BIOLOGIA MOLEKULARNA

WYKŁAD 6 - 10.11.2006 r.

Kontynuacja omawiania różnych systemów regulacji genów u Prokariota i w odniesieniu do bakteriofagów.

Kontrola operonu tryptofanowego:

• może zachodzić w różny sposób,

• budowa operonu tryptofanowego jest w zasadzie taka sama, jak innych operonów mających geny kodujące represor, promotor, operator i geny strukuralne

• jest jedna różnica - operon tryptofanowy posiada tzw. sekwencję liderową

Sekwencja liderowa:

• nie występuje w takich operonach jak laktozowy czy tryptofanowy,

• mimo to jest to dosyć często występującą sekwencją,

• występuje ona pomiędzy elementami struktury związanymi z systemem regulacji tzn. promotorem i operatorem (są te rejony gdzie przyłączają się czynniki transkrypcyjne) a pierwszym właściwym genem strukturalnym.

W niektórych przypadkach, tak jak w operonie tryptofanowym, cała sekwencja koduje pewne małe białko, ale często jest też tak, że sekwencja liderowa jest niekodująca, natomiast bardzo mocno są rozbudowane struktury RNA II i III-rzędowe, podobnie zresztą jak w przypadku operonu tryptofanowego.

Co jest natomiast w klasycznym układzie kiedy:

1) nie ma tryptofanu Jest wtedy wytwarzane białko (aporepresor jest eksprymowany konstytutywnie), ale stanowi ono tzw. aporepresor, czyli białko jest nieaktywne - polimeraza może się przyłączyć do promotora i rozpocząć syntezę białek strukturalnych (w tym wypadku 5 różnych). Czyli w przeciwieństwie do operonu laktozowego (w którym represor jest również eksprymowany konstytutywnie), w operonie tryptofanowym, produkowany represor nie jest aktywny.

2)W obecności tryptofanu (tryptofan jest w tym przypadku korepresorem) - tryptofan łączy się z aporepresorem tworząc aktywną cząsteczkę represora. Represor przyłącza się do sekwencji operatora i powoduje zablokowanie przyłączenia się polimerazy. Wobec tego nie ma syntezy mRNA i oczywiście białek.

Mamy też tzw. zjawisko atenuacji. Do tej pory tzn. przy omawianiu operonu tryptofanowego i arabinozowego się z tym nie spotkaliśmy.

Zjawisko to jest związane z sekwencją liderową, w której znajdują się 2 kodony dla przyłączania tryptofanu (jest to stosunkowo nieduże białko) i możliwością tworzenia mocno rozbudowanej struktury II-rzędowej w RNA, która zaczyna być tworzona w rejonie sekwencji liderowej. Sekwencje te mogą tworzyć wiązania podwójne i są takie 4 rejony: 1, 2, 3 i 4. W obrębie operonu trp znajduje się 14 aminokwasowa sekwencja liderowa, a za nią atenuator, który może tworzyć różne struktury II rzędowe.

Translacja u bakterii startuje zaraz po tym, jak zostanie zsyntetyzowany RBS. W warunkach, gdy jest wiele trp, rybosom może dokonać transkrypcji na regionie liderowym - w takich warunkach atenuator tworzy takie struktury, które powodują, że polimeraza RNA odłącza się od DNA.

W warunkach braku trp, rybosom zatrzymuje się, ponieważ w obrębie lidera znajdują się kodony dla trp, a w komórce brak jest tryptofanylo-tRNA - rybosom zatrzymuje się, mRNA tworzy inną strukturę II rzędową, która pozwala polimerazie RNA kontynuować transkrypcję.

Jeśli jest dużo trp, spinka do włosów tworzy się między regionem 3 i 4 (czyli tworzą się takie dwie górki - jedna między 1 i 2, a druga między regionem 3 i 4). Czyli tworzą się dwie szpilki - z czego jedna jest terminatorem (3+4) i polimeraza oddysocjowuje, gdy tę szpilkę spotka.

Natomiast jeśli jest mało trp, to tworzy się jedna górka między regionem 2 i 3 (nie powstaje terminator).

Schematycznie zaznaczone te rejony, które mogą tworzyć wiązania 1-2, 3-4 albo 2-3, 1-4 i wtedy nie mogą się ze sobą połączyć.(Brak tego slajdu!)

