Regulacja białka supresorowego nowotworów p53.
Mutacje w genie p53 ograniczającym raka powodują ok. 50% nowotworów u ludzi, czyniąc z niego najczęstszy obiekt zmian genetycznych w nowotworach. Takie mutacje prawdopodobnie ułatwiają kancerogenezę głównie przez wyeliminowanie aktywności dzikich typów białka p53 ograniczającej rozwój nowotworu, chociaż przynajmniej kilka form białka p53 powiązanych z mutacją może przyczynić się do ujawnienia aktywności onkogennej. Nadmiar aktywności dzikiego typu białka p53 powoduje wzrost różnorodności odpowiedzi komórkowej, głównie przez wstrzymanie cyklu komórkowego i apoptozy. Te komórkowe efekty działania dzikiego typu p53 mogą zmniejszyć występowanie nowotworów przez eliminację z puli replikacyjnej komórek podatnych na raka. Jednakże, takie efekty mogą być niepożądane jeśli występują w zdrowych komórkach, dlatego aktywność białka p53 musi być utrzymywana pod ścisła kontrolą i uwolniona wyłącznie, gdy w komórkach gromadzą się uszkodzenia, które mogą prowadzić do zmian nowotworowych. Te sygnały i mechanizmy regulujące aktywność p53, utrzymujące go na stałym i niskim poziomie podczas normalnych warunków oraz aktywujące go w komórkach podatnych na raka, są obiektem badań.
p53 - sygnały aktywacji.
W normalnych warunkach p53 jest najprawdopodobniej utajone. W konsekwencji nie koliduje z postępem cyklu komórkowego i przetrwaniem komórek. Co więcej, p53 pojawia się u myszy ze zmutowanymi genami w większości przypadków, aby przeszły one właściwy rozwój i dojrzewanie, co sugeruje, że p53 nie jest niezbędny przy prawidłowym funkcjonowaniu. Jednakże różnorodne warunki mogą prowadzić do nagłej indukcji aktywności p53. Powszechnym mianownikiem tych warunków jest to, że reprezentują różny typy stresu, które, co jest wysoce prawdopodobne, umożliwiają pojawienie się komórek związanych z rakiem. Takie warunki włączają bezpośrednie uszkodzenie DNA, jak również zniszczenie składników zaangażowanych w prawidłową manipulację i segregację komórkowego materiału genetycznego (np. wrzeciono mitotyczne), opuszczenie rybo nukleotydu, hipoksję, szok cieplny i ekspozycję na tlenek azotu (NO). Akumulacja genomowych aberracji jest kluczem mechanizmu kancerogenezy; nagła indukcja aktywności p53 w odpowiedzi na uszkodzenie genomu służy zapewnieniu komórką które takie uszkodzenie poniosły efektywnej opieki. Ponadto p53 może także przyczyniać się bezpośrednio lub pośrednio do szczególnego procesu naprawy DNA. Kluczowa rola p53 w utrzymaniu integralności genomu zasłużyła na przydomek `strażnika genomu'. W dodatku aktywność p53 jest wywoływana przez różnorodne onkogenne białka włączając Myc, Ras, adenowirus E1A i β-kateninę, co udowadnia bezpośredni związek między onkogenicznymi procesami a aktywnością p53 hamującą rozwój nowotworu.
Regulacja ekspresji genu p53.
