WYKŁAD 10.10.2007
Izolacja DNA:
zniszczenie struktury komórkowej (mechaniczne - ucieranie zamrożonego materiału; chemiczne - stosowane tutaj najczęściej detergenty, np.: SDS; enzymatyczne - te metody stosujemy często w przypadku bakterii, np.: lizozym, enzymy proteolityczne). Należy zadbać również o zahamowanie aktywności enzymów nukleofilowych, np.: poprzez dodanie EDTA.
Ekstrakcja: oddzielenie kwasów nukleinowych od innych elementów składowych komórki (rozpuszczalniki organiczne: fenol, chloroform, często w mieszaninie z alkoholem izoamylowym). Poprzez dodanie rozpuszczalników organicznych zwiększamy powierzchnię kontaktu pomiędzy fazą wodną a organiczną (powstaje emulsja), doprowadza to do denaturacji białek, po wirowaniu uzyskujemy kilka faz (od góry: faza wodna, interfaza, faza organiczna).
Adsorpcja (specjalna kolumienka w wielkości ependorfa, w środku jest korek ze sprasowanych włókien krzemionki). W towarzystwie czynnika feotropowego wykazują silne powinowactwo do porowatego złoża. Wkładamy zatem uzyskaną emulsję do ependorfa i wymuszamy przepływ poprzez wirowanie. Fazy nukleinowe adsorbują się na powierzchni złoża, całą resztę wylewamy. Przepłukujemy kilkukrotnie złoże alkoholem, następnie usuwamy wodą kwas nukleinowy ze złoża i otrzymujemy czysty kwas nukleinowy.
Filtracja żelowa: dysponujemy specjalną kolumną zawierającą zawiesinę uwodnionego wielocukru (Sepharex, Sepharose), na dole kolumienki jest spiek ceramiczny, formuje się kolumienka o strukturze ziarnistej. Na kolumnę nakłada się roztwór kwasu nukleinowego, którego chcemy oczyścić. Substancje drobnocząsteczkowe wchodzą do ziaren i pomiędzy ziarna, w ziarnach zostają uwięzione. Substancje wielkocząsteczkowe - kwasy nukleinowe - przechodzą pomiędzy ziarnami i możemy je zebrać (oczyszczamy je więc z zanieczyszczeń drobnocząsteczkowych).
Na końcu 3' mRNA odcinek poliA u eukariontów. Możemy to wykorzystać do oczyszczenia mRNA, wykorzystuje się sondę wyznakowaną biotyną, która wykazuje wysokie powinowactwo do streptoidyny, oddziaływanie streptomidyna - biotyna zatrzymuje na powierzchni probówki mRNA.
Wytrącenie kwasu nukleinowego za pomocą alkoholi (etanol, izopropanol) - precypitacja alkoholowa.
Metod izolacji kwasów nukleinowych są tysiące. Ich wybór zależy od:
typu DNA (total, organellowe, plazmidowe);
źródła (komórki roślinne, frakcja mitochondrialna, itd.);
cel w jakim mamy zamiar wykorzystać preparat (PCR, hybrydyzacja, klonowanie, sekwencjonowanie).
Enzymy restrykcyjne:
Wykorzystywane są do trawienia DNA dwuniciowego.
Endonukleazy, które rozpoznają specyficzne sekwencje DNA i trawią to DNA w tych sekwencjach albo w pewnym oddaleniu od tych sekwencji.
Enzymy restrykcyjne mogą rozpoznawać sekwencje 4, 6, 8- nukleotydowe.
Generują one tępe albo lepkie końce.
W produkcie trawienia na końcu 3' znajduje się grupa karboksylowa, na końcu 5' - fosforanowa.
Nomenklatura pochodzi od bakterii:
EcoRI BamHI
Eco, Bam - species E - nazwa rodzajowa co - nazwa gatunku bakterii R - szczep (strain) bakterii I - number
Enzymy Enzymy restrykcyjne stanowią swoisty układ odpornościowy bakterii przed wirusami (deintegracja ich kwasu nukleinowego - system restrykcji i modyfikacji). Sekwencje docelowe dla enzymu restrykcyjnego bakterii są metylowane.
Elektroforetyczne techniki:
Elektroforeza - proces migracji obdarzonych ładunkiem cząstek w roztworze w polu elektrycznym przyłożonym do tego roztworu.