Mechanizm atenuacji w najprostszej formie:

1)Jeżeli w komórce mamy bardzo mało tRNA dla tryptofanu, czyli komórka jest w stanie głodzenia, to cząsteczki tryptofanylo-tRNA są bardzo szybko wyczerpywane i w komórce zaczyna ich brakować. Wobec tego synteza mRNA i translacja białka w tym rejonie liderowym staje bardzo szybko, bo dochodzi do kodonu dla dołączenia cząsteczki tryptofanu, a ponieważ brakuje tRNA tryptofanowego, translacja staje i wtedy brak jest atenuacji.

2)Natomiast w przypadku kiedy jest dużo tryptofanylo-tRNA, czyli transkrypcja i translacja sekwencji liderowej może bez ograniczeń przebiegać, powstaje inna konformacja -tworzy się konformacja pomiędzy dwoma rejonami: 3-4 i w ten sposób cały proces jest zablokowany. Te wiązania, pomiędzy tymi dwoma rejonami: 3 i 4, są najbardziej stabilne termodynamicznie tzn. jest najtrudniej je rozbić. Wobec tego możliwość wytworzenia takiego kompleksu powoduje, że polimeraza nie może go przeskoczyć, więc się odłącza i translacja całego operonu ustaje. Kiedy jest jakakolwiek inna kombinacja, to też są tworzone podwójne wiązania, ale kompleks polimerazy może je stosunkowo łatwo rozbić (nie stanowi to przeszkody) i może się odbywać normalnie proces translacji.

W przypadku operonu tryptofanowego mamy już wymienione 2 poziomy regulacji:

• 
  Pierwszy - represor + tryptofan = aktywny represor przyłączenie do sekwencji operatorowych i promotorowych i ich zablokowanie. Na czym więc polega kontrola operonu tryptofanowego? Kiedy komórka ma dużą ilość tryptofanu, wyłącza jego syntezę, żeby nie zużywać niepotrzebnie energii na produkcję tryptofanu, który nie jest zużywany do produkcji białek. Jeżeli będzie za mało tryptofanu, nie będzie możliwe połączenie się z aporepresorem, czyli wytworzenie się aktywnej cząsteczki represora i synteza w tym wypadku nie będzie blokowana.

• Drugi poziom regulacji jest na poziomie atenuowania - również wyczuwanie, czy jest dużo czy mało tryptofanu w komórce.

• Jest jeszcze trzeci poziom regulacji, który jest już czysto biochemiczny tzn. nie działa na poziomie transkrypcji ani na poziomie translacji: w obecności tryptofanu (jego odpowiedniego stężenia) blokowana jest aktywność enzymatyczna (w sensie biochemicznym) pierwszego enzymu kodowanego przez gen trypE. Jest to bardzo ścisły proces.

Te 3 typy regulacji pozwalają na różnicowanie - jest synteza albo jej nie ma. (Pierwsze 2 na 600-krotny.) Trzeba pamiętać, że nigdy nie jest tak, żeby synteza jakiegoś szlaku metabolicznego była na poziomie zerowym! Zawsze synteza jest na jakimś minimalnym poziomie, tak jak przy wytwarzaniu β-galaktozydazy. Inaczej mówiąc, prawie nie znamy takich promotorów, które by były w 100% wyłączane.

Czy zjawisko atenuacji jest czymś wyjątkowym dla operonu tryptofanowego? NIE. Są przykłady sekwencji dla syntezy poszczególnych aminokwasów: tryptofan, fenyloalanina itd. Inaczej mówiąc, wszystkie szlaki metaboliczne prowadzące do syntezy aminokwasów są regulowane poprzez atenuację. Różnice mogą polegać tylko na ilościowym sposobie regulowania ekspresji. Są 2 kodony przyłączające tryptofany i w zależności od tego, jaki jest poziom tRNA tryptofanowego, jest to odpowiednio regulowane. Dla fenyloalaniny jest 6, 7; dla histydyny występuje słynny ogon histydynowy w sekwencji liderowej; dla leucyny są trzy; dla treoniny jest jeszcze więcej. Z aminokwasów tu wymienionych tylko tryptofan i fenyloalanina są regulowane podwójnie: przez represor i na drodze atenuacji. W przypadku innych aminokwasów, może to być tylko atenuacja, czyli wyczuwanie, ile jest cząsteczek tRNA dla danego aminokwasu.

