Mechanizm zapobiegający skracaniu chromosomów

Chromosomy nie ulegają skracaniu dzięki syntezie sekwencji telomerowych. 5’ – C_(1-8) T_(0-1) A _(0-4) – 3’

Większość telomerowego DNA ulega kopiowaniu w prawidłowym procesie replikacji. Jednakże w celu uzupełnienia braków stwarzanych przez proces replikacji, telomery są wydłużane w niezależnym procesie syntezy, katalizowanym przez enzym telomerazę.

Telomeraza – duży nukleoproteid zawierający białko (odwrotną transkryptazę) i krótką cząsteczkę RNA, której sekwencja w części jest komplementarna do powtarzających się sekwencji w telomerach. RNA działa jako matryca do syntezy powtórzeń tych sekwencji na wystającym końcu 3’, a synteza przebiega w powtarzających się cyklach wydłużania (polimeryzacji) i translokacji.

Sekwencje nukleotydowe powtarzających się odcinków telomerowego DNA

Nazwa gatunku	Sekwencje powtarzalnych odcinków DNA (5’ -> 3’)
Tetrahymena pyriformis	C(4) A(2) ...
Saccharomyces cerevisiae	C(2-3) A(CA) (1-3)
Arabidopsis thaliana	C(3) TA(3)
Homo sapiens	C(3) TA(2)

Starterem jest końcowa sekwencja telomeru pozostałego z poprzedniego cyklu replikacyjnego. Enzym dołącza się do końca chromosomu, wykorzystując końcową trójkę nukleotydów i dołącza kolejne nukleotydy aż do wypełnienia matrycy. Po odłączeniu telomerazy brakująca nić jest doreplikowywana w sposób semikonserwatywny.

Długość telomerów jest prawdopodobnie regulowana przez białka wiążące telomery DNA (TBP – telomere binding proteins). Aktywność telomerazy ulega represji, gdy odpowiednia ilość cząsteczek TBP przyłączy się do telomeru.

Wolny koniec telomeru, zawierający powtórzenia sekwencji guaninowych, ulega zwinięciu w strukturę „szpilki do włosów” przez wytworzenie nietypowych wiązań wodorowych między parami G-G.

Struktury są niedostępne dla nukleaz i stanowią zabezpieczenie końców chromosomów przed degradacją.

Uszkodzenia i naprawa DNA

Uszkodzenie DNA jest to zmiana jego prawidłowej budowy chemicznej lub struktury fizycznej. Może powstać w wyniku błędów w procesie replikacji, ale także na skutek działania czynników chemicznych lub fizycznych, powstających zarówno w wyniku przemian metabolicznych zachodzących w komórkach, jak i docierających z zewnątrz komórek.

Wszelkie zmiany strukturalne w DNA stanowią jedynie zmiany premutacyjne, które jeśli nie zostaną usunięte w procesach reperacji, mogą doprowadzić do zmian mutacyjnych po następnych cyklach replikacyjnych DNA.

Organizmy są genetycznie stabilne. Wynika to nie tylko z bardzo dokładnego mechanizmu replikacji, ale również z funkcjonowania mechanizmów korygujących pomyłki popełnione przez aparat replikacyjny oraz dokonujących naprawy przypadkowych uszkodzeń DNA.

Polimeraza DNA jest tak dokładna, że popełnia tylko jeden błąd na 10⁷ nukleotydów poprawnie wprowadzonych podczas replikacji. Obok zdolności do katalizowania reakcji polimeryzacji enzym ten może dokonywać korekcji błędów – redagowanie.

Polimeraza DNA ma aktywność polimerazową w kierunku 5’ -> 3’ oraz aktywność nukleazową (tzn. zdolność do odcinania nukleotydu znajdującego się na końcu 3’ łańcucha; z polimerazą DNA związana jest egzonukleaza sprawdzająca) w kierunku 3’ -> 5’.

Aktywność egzonukleazowa 3’ -> 5’

Polimeraza DNA sprawdza wynik każdego połączenia nukleotydu przed przystąpieniem do następnego etapu polimeryzacji i usuwa niesparowane nukleotydy na końcu nowosyntetyzowanej nici.

Aktywność egzonukleazowa 5’ -> 3’

Polimeraza DNA może hydrolizować DNA od końca 5’ łańcucha. Cięcie może zachodzić na końcowym wiązaniu fosfodiestrowym lub na wiązaniu oddalonym o kilka reszt od końca 5’. Ta aktywność usuwa starterowy odcinek RNA podczas replikacji.

Naprawa źle dopasowanych par zasad w DNA (DNA mismatch repair)

Jest to system, którego zadaniem jest korekta pomyłek aparatu replikacyjnego. Koryguje 99% tych błędów, zwiększając dokładność dopasowania par zasad do jednej pomyłki na 10⁹ nukleotydów poprawnie dopasowanych.

Systemy naprawy DNA

• naprawa bezpośrednia (wypełnianie pęknięć i korygowanie niektórych rodzajów modyfikacji nukleotydów),

• naprawa przez wycięcie zasady (BER, base excision repair),

• naprawa przez wycięcie nukleotydu (NER, nucleotide excision repair),

• naprawa rekombinacyjna

Etapy mechanizmu naprawy uszkodzonego DNA przez wycinanie

1. rozpoznanie i wycięcie uszkodzonego odcinka przy użyciu nukleaz, które zrywają wiązania kowalencyjne łączące zmienione nukleotydy z resztą łańcucha,

2. wypełnienie powstałej luki nukleotydowej przez polimerazę naprawczą DNA, która wiąże się z końcem 3’ przeciętego łańcucha i syntetyzuje kopię informacji zachowanej w łańcuchu nieuszkodzonym,

3. połączenie końców naprawionej nici za pomocą ligazy DNA.