Wykorzystujemy ją do rozdziału cząstek na subpopulacje (np.: wedle masy czasteczek).
Zaburzenie: dyfuzja i konwekcja.
Elektroforeza w złożach żelowych:
agarozowy (polisacharyd);
poliakrylamid (z polimeryzacji akrylamidu i monomerów)
Żel jest to sieć przestrzenna łańcuszków poliakrylamidowych, agarozowych i innych.
Dzięki żelom możemy różnicować cząstki różniące się wielkością (duże cząsteczki są dużo bardziej hamowane przez sieć).
Żele agarozowe - postać horyzontalna, żele poliakrylamidowe - format wertykalny, czyli pionowy - służą one do rozdzielenia cząsteczek małych (kilkadziesiąt - kilkaset par zasad), żele agarozowe - format horyzontalny - natomiast do rozdziału cząsteczek dużych (>kilkaset).
Migracja zależy od gęstości żelu , komformacji cząsteczek, np.; plazmidy o różnej komformacji, większość CCC - kolista superzwinięta; oc - otwarta kolista, zrelaksowana jedna nić jest nacięta, liniowa. Każda z tych form ma inne tempo migracji w żelu.
Jednoniciowe cząsteczki zwykle nie mają formy niciowej ze względu na lokalne homologie sekwencyjne.
Efekt zróżnicowanej migracji pojawiający się w wyniku powstawania 2-rzędowej struktury jest niekorzystny, dlatego potrzebne są substancje denaturujące obecne w żelu i również w dodawanym kwasie nukleinowym (mocznik lub formaldehyd).
Wizualizacja elektroforezy - bromek etydyny (związek o strukturze pierścieniowej), ma tendencję do hhelikacji - wbudowywania się do zasad azotowych DNA i helikalnych odcinków RNA. Jest barwny - różowy - ale z powodu rozcieńczenia nie widać tego koloru. W świetle UV uwidaczniają się strefy, gdzie znajduje się DNA (bo połączyło się z bromkiem etydyny). Często zawarty w żelu i/lub dodawanym kwasie nukleinowym.
Hybrydyzacja:
Proces, który polega na łączeniu się ze sobą nici kwasów nukleinowych różnego pochodzenia.
Sonda - segment DNA lub RNA o znanej tożsamości, który został wyznakowany w sposób umożliwiający jego detekcję.
Sposoby znakowania:
Radioizotopy (fosfory, siarki, wodoru), hapteny (substancje drobnocząsteczkowe o bogatej architekturze cząsteczkowej, przeciwko którym można wzbudzić określone przeciwciała, wykorzystywane potem w detekcji).
WYKŁAD 17.10.2007
Enzymy restrykcyjne -cd. (dygresja). EcoRI działa w postaci dimeru. Reakcję restryktazy można odwrócić za pomoca enzymu ligazy DNA. Ligaza potrzebuje reszty fosforanowej i hydroksylowej, czyli tego, co zostawia restryktaza po trawieniu. Im dokładniej chcemy rozdzielić kwasy nukleinowe, tym dłuższy żel agarozowy potrzebujemy, jego grubość to zwykle tylko 5-8 mm.
Hybrydyzacja - c.d.
Kwasy nukleinowe poddajemy denaturacji - likwidacja struktury drugorzędowej. Następnie sonda hybrydyzacyjna po hybrydyzacji przyłącza się do fragmentów jednoniciowego DNA - powstaje heterodupleks.
Wedle znakowania rozpoznajemy te sekwencje.
Hybrydyzacja w roztworze - docelowy kwas nukleinowy ma postać roztworu, analiza obecności sekwencji powtórzonych.
Hybrydyzacja na podłożach stałych - obiekt badań występuje w połączeniu z podłożem - błona wykonana z nitrocelulozy lub nylonu. Tradycyjnym podłożem są błony -(przygotowywanie mikromacierzy - gdy odbywa się na szkle - nowy rodzaj podłoża).
Hybrydyzacja in situ - w obrębie preparatów mikroskopowych.
Hybrydyzacja na podłożach stałych:
Southern blot - izolacja DNA, strawianie go enzymami restrykcyjnymi, rozdział produktów, trawienie w żelu agarozowym, po rozdziale DNA poddajemy denaturacji - alkalizacja środowiska żelu (rozdział DNA na jednoniciowe). Żel z rozdzielonymi fragmentami nanosimy na bibułę zanurzoną w buforze transferowym (z dużą ilością soli), ona jest na postumencie, na żel nakładamy bibułę, a na nią błonę, a na błonę coś, co pochłania wilgoć, np.: ręczniki papierowe, które przyciskamy ciężarkiem.