OPERON	LIDER	REPRESOR
Tryptofanowy	+	+
Fenyloalaninowy	+	+
Histydynowy	+	-
Leucynowy	+	-
Treoninowy	+	-

Osmoregulacja:

Teraz mamy drugi przykład atenuacji - trochę bardziej skomplikowany. Do tej pory mówiliśmy o regulacji operonu tzn. genu gdzie geny strukturalne są niejako w jednym ciągu i są wspólnie regulowane. Przy osmoregulacji jest inaczej. Komórka wyczuwa jakie jest środowisko - czy jest duża, czy mała siła osmotyczna - czy jest czegoś dużo, czy mało; jakie jest pH dla danych komórek bakteryjnych, czy złe itd. I pytanie - co to znaczy, że komórki wyczuwają? W komórkach bakteryjnych, ale i w komórkach eukariotycznych, rolę takiego sensora spełniają białka, które są zakotwiczone w błonie zewnętrznej, czyli mówimy, że to jest receptor dla sygnałów dochodzących z zewnątrz.

Receptor:

• Jest to białko, którego część jest na zewnątrz zewnętrznej błony komórkowej, a część jest wewnątrz. Pod wpływem różnych bodźców z zewnątrz, np. siły osmotycznej, pH czy jakiegoś innego czynnika (może to być przyłączanie jakichś innych sygnałów np. związków nisko- lub wysokocząsteczkowych) konformacja tego białka się zmienia albo, jeśli to jest białko enzymatyczne, jego aktywność enzymatyczna albo jest wyrażana, albo nie jest wyrażana.

• Są to bardzo często kinazy, które fosforylują białka wewnątrzkomórkowe niemające styczności bezpośrednio z błonami zewnętrznymi - takie białko przekazuje ten sygnał dalej. Przekazywanie sygnałów odbywa się często przez szereg przenośników. Są to najczęściej kinazy różnego typu: serynowe, treoninowe, tyrozynowe - kinazy więc są najczęściej tymi sensorami, które wyczuwają, co się dzieje w środowisku zewnętrznym.

Mamy u E. coli (ale nie tylko) 2 białka zewnątrzbłonowe (Omp) - czyli takie, które są właśnie w błonie zewnętrznej. Białka te stanowią głównie strukturę tzw. poryn, choć nie tylko od nich ona zależy (czyli ta struktura). Poryny są to kanały występujące w błonie zewnętrznej, przez które do komórki mogą się przedostawać związki chemiczne z zewnątrz.

Poryny wytwarzane przez białko OmpF tworzą poryny o większej średnicy niż poryny zbudowane z OmpC, co pozwala na pobieranie różnych związków o stosunkowo niskiej sile osmotycznej (jeśli jest wyższe ciśnienie osmotyczne to fizycznie może więcej przejść).

[ Fenotypowa różnica - to, co jest obserwowane na podstawie różnicy w sile osmotycznej.]

Przy wysokiej sile osmotycznej mamy tylko białko OmpC, przy niskiej sile osmotycznej jest praktycznie tylko białko OmpF, a przy średniej sile osmotycznej, czyli takiej przy jakiej my zwykle hodujemy E. coli, mamy obie formy. Równowaga pomiędzy tymi białkami jest regulowana siłą osmotyczną, ale siła osmotyczna jest ważna dla komórki, gdy w środowisku jest wysokie stężenie NaCl. Wobec tego musi być jakiś system przekazujący, który reguluje, które z białek jest wytwarzane.

Mamy takie dwa systemy:

1) Jest białko, które jest kodowane przez gen EnvZ i ono, w zależności od tego, jaka jest siła osmotyczna, przybiera różną budowę przestrzenną, a jednocześnie ma właściwość takiej kinazy, która fosforyluje sama siebie (więc jest to autokinazą) a grupy fosforanowe są przyłączane do grupy histydynowej w określonym miejscu. Ta kinaza fosforyluje samą siebie a później ten sygnał jest przekazywany na białko OmpR - białko represorowe całego układu. W momencie, kiedy jest ono fosforylowane, wyrażane jest głównie białko OmpC (mechanizm ten jest bardzo skomplikowany). W rejonie operatorowym tych genów są sekwencje oznaczone jako: 1, 2 i 3, do których białko OmpR przyłącza się z różną siłą tzn. powinowactwo tego białka represorowego do tych rejonów jest słabsze bądź większe (podobnie jak możliwość budowania struktur mogących wyłączać syntezę). Jest jeszcze gen nicF, który może wytworzyć bardzo rozbudowaną strukturę mRNA II- i III-rzędową, czyli różne struktury o charakterze spinki do włosów (albo mogą być 2 struktury spinki do włosów z tzw. pojedynczym wybrzuszeniem pomiędzy nimi). Pomiędzy nimi mogą być również oddziaływania, więc jednym słowem są to struktury mocno rozbudowane.