Jak zostało to opisane, indukcja odpowiedzi p53 na stres pojawia się głównie poprzez kolejne zmiany w białku p53. Zmiany w tempie transkrypcji genu p53 odgrywają główną rolę, o ile w ogóle, w takiej indukcji. Wskutek tego regulacji transkrypcyjnej genup53 poświecono bardzo mało uwagi w czasie ostatnich lat. Nie znaczy to jednak że regulacja tego genu jest zupełnie nieistotna. Faktem jest, że dawno już zaobserwowano że poziom p53 mRNA znacząco rośnie po stymulacji surowicą. Wzrost ten może być spowodowany obecnością miejsc wiążących surowicze czynniki indukcyjne w promotorze p53, tak jak i zdolnością genu p53 do wiązania białka c-Myc oraz stymulacji transkrypcji poprzez wzrost c-Myc. Indukcja antyproliferacyjnego genu p53 poprzez surowicę i czynniki wzrostu może początkowo wydawać się paradoksalna, jednakże ma to sens. Komórki ulegające replikacji i dużej proliferacji są narażone na większe ryzyko uszkodzenia DNA oraz zwiększenia rozmnażania komórek potomnych pro-onkognennych w porównaniu do komórek nieaktywnych. Redukcja wyższego poziomu p53 w takich warunkach pozostawia komórki w stanie oczekiwania (spoczynku), tak długo jak nie wystąpią żadne uszkodzenia DNA, bądź nie zadziałają inne uszkadzające czynniki (stres). p53 pozostaje w stanie uśpienia i nie oddziałuje z normalnymi komórkami. Jednakże w warunkach wymagających odpowiedzi p53 obecność wyższego poziomu p53 mRNA zapewnia, że odpowiedz taka będzie szybka i efektywna.
Aktywacja post-transkrypcyjnego mechanizmy p53.
Ekspozycja komórek na aktywujące sygnały p53 może w dość krótkim czasie prowadzić do znaczącego wzrostu poziomu białka p53. W pewnej mierze może to być osiągnięte poprzez wzrost translacji p53 mRNA, prawdopodobnie pociągający za sobą spadek translacyjnego mechanizmu hamującego, który działa poprzez 3'-nietranslacyjny region tego mRNA. Istnieją również dowody na to, że białko p53 samo w sobie może hamować swoją syntezę poprzez wiązanie się do jego własnego mRNA. Dotychczas, ogólnie uznawane jest, że akumulacja aktywnego p53 w odpowiedzi na stres pojawia się głownie w post-tranlsacyjnych mechanizmach. Najbardziej znaczący jest wzrost w okresie półtrwania p53. p53 jest zazwyczaj bardzo niestałym białkiem, które charakteryzuje się okresem pół trwania czasmi tak krótkim jak kilka minut. W odpowiedzi na uszkodzenie DNA i inne rodzaje uszkadzających czynników (stresu) p53 jest znacząco stabilizowany. Gwałtowny wzrost stężenia p53 bez potrzeby przeprowadzania transkrypcji de novo jest w szczególności korzystny w komórkach z ciężkimi uszkodzeniami genomu. Dodatkowo, prawdopodobna jest konwersja jakościowa p53 z formy utajonej do aktywnej. Najlepsza udokumentowana zmiana dotyczy aktywności wiążącej specyficzne sekwencje DNA przez p53. p53 działa jako specyficzny genowo aktywator transkrypcyjny, którego działanie polega na jego zdolności do wiązania określonych uporządkowanych (kolejnych) elementów w określonych (docelowych) genach. Aktywność wiązania specyficznych sekwencji DNA przez p53 jest obiektem ustalonej negatywnej regulacji głównie przez jego inhibitorową C-terminalną domenę. Zmniejszenie tej inhibicje na narażenie na stres objawia się wzrostem wiązania DNA i konsekwentnym wzrostem biochemicznej i biologicznej aktywności. Transkrypcyjna -aktywność p53 może być również zaindukowana przez zmiany w innych regionach np. modyfikacje w jego N-terminalnej domenie transaktywnej, co nie zezwala na bardziej efektywną rekrutację komponentów maszynerii transkrypcyjnej. W końcu, aktywacja p53 może także pociągać za sobą zmianę w lokalizacji subkomórkowej. Jednakże uśpienie p53 może być często cytoplazmatyczne, przynajmniej podczas części cyklu komórkowego, ekspozycja na stres objawia się jego akumulacją w jądrze, gdzie oczekuje się stosowania jego biochemicznych aktywności.
Pętla p53-Mdm2.
