w 1-nym kierunku

8.

Jest zdegradowany – niektóre aminokwasy są

kodowane przez więcej niż 1en kodon

9.

Jest uniwersalny od wirusów do czlowieka

Odstępstwa od kodu

uniwersalnego

• Rzadkie
• Biosynteza w mitochondriach
• Rozchwianie kodu out of Tree – 2

zasady zamiast 3

tRNA i amninoacylacja

• Elementy struktury tRNA:

– Ramie akceptorowe

– Ramię D – zawiera dihydrourynę

– Ramię antykodonowe

– Pętla zmienna

– Ramię Tψc zawiera pseudoourydynę

• 73-93 nukleotydy

• 50-60 typów tRNA w komórce

• Podobne do siebie

• Posiadają nietypowe zasady od 7-13 na 1 cząsteczkę

na ramieniu Tψc

• Ma strukturę trójwymiarową

• Litera L – wynik odziaływania ramienia D i Ramię Tψc

(unoszą do góry i zaczepiają – tworzą się wiązania)

Aminoacetylacja

• „załadowanie” odpowiedniego

aminokwasu na tRNA

• Synteza aminoacetylo – tRNA

– Dołączenie do końca 3’ –CCA OH
– Energia z ATP
– Syntetazy rozpoznają różne elementy

cząsteczki tRNA

– Wysoka specyficzność w stosunku do

tRNA

– Aktywność korekcyjna

Rybosomy

• Średnica 20 mm
• W każdej komórce (+ mitochondria +

chloroplast – podobnie do
bakteryjnych)

• Zbudowane z podjednostek (większa

i mniejsza)

• Kompleks białkowo-nukleinowy
• rRNA + bialka

Skład

Podjednostka

Procariota

Eucariota

Duża

50S

60S

23 S 5SrRNA

28S, 5S I 5,8 SrRNA

35 białek

49 białek

Mała

30S

40S

16S rRNA

18SrRNA

21 białek

33 białka

Rybosom

70S

80S

Rybosomy

• Składają się:

– 2/3 z RNA

– 1/3 z białek

• 1-yńcza komórka zawiera tysiące rybosomów

• Są RYBOZAMI! (zachowują się czasami jak

enzymy)

• Funkcje:

– Jednostka dekodująca, przepisująca kod zapisany

w mRNA na sekwencję białka (mniejsza

podjednostka)

– Aktywność transferazy peptydylowej, katalizatora

wiązania peptydowego (duża podjednostka)

– Mikroautomatch (??) przemieszcza się wzdłuż

łańcucha mRNA i przepuszczając go przez siebie

koduje cząsteczki mRNA

• Struktura 2-rzędowa rRNA – seria szpilek do włosów

– Ok. 70% części rRNA występuje w postaci sparowanych

odcinków

– 30% części nie sparowane – rozrzucone

• Określona struktura przestrzenna (narzucenie kształtu

przez sekwencję)

• Struktura 3-rzędowa + RNA rybosomów 70S

• 16S = 1542 nukleotydy

• 5S = 120 nukleotydów

• Białka pełnią rolę ochronną – pancerzyk, który chroni rRNA

• rRNA decyduje o kształcie białka rybosomów „inkrustują”

rRNA

• Większość zasadowe:

– RPS – białka rybosomalne małej podjednostki

– RPL – białka rybosomalne dużej podjednostki

Translacja

• Reakcja enzymatyczna – wytworzenie

wiązania peptydowego

• Rybosomy – funkcja porządkująca

(ustawienie cząsteczki w jednej właściwej

pozycji zapewniającej zajście reakcji)

• W biosyntezie białek uczestniczy kilkadziesiąt

składników mało i wielkocząsteczkowych

• Aktywowane grupy karboksylowe estryfikują

wolne grupy aminowe – potrzebna jest

energia do aktywacji grupy karboksylowych

Synteza polipeptydów

• mRNA odczytywanie zawsze w

kierunku 5’ (NH3) 3’ (COOH)

• Inicjacja translacjacji u Procariota:
1.Inicjacja
2.Elongacja
3.Terminacja

Procaryota

• Utworzenie kompleksu rybosomu na mRNA
• Czynniki indukujące IF1, IF3 wiążą się do

podjednostki 30S rybosomu

• IF2 wiąże się z GTP i inicjatorowym tRNA

(fermylometionylo – tRNA) a następnie
kompleks wiąże się z kodonem start w
mRNA

• Przyłącza się podjednostka 50S powstaje

czynny rybosom 70S – czynniki IF są
uwalniane

• Zawiera 3 miejsca wiązania aminoacylo-tRNA

rybosomu

• Mała podjednostka – wiązanie mRNA

• Duża podjednostka – katalityczna

• Miejsce:

– A – aminoacetylowe

– P – peptydylowe (łańcuch peptydowy)

– E – wyjście – exit

• Elongacja transkrypcji:

– Wejście aminoacylo-tRNA do miejsca A

– Tworzenie wiązania peptydowego (czynnik białka

EF-Tu)

– Translokacja rybosomu przesunięcie o 3

nukleotydy (czynnik EF-G)

Terminacja translacji

• Wyznacza kodon stop

• Rozpoznają przez białka czynników uwalniających

• Następuje dysocjacja rybosomu

• Polisomy – wiele rybosomów może wiązać się do

tego samego mRNA

• Białko z Ricinus Comunis – białka inaktywujące

rybosom

• Antybiotyki hamujące syntezę białek:

– Streptomycyna (wiąże się z podjednostką 30S i

hamuje inicjację translacji oraz błędne odczytywanie

mRNA)

– Tetracyklina, chloramfenicol, erytromycyna,

cykloheksymia

Translacja u eukaryota

(cytoplazmatyczna)

• U roślin ok. 75% białek

syntetyzowane w cytoplaźmie

• 20% w chloroplastach
• 2-5% w mitochondriach
• Struktura eukariotycznego mRNA
• Mechanizmy translacji u eucaryota:

– Udział czapeczki i ogona poliA i

skanowanie w poszukiwaniu kodonu start

– Mechanizm stresowy: elementy IRES…

Cykl życiowy białka

• Polipeptydy:

– Struktura 3D

– Obróbka proteolityczna (np. odcięcie

sygnalizacji)

– Modyfikacje chemiczne

– Inteisn splicing - inteiny (usuwanie nietypowych

fragmentów)

• 2 klasy chaperonów:

– Hsp 70 – chaperoniny, białka PDI (lokalnie

odziaływują z białkiem już na etapie syntezy –

chronią przed przypadkowym składaniem się

obszary hydrofobowe

– … dziłają później i wymagają ATP

• Obróbka proteolityczna białka

– Preproinsulina

• Transport bialek

– Regulacja
– Kierowanie się do odpowiednich

kompartmentów

• Sekwencja sygnałowa w białku
• Modyfikacje potranslacyjne białek

Degeneracja białek

• Regulacja strukturalności bialek

– Przyłączenie UBIKWITYNY

• Sekwencja degradacji
• Przyłączenie
• Degradacja – proteasom

• Degradacja białka – Proteasom

(śmietnik)

Regulacja ekspresji genów na

poziomie translacji i

potranslacyjnie

• Inicjacja translacji
• Transport białka
• Cięcie białka
• Modyfikacje potranslacyjne bialka
• Degradacja bialka

Podsumowanie

1. Ekspresja genów – regulowana przez

szereg procesów na wielu
poziomach

2. Najważniejsze poziomy:…
3. …