Gen micF koduje antysensowne mRNA [Author ID1: at Thu Jan 4 23:58:00 2007 ]czyli w momencie kiedy jest jakiś produkt tej sekwencji mRNA, on łączy się z tymi rejonami, tworzy się dwuniciowe RNA i zaczyna być blokowana transkrypcja z tego rejonu (do takiego dwuniciowego mRNA nie może się przyłączyć rybosom micF przyłączajac się do mRNA OmpF, zakrywa RBS i kodon inicjujący). Jest to dwugenowy system regulacji będący przykładem dla osmoregulacji. On jest podobnie rozwiązywany dla wielu innych bakterii, jak i również może występować w niektórych innych genach.

2) Inny mechanizm regulacji. Listeria monocytogenes jest patogenem ludzkim, ale żyje również i namnaża się w środowisku zewnętrznym np. w nabiale: ser, mleko, różne jogurty.

[Jak jest produkcja źle prowadzona, to ludzie po zjedzeniu serka waniliowego lecą do lekarza i jak by się zrobiło badania, a u nas zazwyczaj się tego nie robi, to by się okazało, że jest to Listeria!:-)]

Jeżeli jednak już się dostanie do organizmu człowieka, to jest to typowa bakteria patogenna - patogen wewnątrzkomórkowy. W momencie, kiedy bakteria znajdzie się w środowisku wewnątrzkomórkowym, po pierwsze napotyka zupełnie inne środowisko, a po drugie, żeby móc w tym środowisku przeżyć (namnażać i być przenoszą z jednej komórki organizmu człowieka do drugiej), musi uruchomić cały szereg (jest ich kilkanaście) genów wirulencji - są to różnego rodzaju adhezyny itd. Z punktu widzenia tej bakterii, dopóki jest w tym przysłowiowym serku, nie ma sensu uruchamiania genów patogenności i marnowania sił na wysiłek translacji niepotrzebnych białek. Natomiast, kiedy dostanie się do wnętrza gospodarza i zaczyna przenikać do wnętrza komórek, musi uruchomić wszystkie swoje geny, żeby móc przeżyć w tych warunkach. Wobec tego musi istnieć jakiś mechanizm uruchamiający te wszystkie geny.

Jest za to odpowiedzialne białko, które się nazywa PrfA - jest to tzw. czynnik transkrypcyjny, który aktywuje geny wirulencji. Na czym polega różnica? W środowisku zewnętrznym (w serku ), temperatura wynosi ok. 20-30°C, a w organizmie człowieka ta temperatura wzrasta średnio do 37°C. Okazało się, że białko PrfA ulega ekspresji i jego aktywność zaczyna być widoczna w 37°C, ale nie w 30°C.

Ta kontrola polega na zmianie struktury genu prfA - sekwencje RBS są, albo nie są dostępne dla rybosomów. Jeżeli mamy mocno rozbudowaną strukturę RNA i jeżeli RBS znajduje się w obrębie pętli (na górze) to dostęp rybosomów i innych czynników jest możliwy i od tego momentu może się rozpocząć translacja. Jeżeli natomiast RBS znajduje się w dwuniciowej strukturze, to jest niemożliwe dołączenie rybosomu. Co się będzie działo, jeżeli mamy 2 rybosomy? W miarę przesuwania się tego pierwszego rybosomu, będą zrywane wiązania wodorowe, ze struktury dwuniciowej zrobi się jednoniciowa i rybosomy będą mogły się tutaj dołączyć. Jest to mechanizm regulacji, który jest bardzo często widoczny u bakterii jak i u ich bakteriofagów. Wobec tego póki Listeria jest w środowisku zewnętrznym, rybosomy nie mogą się przyłączyć i nie jest produkowany czynnik transkrypcyjny PrfA - geny związane z patogennością nie są eksprymowane. W momencie, kiedy mamy przejście do 37°C, ta struktura ulega rozerwaniu, dołączają się rybosomy i rozpoczyna się translacja, w wyniku czego powstaje czynnik transkrypcyjny, który łączy się z sekwencjami promotorowymi i operatorowymi we wszystkich genach patogenności i umożliwia ich syntezę. Jest to regulacja niewymagająca żadnego dodatkowego białka. Cała różnica polega na zmianie w wyniku temperatury struktury II-rzędowej mRNA! Jest to szczególnie widoczne u wirusów typu RNA - jest to jeden z podstawowych mechanizmów regulujących aktywność białka!