Błona staje się odwzorowaniem DNA, które jest w stanie przez nią przesiąknąć. DNA jest przytwierdzane (np.: przez UV) do błony.
Etap właściwej hybrydyzacji:
Do DNA na błonie dodajemy sondę i wstawiamy do wytrząsarki, gdzie sonda wchodzi w kontakt z błoną i ze znajdującymi się tam cząsteczkami DNA.
Po hybrydyzacji niektóre fragmenty DNA zostają połączone z sondą, na końcu detekcja sygnału emitowanego przez sondę.
Alternatywnie można zastosować hapteny. W tym wypadku sondy w swojej strukturze co któryś nukleotyd posiada hapten.
Koniugat - białko złożone z ciała antyhaptenowego i enzymu.
Koniugat jest w roztworze, w którym zanurzamy blot.
W miejscu, gdzie mamy połączone DNA z sondą mamy przyłączone skumulowane cząsteczki enzymów.
Substrat chromogenny - pod wpływem działania enzymu zostaje rozłożony z uwolnieniem barwnego produktu.
Substrat luminogenny - zostaje rozłożony, produktów nie widać, ale w trakcie reakcji emitowane jest światło.
Lepsza metoda - przez zastosowanie substratu luminogennego - większa czułość detekcji, błonę można powtórnie hybrydyzować po detekcji.
W eksperymencie Southern definiuje nam fragmenty, które posiadają homologię z sondą. Dowiadujemy się więc, jakie geny występują w danym kawałku DNA o znanej długości i ilości (z elektroforezy).
Nowe urządzenia do transferu zamiast transferu kapilarnego wymuszają przepływ poprzez podciśnienie - fragmenty DNA również zatrzymywane są na błonie.
Transfer może też być wymuszony polem elektrycznym. Elektrotransfer stosuje się zwykle w wypadku białek, nie kwasów nukleinowych.
Nothern blot - docelowym kwasem nukleinowym nie jest DNA, lecz RNA. Rozdzielamy RNA w warunkach denaturujących, transfer, hybrydyzację i detekcję robi się analogicznie do DNA. Inna jest jednak informacja, jaką uzyskujemy.
Jesteśmy w stanie powiedzieć, czy dany gen ulega ekspresji i jesteśmy w stanie określić wielkość tej ekspresji i wielkość samego RNA.
Western blot - badamy rozdzielone elektroforetycznie białka i poszukujemy białka, które są rozpoznawane przez dane przeciwciała.
Dot blot - uproszczona hybrydyzacja na podłożu stałym. Daną próbkę (DNA lub RNA) nakrapia się na błonę. Następnie ekstrakty zapieka się na błonie (temperatura lub UV)...
Plaque - łysinka, rozpoznawanie wirusa po obecności łysinek.
Hybrydyzacja in situ - możemy wykrywać określone sekwencje DNA w obrębie chromosomów, można je też wykorzystywać do wykrywania specyficznych sekwencji RNA
Do DNA przyłącza się sonda wyznakowana haptenem, a do haptenu przeciwciało antyhaptenowe z fluoroforem.
Fluorofon uwidaczniamy naświetlając światłem wzbudzenia, emituje światło widzialne.
FISH - fluorescent in situ hybridisation
Do hybrydyzacji używa się często substratów heterogennych, bardzo rzadko, np.: trytu.
Korzyści hybrydyzacji in situ - uzyskujemy informację czasową (w których komórki i kiedy pojawa się odpowiedni RNA).
Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR).
Przeprowadza się ją w mniejszychependorfach 0,2 ml.
DNTP'y - roztwór 4 nukleotydów (N= A,T,G,C) - substraty w tej reakcji.
Matryca dla tej syntezy (jest nią preparat DNA albo cDNA).
Dodajemy do reakcji startery (primery) - ich sekwencja powoduje polimeryzację tego fragmentu, a nie innego. Startery są oligonukleotydami (około 20 nukleotydów), będącymi starterami nowo syntetyzowanych nici. Dodajemy jeszcze polimerazę DNA, z reguły Taq - (od thermus aquaticus) - jest to jest to enzym termostabilny. Potrzebny jest również bufor z Mg 2+. Tak przygotowane próbki wkłada się do termocyklera (programowany inkubator).