Kluczowym czynnikiem regulującym p53 jest białko Mdm2. Mdm2 jest produktem onkogenu, którego zwiększona aktywność występuje w wielu typach nowotworów.Mdm2 wykazuje unikalną relację z p53. Z jednej strony białko Mdm2 wiąże się z p53 i inaktywuje je. Wiązanie tworzy się dokładnie w domenie transkrypcyjnej p53, nakładając się z gromadzeniem składników podstawowego kompleksu transkrypcyjnego. Ponadto Mdm2 aktywnie hamuje transkrypcję gdy jest połączony z p53. Co ważne, wiązanie Mdm2 może prowadzić do kompletnego wyeliminowania p53 przez proteolityczną degradację. Z drugiej strony, p53 łączy się specyficznie z genem Mdm2 i stymuluje jego transkrypcję. Ta dwoistość określa pętlę negatywnego sprzężenia zwrotnego, które prawdopodobnie służy do utrzymania p53 pod ścisłą kontrolą i terminowania sygnału p53, kiedy czynnik stresowy został zneutralizowany. W niektórych sytuacjach transkrypcja Mdm2 jest indukowana później niż innych genów docelowych p53; to może utworzyć przestrzeń czasową, w której p53 może swobodnie wywierać swoje biochemiczne i biologiczne efekty. Krytyczną ważność pętli p53-Mdm2 najlepiej ilustruje analiza myszy pozbawionych genu Mdm2. Inaktywacja tego genu objawia się wczesną śmiertelnością embrionów, lecz można temu całkowicie zapobiec przez równoległą inaktywację p53. Nie jest wykluczone, że pod nieobecność funkcjonalnego białka Mdm2, p53 staje się tak rozregulowane , że jego nadmierna aktywność prowadzi do śmierci embrionu. Druga strona medalu ujawnia się w konkretnych przypadkach nowotworów u ludzi; zwiększona ekspresja Mdm2 uzyskana poprzez amplifikację genu lub inny mechanizm, może prowadzić do selektywnej inhibicji p53 i poprzez to przyczynia się do powstania nowotworu bez potrzeby wprowadzenia zmiany w genie p53 samym w sobie. Należy jednakże mieć na uwadze iż zwiększona ilość Mdm2 może niezależnie od p53 prowadzić do nowotworów.
Regulacja degradacji białka p53.
Większość aktywacji p53 jest osiągana poprzez stabilizację cząsteczki tego białka. To odkrycie znacząco przyspieszyło badania nad degradacją p53. Teraz jest powszechnie wiadomym, że szybka degradacja białka zachodzi poprzez ścieżkę ubikwityna-proteosomy, jednakże rola innych enzymów proteolitycznych takich jak kalpaina (`calpain') została również wspomniana. Mdm2 odgrywa tutaj również kluczową rolę. Podwyższony poziom Mdm2 objawia się nagłą degradacją p53 co jest zależne od zdolności tych dwóch białek do angażowania się w bezpośrednie wiązanie. Ponadto, nakładanie się wiązania p53-Mdm2 z przeciwciałami monoklinalnymi lub konkurencyjnymi białkami objawia się znaczną stabilizacją i akumulacją p53 w niepobudzanych komórkach. To się silnie kłóci z tym, że niskie podstawowe poziomy p53 są w tych komórkach głównie ze względu na ciągłą pobudzaną przez Mdm2 degradację.
Jak Mdm2 przyczynia się do degradacji p53? Kiedy proteolityczna aktywność proteasomu jest blokowana przez specyficzne inhibitory, nadmiar Mdm2 zwiększa akumulację zubikwitynowanych form p53, co sugeruje, że Mdm2 ułatwia ubikwitynację p53. Mocna podpora dla tego wniosku została ukazana przez pokazanie, że Mdm 2 może bezpośrednio funkcjonować in vitro jako p53-specyficzna E3 ligaza ubikwityno-proteinowa, która kowalencyjnie łączy grupy ubikwityny do p53. Pozostaje do sprecyzowania czy Mdm2 funkcjonuje sam in vivo czy też jest częścią większego kompleksu E3.