[Do tej pory mówiłem państwu o regulowaniu poszczególnych operonów.] Natomiast regulacja genów patogenności u Listerii monocytogenes jest w zasadzie przykładem istnienia regulacji na poziomie tzw. regulonów.

Regulony to zespoły wielu operonów, które są regulowane w jakiś sposób w odpowiedzi na jakiś sygnał środowiskowy.

Geny patogenności są typowym przykładem regulonu, ponieważ:

• są to geny czy operony rozrzucone, tzn. jest ich wiele i nie stanowią wspólnego ciągu genów,

• nie znajdują się pod kontrolą wspólnej sekwencji promotorowej,

• natomiast dotyczą jakby tej samej funkcji.

Przy czym geny związane z patogennością mogą stanowić pewien ciąg genów, będących z jednej strony regulonem, czyli zespołem operonów, ale znajdujących się w jednym ciągu i wtedy często mówimy o tzw. wyspach patogenności. Różnica, powiedzmy między E. coli a Shigella sprowadza się do tego, że kiedyś w ewolucji do dzisiejszej Shigelli została przeniesiona jedna czy dwie wyspy patogenności. Reszta genów niezwiązana z patogennością jest praktycznie taka sama.

Regulacja regulonów może zachodzić w różny sposób. Najbardziej znanym i najwcześniej odkrytym jest regulon odpowiedzi SOS. [To jest znowu, tak jak mówiłem, że Amerykanie lubią nadawać dziwne nazwy.] Odpowiedź SOS jest aktywowana podczas uszkodzenia DNA, czyli jeśli komórkę naświetlimy UV albo podziałamy mitomycyną C lub jakimiś innymi czynnikami (H₂O₂ - odpowiednio niskim stężeniem, żeby nie zabić komórki_, bo nawet jeśli będzie ona próbowała uruchomić regulon SOS, to i tak jej to niewiele pomoże).

W przypadkach uszkodzenia DNA, przynajmniej u E. coli jak i u innych bakterii, jest uruchamiana ekspresja co najmniej 15 genów, których zadaniem jest odbudowa uszkodzonego DNA. Te wszystkie geny są regulowane (jest to pewne uproszczenie) przez represor, który jest nazywany LexA. W normalnych komórkach represor ten wyłącza transkrypcję wszystkich genów związanych z odpowiedzią SOS. Znowu, to nie jest tak, że jest to absolutne wyłączenie. Nawet w normalnych warunkach, kiedy komórki nie są poddane działaniu jakichś czynników uszkadzających DNA, w sposób naturalny może dojść do pęknięcia nici DNA lub nieprawidłowego zadziałania endonukleaz. Zatem na niskim poziomie białka związane z systemem SOS są zawsze obecne. Jeśli nastąpi jakieś inne uszkodzenie DNA, drugie białko regulatorowe RecA (w zasadzie kompleks białek), wiąże się z takim uszkodzonym DNA tam, gdzie powstają struktury jednoniciowego DNA, aktywując proteolizę białka represorowego LexA. Zaczyna więc spadać poziom białka LexA i nie może ono blokować ekspresji wszystkich innych genów, więc następuje ich ekspresja! Jest to najstarszy znany przykład regulonu, kiedy pod wpływem jednego czynnika - uszkadzającego DNA - dochodzi do aktywacji wielu genów. Przykłady takich genów: recA, lexA, dinF, uvrA, dinA, dinB, uvrB, sulA. Funkcji niektórych, jak np. gen dinB, do tej pory nie znamy, ale wiemy, że wchodzą w skład kompleksu SOS, bo ich ekspresja jest uruchamiana w momencie zadziałania czynnika uszkadzającego.

Drugim sposobem regulacji regulonów jest użycie alternatywnych czynników σ. U E. coli głównym takim czynnikiem jest czynnik σ⁷⁰. Daje to prawidłowo działający holoenzym - polimerazę DNA, która rozpoznaje klasyczną sekwencję promotorową i większość genów jest wyrażana właśnie w ten sposób. Jeżeli zaczniemy patrzeć dokładnie jak są regulowane inne geny, mówimy: „Housekeeping genes” - są to geny podstawowe, bez których funkcjonowania komórka przestaje żyć, czyli wszystkie związane z podziałem komórki, z syntezą DNA, z syntezą RNA (tą ogólną!) To właśnie te geny są regulowane przy pomocy podjednostki σ⁷⁰ kodowanej przez gen rpoD.