WYKŁAD 14.10.2007
PCR
Typowy profil PCR składa się z cykli.
Każdy cykl złożony jest z etapów.
1 etap: podgrzewanie próbki do ponad 90oC, w tej temperaturze dochodzi do denaturacji matrycowego DNA. Zostają wyeksponowane nukleotydy każdej z nici na procesy zachodzace w drugim etapie.
2 etap: gwałtowne obniżenie temperatury do około 50-60oC.
W tych warunkach do matrycy przyłączają się oligonukleotydy zwane starterami (na zasadzie komplementarności).
3 etap: temperatura rośnie do około 72°C - optimum temperaturowe polimerazy Taq - dobudowuje ona nukleotydy do końca 3' startera. Dwa startery jeden na jednej nici, drugi na drugiej nici, między starterami sekwencja nie może być dłuższa niż kilka tysięcy nukleotydów.
Drugi cykl - pojawiają się przy jednej nici fragmenty długości sekwencji między starterami.
W postępie geometrycznym rośnie liczba kopii DNA fragmentu docelowego, maleje udział liczby kopii zawierających dłuższe nici.
PCR można wykorzystać w celach analitycznych. Można wykorzystać do znakowania wirusów, do sekwencjonowania DNA, istnieje również wersja in situ.
PCR in situ - przebiega w komórce, cykle temperaturowe.
RT-PCR: złożenie odwrotnej transkrypcji i PCR.
Na matrycy RNA syntetyzujemy nić cDNA. Produkty są wykorzystywane jako matryca do PCR. W efekcie otrzymujemy informację, czy zachodziła ekspresja genu między starterami.
Metody sekwencjonowania:
metoda sekwencjonowania dideoksypochodnych (Sangera lub enzymatyczna):
Jeśli ryboza dideoksy zostanie włączona do łańcucha kwasu nukleinowego to następuje terminacja transkrypcji, bo nie może się przyłaczyć następna grupa fosforanowa.
Do naszej probówki dodajemy matrycowy DNA, standardowe nukleotydy, jeden starter, klonowany fragment oraz dideoksypochodną jednego z nukleotydów.
Produkty takiej syntezy rozdzielamy w żelu poliakrylamidowy, w którym można odróżnić migrację nawet o 1 nukleotyd. Otrzymujemy po elektroforezie wzór na żelu rozdzielonych fragmentów. Sekwencje odczytuje się od dołu żelu poprzez zapis produktów znajdujących się w konkretnych ścieżkach. Ta sekwencja z dołu żelu odpowiada najkrótszym fragmentom - sekwencja bezpośrednio przyłączona do startera. Formuje się tak zwana drabinka sekwencyjna, pozostaje nam tylko ich odczytanie. Jest to sekwencjonowanie tradycyjne.
Pierwszymi znacznikami były radioizotopy, później wykorzystywano również znakowanie haptenami, a również fluorochromami.
Często klonuje się w fagu M13, bo DNA można uzyskać w formie jednoniciowej. Najczęściej stosuje się denaturację termiczną DNA podawanego w formie dwuniciowej.
Fragment Klenowa polimerazy DNA Escherichia Coli, ale również później polimerazy, np.: od faga M7, a ostatnio polimerazę Taq i jej pochodne.
Zysk z polimerazy termostabilnej - można DNA podać dwuniciowe, pozwala na zastosowanie cyklingu temperaturowego, reakcja zachodzi w podwyższonej temperaturze około 72°C (znacznie rzadziej dochodzi do niespecyficznych terminacji syntezy).
We współczesnym sekwencjonowaniu bazujemy na fluorescencyjnych sekwencjonowaniach (różnica długości fal - rozpoznawanie), zastosowanie polimerazy termostabilnej. Stosuje się tutaj automatyczny sekwencjonator DNA, który przeprowadza elektroforezę DNA, będącego produktami terminazy, przeprowadza automatyczną detekcję produktów w trakcie elektroforezy.
WYKŁAD 7.11.2007
Automatyczny sekwencjonator DNA.
W nim zachodzi przede wszystkim elektroforeza (w kapilarze - dalsza automatyzacja, coraz częściej używana lub w płytowym sekwencjonatorze).
Padające światło lasera albo diody wzbudza fragment DNA, światło emisji DNA jest rejestrowane przez detektor i wyświetlane na ekranie monitora