Choć Mdm2 ujawnia się jako klucz regulacji stabilności p53, inne mechanizmy ubikwitynacji i degradacji p53 także istnieją. Przedmiotem zainteresowania jest możliwa rola c-Jun N-końcowej kinazy (JNK); badania in vitro i in vivo sugerują, że wiązanie JNK do p53 skutkuje ubikwitynacją i proteolitycznym usunięciem p53. „Podział pracy” między Mdm2 i JNK jest obecnie niejasny, jednakże są wyraźne wskazówki, że zmienia się podczas cyklu komórkowego
Kowalencyjne modyfikacje p53.
Szybka posttranslacyjna aktywacja białek sygnałowych jest często osiągana poprzez kowalencyjne modyfikacje, w szczególności fosforylacja białek. Jest to zatem możliwe do zaobserwowania, ze wszystkiej stabilizacji aktywizacji białek p53 pod wpływem stresu, także bierze udział modyfikacja kowalencyjna wywołana przez stres. Rzeczywiście to przypuszczenie jest oczywiste. P53 stają się ufosforylowane w wielorakich (wielu) miejscach in vivo, w odpowiedzi na wiele typów stresu i wielu kinaz aktywowanych przez stres może ufosforylować p53 in vitro. Potencjalnym rezultatem takich fosforyzacji może być stabilizacja p53 przez inhibinę ubikwitynacji degradacji p53. Mdm2 w tych procesach sugeruje kilka scenariuszy
Np. 1 z nich to degradacja która wymaga wiązania Mdm2 do p53, fosforylacja reszt zlokalizowanych wewnątrz w pow. wiązania którejkolwiek z protein może zakłucać łączenie i prowadzić do stabilizacji p53. W przypadku p53, kilka kandydujących miejsc wewnątrz jego domeny wiążącej Mdm2 zostało zidentyfikowanych które (miejsca) są modyfikowane w odpowiedzi na uszkodzenie DNA i których fosforylacja redukuje powinowactwo Mdm2 do p53. Szczególnie interesujące są seryny 15 i 20, treonina 18 ludzkiego p53, wszystkie zlokalizowane są wewnątrz lub bardzo blisko domeny wiążącej Mdm2 białka p53. Seryna 15 była badana szczególnie dogłębnie jako miejsce fosforylacji p53 przez kinazę ATM, której aktywność jest wymagana do stabilizacji p53 w odp na promieniowanie jonizujące i kilka innych typów uszkodzenia DNA. Trzeba notować, że takie przypadki fosforylacji są odpowiedzialne za stabilizacje p53 chociaż wydaje się bardzo prawdopodobne, że ich znaczenie dla organizmów in vivo zostało ostatnio zakwestionowane. W związku z tym wpływ fosforylacji p53 na stabilność może zależeć od wewnątrzkomórkowego kontekstu, a w szczególności od dostępności alternatywnych mechanizmów p53. Stabilizacja p53 może być osiągnięta przez modyfikacje niż białko p53 ale także Mdm2. W prostym przypadku (scenariuszu) Mdm2 może stać się ufosforylowane w sposób który zakłuca jego interakcje z p53. W rzeczywistości miejsca kandydujące do fosforylacji wewnątrz Mdm2 zostały opisane. Alternatywnie, ufosforylowane Mdm2 może zachować/trzymać wiązanie p53 ale zostaje ono osłabione w odniesieniu do aktywności ligazy ubikwitynowej E3. Może to w szczególności stosować się do Cterminalnej część Mdm2, wiadomo, że niezbędnej do ubikwitynacji p53 (61, 78). Wreszcie, zarówno p53 i Mdm2 może również podlegać innym rodzajom modyfikacji.
Na koniec trzeba stwierdzić, że oba białka p53 i Mdm2 mogą być także przedmiotem do różnych typów modyfikacji. Acetylacja p53 prowadzi do wzrostu połaczeń DNA i to było dobrze udokumentowane. Glikozylacja p53 była także dobrze odnotowana i to może także powodować wzrost DNA. Rola kowalencyjnych w aktywacji p53 przez stres pozostaje jednakże najtudniejszą płaszczyzną badań.