Drugim takim odkrytym regulonem po regulonie związanym z białkami SOS był regulon związany z białkami szoku cieplnego. Okazało się, że jeżeli komórki E. coli przeniesiemy z 37°C do powiedzmy 45°C, uruchamiany jest cały zespół genów i białek, które są później wytwarzane i które w normalnych warunkach są oczywiście też produkowane, ale na bardzo niskim poziomie. Stąd też ta nazwa - białka szoku termicznego. Ale jaka jest funkcja tych białek? [ Po przeniesieniu komórek do 42°C one i tak wreszcie zginą, jeżeli oczywiście nie są termofilne, choć jest to zależne od działania kompleksu białek szoku termicznego.] Tu ulega zmianie głównie konformacja białek, ale może też ulegać zmianie konformacja RNA. W skład regulonu szoku cieplnego wchodzą głównie białka chaperonowe = opiekuńcze, czyli białka, których głównym celem działania jest utrzymanie struktury II, III i IV-rzędowej innych białek tak, żeby te białka w niesprzyjającej temperaturze mogły przetrwać. [Duże zasługi w odkryciu i badaniu tych białek ma profesor Żylicz.]

Hodowla komórkowa E. coli po ok.5-6h wchodzi w stan stacjonarny, czyli komórki przestają się dzielić, ale nie umierają, jeżeli oczywiście wcześniej hodowla nie wyschnie. E. coli w takich warunkach może przeżyć nawet do 10 dni, choć ilość komórek żywych oczywiście ulega zmniejszeniu. Wtedy bakterii potrzebne są zupełnie inne geny, inne białka i jest uruchamiany regulon, w którym na ekspresję genów w dużym stopniu wpływa czynnik σ³⁸. Jednym z nich jest regulon związany z metabolizmem azotowym, pobieraniem i przetwarzaniem azotu czy też związków azotu. I znowu, jest to zupełnie inny zespół genów, w którego ekspresji biorą udział podjednostki σ. Jednym słowem to jest regulacja różnego zespołu genów, biorących udział w jednym procesie, które są kodowane przez różne geny, różne operony i rozrzucone najczęściej na mapie chromosomalnej bakterii w różnych miejscach, lecz regulowane przez jakiś jeden wspólny czynnik.

Czynniki σ odgrywają również rolę w regulacji sporulacji u Bacillus subtilis - jest to taki programowany rozwój bakterii w odpowiedzi na stres i głodzenie. Bacillus subtilis, jak i wszystkie inne bakterie wytwarzające spory, zaczynają je wytwarzać wtedy, kiedy w środowisku jest jakiś czynnik stresujący (zmiana pH, zmiana siły osmotycznej bądź brakuje jakichś czynników odżywczych) i to jest regulowane przez kolejno działające czynniki σ. Przy czym jest tak (to jest oczywiście uproszczenie), że jeżeli w ekspresję jest np. zaangażowana σ^F, to wśród genów ulegających ekspresji, będą takie geny, które zaczną hamować wcześniejszą σ! Inaczej byłoby tak, że owszem włączają się geny, ale wszystkie na raz zaczynają ulegać ekspresji (dodatkowa kwestia kontroli!).

Wykryto metylazę E. coli, która rozpoznaje sekwencje GATC tzw. metylaza Dam (lata'70). U organizmów eukariotycznych mamy metylazy, które rozpoznają sekwencje CG i na początku były spory, czy metylaza Dam jest jakimś istotnym czynnikiem, czy jest to czynnik wtórny. Zaczęto wykazywać, że myszy ze znokautowanymi genami metylaz albo w ogóle się nie rodzą, albo bardzo szybko umierają - zależy to od rodzaju znokautowanego genu. U E. coli szybko wykazano, że ta mutacja nie jest letalna, ale to, co my mamy w warunkach laboratoryjnych, nie można odnosić do warunków naturalnych. Rzeczywiście mutacja ta nie jest letalna, ale czas generacji wydłuża się o ok. 50%, a podziały komórkowe są zaburzone (niektóre komórki nie dostają chromosomu, a inne dostają), więc w warunkach naturalnych mutanty Dam^- najprawdopodobniej nie wytrzymałyby konkurencji.

W latach `70, -`80 wykazano, że brak metylazy Dam powoduje zaburzenia w:

• replikacji DNA

• transpozycji niektórych elementów transpozonowych

• ekspresji niektórych genów.

• U E. coli wykazano też, że obecność niektórych pilii jest regulowana przez to czy jest metylacja DNA czy nie. Jeżeli jest metyzacja, to np. są pilie, a jeżeli nie, to ich nie ma.