Jeśli mechanizm naprawy DNA zawiedzie, powstają trwałe, dziedziczne zmiany w strukturze DNA – mutacje.

Mutacje powstają na skutek:

• spontanicznych błędów w replikacji DNA,

• działania mutagenów fizycznych lub chemicznych.

Rodzaje mutacji spontanicznych:

• tranzycja – jedna puryna (lub pirymidyna) jest zastępowana przez inną,

• transwersja – puryna zostaje zastąpiona pirymidyną lub odwrotnie,

• insercja (addycja) – wstawienie jednego lub kilku nukleotydów,

• delecja – wycięcie jednego lub kilku nukleotydów.

Efekt, jaki może wywołać mutacja punktowa, zmieniająca sekwencję kodonu:

• zmiana synonimiczna, gdy nowy kodon odpowiada temu samemu aminokwasowi, co kodon nie zmutowany (mutacja cicha; najczęściej występuje w części niekodującej lub nieregulatorowej genu lub zachodzi w trzeciej pozycji kodonu, co w efekcie nie prowadzi do widocznych zmian fenotypowych),

• zmiana niesynonimiczna (zmiana sensu), gdy mutacja zmieni kodon tak, że odpowiada on innemu aminokwasowi; może wpłynąć na aktywność biologiczną białka,

• zmiana kodonu kodującego aminokwas w kodon terminacyjny (mutacja nonsens). W rezultacie powstaje skrócone białko; najczęściej białko to nie jest zdolne do pełnienia swej funkcji,

• zmiana kodonu terminacyjnego na taki, który odpowiada jakiemuś aminokwasowi. Powoduje to ominięcie kodonu terminacyjnego i wydłużenie białka; może spowodować osłabienie jego aktywności.

Gorące miejsca w genomie (hot spots) – miejsca w genomie mutujące z częstością wielokrotnie wyższą niż pozostałe.

Mutacje mutatorowe – mutacje w genach, w których zmiany prowadzą w konsekwencji do zwiększenia częstotliwości zachodzenia mutacji spontanicznych.

Mutacja odpowiedzialna za anemię sierpowatą – zmiana jednego ze 146 aminokwasów. Hemoglobina S ma na powierzchni niepolarną resztę aminokwasową, co zmienia jej własności i prowadzi i prowadzi do niedokrwistości.

Mechanizm korekty źle sparowanych zasad w DNA

Sygnałem dla białek naprawianych jest przerwa w nowosyntetyzowanym łańcuchu DNA (na nici opóźnionej).

Insercje i delecje (mutacje zmiany fazy odczytu) są szczególnie częste, gdy matryca DNA zawiera krótkie, powtórzone sekwencje (np. w mikrosatelitach). Sekwencje powtórzone mogą wywołać poślizg replikacji, przy którym nić matrycowa i jej kopia przesuwają się względem siebie, przez co część matrycy jest powielana dwukrotnie lub opuszczana.

Przykłady ludzkich chorób powodowanych insercją:

• choroba Huntingtona (gen Hdh) (CAG)_10-15 -> (CAG)_36-121

• epilepsja miokloniczna z ruchami pląsawiczymi (gen B37) (CAG)_7-25 -> (CAG)_49-75

Mutageny wywołują mutacje trzema różnymi sposobami:

• działają jako analogi zasad i są mylnie wykorzystywane jako substraty podczas syntezy DNA,

• reagują bezpośrednio z DNA, wywołując zmiany strukturalne,

• działają pośrednio na DNA, nie wywołują u niego zmian strukturalnych; powodują wytworzenie w komórce związków chemicznych o działaniu mutagennym.

Każda zasada azotowa nukleotydu może występować w postaci jednego z dwóch tautomerów, czyli izomerów strukturalnych pozostających w stanie równowagi dynamicznej. Np. tymina występuje w postaci dwóch tautomerów – formy ketonowej i enolowej, przy czym pojedyncze cząsteczki przechodzą niekiedy z jednej formy tautomerycznej w inną.

Analogi zasad to zasady purynowe i pirymidynowe na tyle podobne do normalnych, że są włączone do nukleotydów podczas ich syntezy w komórce. Np. analog tyminy, ale równowaga między dwoma tautomerami 5-bU (5-bromouracyl) jest bardziej przesunięta w stronę rzadszej formy enolowej i w kolejnej rundzie replikacji enol-5-bU tworzy parę z G zamiast z A – mutacja punktowa.

Bezpośrednie zmiany w DNA:

• depurynacja,

• deaminacja,

• uszkodzenie oksydacyjne,

• alkilacja,

• interkalacja.

Depurynacja – zrywanie wiązania N-glikozydowego między N-9 zasady purynowej (A lub G) a C-1 deoksyrybozy -> utrata zasady purynowej z cząsteczki DNA.

Deaminacja – utrata grupy aminowej reszt A, C lub G, powodowana np. przez kwas azotawy,

• adenina -> hipoksantyna (-C),

• cytozyna -> uracyl (-A),

• guanina -> ksantyna (blokuje replikację).