W dodatku odnośnie modyfikacji kowalencyjnych, interakcje białko-białko, również grają kluczową rolę w reglacji poziomu komórkowego p53 i aktywności. Takie interakcje i ich implifikacje są przedmiotem licznych badań i niemożliwe jest, aby je omówić całkowicie. Czytającego ten artykuł odsyła się do wybranych, ostanich rozdziałów.
Połączenie ARF.
Zdolność Mdm2 żeby zainicjować ubikwitynację p53 może być modulowana nie tylko przez kowalencyjne modyfikacje, ale także przez wiązanie z innymi białkami regulatorowymi.
Najbardziej wyraźnym, ale także prawdopodobnie najważniejszym przykładem tego jest białko ARF. To małe białko powstaje poprzez translację alternatywnej ramki odczytu z genu supresorowego nowotworu INK4A.
Co należy odnotować, ARF łączy się z Mdm2, żeby pomniejszyć zasięg do białka p53 i to połaczenie zapobiega pośredniczeniu Mdm2 w proteolizie p53, najwyraźniej przez blokowanie ligazy E3 aktywowanej przez Mdm2.
Interakcja pomiędzy Mdm2 i ARF jest jednkże innym atrakcyjnym pretendentem dla regulacji przez sygnały stresu.
p53 i stres onkogeniczny.
Szczególnie interesująca jest aktywacja odpwiedzi p53 przes stres onkogeniczny, taki jak rozregulowanie ekspresji ankoprotein t.j adenowirusa E1A, Ras, Myc i beta-kateniny. Chociaz ważność tej odpowiedzi w stlumieniu guza jest bardzo oczywista, jej biochemiczna podstawa zostala nieznana az do odkrycia ARF i jego roli w stabilizacji p53. Ostatnie pracy ujawilny ze nadmierna aktywność kilku onkoprotein prowadzi do masywnej indukcji ARF. Głowna przyczyna tej indukcji jest wzmocniona transkrypcja ·ARF, która jest ułatwiona przez transkrypcje E2F. Indukowane białko ARF wiąże się do Mdm2, zapobiegając ubikwitynizacji i degradacji bialka p53. Oczywiście efekt hamujący p53 nie jest aktywowany kiedy białko Myc i Ras sa rekrutowane jako część prawidłowo utworzonej reakcji na czynnik wzrostu zainicjowanej przez przyłączenie czynnika wzrostu do jego receptora, w przeciwnym razie takie komórki nie byłyby w stanie dzielić się. Pytanie które nasuwa się na myśl, to jak p53 odnajduje się pomiędzy prawidłowa aktywacja Ras, Mys E2F a ta która zachodzi niezależnie od prawidłowego czynnika wzrostu i może prowadzić do raka ? Jedna możliwa różnica może leżeć w bardziej przewrotnej naturze aktywacji, w pierwszym przypadku jednakże to jest także do wyobrażenia kiedy kom. jest narażona na czynnik wzrostu, jedna strona prowadzi do nautralizacji p53 a w tym samym czasie następuje aktywacja Myc, Ras, E2F przez inna stronę. Wsparcie do tego pojęcia pochodzi z obserwacji, ze czynnik t.j czynnik wzrostowy fibroblastow i czynnik wzrostowy1 isulino zależny zwiększają regulacje Mdm2 i hamują aktywacje p53. Ten mechanizm może także przyczynić się do anty-apoptotycznej aktywności tych czynników. W innych przypadkach, sygnały generowane przez receptory mogą działać hamująco na p53 który znosi swoje działanie komórkowe bez naruszania jego struktury. P53 może odpowiadać na mnóstwo czynników stresu. Ta wszechstronność jest zapewniona przez zawilą regulacje która pozwala na zebranie sygnałów z wielu różnych scieżek sygnałowych.
.