W 2002r. ukazała się praca zrobiona przez Japończyków na modelu E. coli, którzy przy pomocy tzw. microarray badali ekspresję genów E. coli. Okazało się, że ponad 80% genów jest regulowana w zależności od tego czy jest metylaza Dam czy jej nie ma. Ekspresja niektórych genów wzrastała, a innych była hamowana i wobec tego zdano sobie sprawę, że metylacja DNA może odgrywać i odgrywa na pewno dużą rolę!

Potem ukazała się praca zrobiona na Salmonella, gdzie wykazano, że metylacja Dam pełni rolę czynnika regulującego regulony genów patogenności. Inaczej mówiąc, mutanty Salmonella Dam^- były zupełnie niepatogenne - ekspresja genów patogenności była zupełnie wyłączona - do tego stopnia, że zwierzęta doświadczalne można było „karmić” szczepami Dam^- i nie chorowały. Wobec tego powstała myśl, że taki szczep może stać się dobrą szczepionką: bakteria żywa, niepatogenna, możemy ją podawać i uodparniać. Na modelach zwierzęcych okazało się to zupełnie dobre, ale u ludzi wygląda to trochę inaczej. Zdano sobie bowiem sprawę, że metylazę Dam posiada nie tylko Salmonella, ale też i inne bakterie np. E. coli. I tak np. między Salmonellą i E. coli może zachodzić koniugacja w wyniku czego gen metylazy może być przekazywany i może powstawać patogenny szczep! Wykazano również, że bakteriofagi kodują własne metylazy typu Dam i funkcjonalnie mogą być one wymieniane, np. metylaza typu Dam z faga P1 robi to samo w E. coli co metylaza Dam E. coli.

W 2005r. ukazała się praca zrobiona na Haemophilus influenzae, która wykazała, że metylaza związana z systemem restrykcji i modyfikacji ma praktycznie rzecz biorąc taki sam efekt jej metylaza Dam. Tzn. jeżeli H. influenzae nie ma jednego z tych systemów, to wykazuje to takie same efekty jak brak metylazy Dam u E. coli.

Metylazy tworzą tzw. system restrykcji i modyfikacji, składający się z genu kodująceo restryktazę i genu kodującego metylazę - obie rozpoznają tę samą sekwencję, a metylaza ma chronić własne DNA przed działaniem restryktazy.

Metylaza Dam należy do tzw. samotnych metylaz, tzn. nie ma swojego partnera w postaci restryktazy. Nie występuje ona u wszystkich bakterii, tylko u pewnych grup bakterii, ale możemy się spodziewać, że u innych bakterii inne metylazy mogą odgrywać podobną rolę. Wobec tego wydaje się, że metylacja DNA u organizmów eukariotycznych i u bakterii może być czynnikiem odpowiedzialnym za regulację genów. I to już jest superregulacja - nie dotyczy regulonów związanych z odpowiednią wspólną funkcją: szok cieplny, ekstremalny szok, SOS, metabolizm azotowy, sporulacja, tylko praktycznie wszystkich genów. Wzór metylacyjny utrzymuje na określonym poziomie ekspresję prawie 90% genów (tak jak u E. coli)!

Quorum sensing - czyli jeszcze inny sposób regulacji genów. Celem Quorum sensing jest koordynacja pewnych zachowań czy funkcji pomiędzy bakteriami tego samego rodzaju.

Do niedawna wydawało się, że w hodowli bakteryjnej (np. w 100ml), każda komórka jest osobną jednostką niekomunikującą się z inną. Oczywiście są one poddane wpływowi tych samych czynników. Jeżeli np. hodujemy bakterie na podłożu stałym w postaci murawki w 37°C, ale z jednej strony zaczniemy je podgrzewać trochę bardziej czyli zrobimy gradient temperaturowy, to u bakterii bardziej podgrzewanych uruchomi się system heat shocku (regulonu szoku cieplnego), ale sygnał ten zostanie przekazany dalej do tych bakterii, która są hodowane w 37°C.

Pseudomonas aeruginosa jest patogenem oportunistycznym, więc może w warunkach normalnych żyć w gospodarzu bez żadnego uszczerbku na jego zdrowiu, ale jeżeli z jakichś powodów nasz system odpornościowy ulegnie gwałtownemu osłabieniu - bakterie zaczną się znacznie szybciej mnożyć, osiągną większą koncentrację i wtedy mogą przełamać system odpornościowy człowieka i wywołać chorobę, a najpierw utworzyć tzw. biofilm.

Wierzy się, że terapeutyczna degradacja cząsteczek sygnałowych może zapobiec tworzeniu biofilmu. Niszczenie tego procesu sygnałowego to quorum quenching. W ciągu ostatnich lat powstało przekonanie, że bakterie w naturalnym środowisku rosną nie jako oddzielne komórki, ale mamy do czynienia z tzw. biofilmami (przewód pokarmowy, płytka nazębna, jama nosowo-gardłowa itd.) tzn. rozrastaniem się kom. bakteryjnych w taki sposób, że zajmują one ogromne powierzchnie, ściśle do siebie na ogół przylegają i istnieje między nimi komunikacja o tym, co się dzieje na zewnątrz. Jeżeli np. pobieramy wodę oligoceńską, nigdy nie jest ona jałowa w 100% i jeżeli ją przechowujemy, bardzo szybko okaże się, że na ściankach naszych pojemników utworzy się biofilm, czyli zespół komórek bardzo silnie przytwierdzonych do podłoża.

„Kleje”, czyli związki chemiczne, które umożliwiają bakteriom przytwierdzenie się do podłoża są tak silne, że wykorzystano je do sklejania kości i tkanek, bo żaden syntetyczny klej takich parametrów nie spełnia! Po raz pierwszy to zaobserwowano u Myxobakteria - bakterie śluzowe, które nie mają ściany komórkowej i które rosną w postaci biofilmu, a cechą charakterystyczną jest to, że w jakimś momencie tworzą tzw. ciała owocowe, czyli rodzaj przetrwalników. Bakterie rosną na podłożu i w pewnym momencie powstaje jakiś sygnał (podobnie jak w komórkach nowotworowych) i komórki nagle zaczynają się dzielić, zachodzą na siebie i powstają ciałka owocowe; potem działa kolejny sygnał i pojawiają się formy przetrwalnikowe. Było to znane przez blisko 100 lat, ale nikt nie wiedział, skąd to się brało. Podobnie jest również u Streptomyces.

Najbardziej popularnym przykładem jest Vibrio fisheri - bakteria, dzięki której w jakimś momencie woda zaczyna świecić zielonkawym światłem.

Zjawisko Quorum sensing występuje zarówno u bakterii gramujemnych jak i gramdodatnich.

Występują następujące różnice między bakteriami gramujemnymi i gramdodatnimi:

	Bakterie gramujemne	Bakterie gramdodatnie
rodzaj autoinduktora	AHL-acylowany lakton homoserynowy-niskocząsteczkowe związki wytwarzane przez samą bakterię	Krótkie peptydy-przez geny produkowany jest jakiś prekursor, który następnie jest przenoszony do jakiegoś centrum

[W USA - tam gdzie pracował profesor, prowadzono badania na małżach, które chętniej rosły tam, gdzie wody rzeki były bardziej zanieczyszczone. Okazało się, że nie jest to spowodowane tym, że małże jedzą bakterie i tam jest ich więcej, tylko że te bakterie wytwarzają feromony, które przyciągają małże. Są to między innymi: Vibrio fisheri. Związkiem tym był lakton o podobnym charakterze jak AHL, który był sensorem dla samego Vibrio, a małże jakby to wykorzystały. Gen na ten feromon został sklonowany w E. coli, powstał szczep produkujący ten związek i pracownicy tego laboratorium założyli firmę, przez co zarobili na tym „kupę kasy”!]

Jest też dużo przykładów chemicznych autoinduktorów, ponieważ można je już teraz wytwarzać syntetycznie, modyfikować różne grupy chemiczne i w ten sposób wpływać na to czy one będą skuteczniejsze czy nie. Najbardziej klasycznym przykładem jest właśnie regulacja luminescencji u Vibrio fisheri, za którą są odpowiedzialne geny lux:(luxI i luxR), które w praktyce laboratoryjnej zostały wykorzystane jako geny reporterowe - bakteria mająca ten gen świeci w UV. Są próby wykorzystania tych bakterii do produkcji minizegarków i minikomputerów.

System Quorum sensing może być mniej lub bardziej skomplikowany i np. u Pseudomonas aeruginosa jest on bardzo skomplikowany - sieć skomplikowanych połączeń.

Trwają intensywne prace nad lekami, które będą specyficznie działały na przenośnik sygnału i się z nim łączyły, hamując cały proces uruchamiania genów patogenności (czynniki te wydzielane są zawsze na zewnątrz).

4

---