Wykład V – biologia molekularna

Regulacja ekspresji genów

1. Wszystkie komórki mają taką samą informacje genetyczną

Różnice w wyglądzie oraz pełnionych funkcjach wynikają z niejednakowej aktywności różnych genów

1. Znaczenie regulacji ekspresji genów:

• Rozwój i różnicowanie

• Odpowiedź na warunki środowiska

• Procesy chorobowe

1. Genom – to nieprosta sekwencja liter, jest to bardziej skomplikowana struktura chemiczna powiązana z białkami, wykonanie „programu genetycznego”

2. Poziomy regulacji ekspresji genów:

• Matryca DNA – aktywacja struktury chromatyny

• Czas i częstość transkrypcji (zasadnicza regulacja odbywa się na tym poziomie)

• Proces obróbki posttranskrypcyjnej transkryptów pierwotnych

• Selekcja mRNA: wychodzenie tran skryptu z jądra do cytoplazmy oraz jego stabilność

• Translacja

• Modyfikacja potranslacyjna łańcówchów polipeptydowych

• Selektywna aktywacja i nieaktywacja białek po ich syntezie

1. Poziom matrycy DNA – struktura DNA

-białka histonowe H2A, H2B, H3, H4

- nukleosom

- solenoid

- struktury wyższego rzędu

6) Euchromatyna i heterochromatyna:

• Współczynnik upakowania – stopien skondensowania chromatyny

• W rejonach zawierających geny aktywne transkrypcyjnie upakowanie DNA jest zredukowane, rejony te są bardziej wrażliwe na trawienie nukleazami niż pozostałą część chromatyny

• Stan aktywności chromatyny przenosi się na komórki potomne i jest jednym z elementów pamieci komórkowej

1. Podstawowy warunek transkrypcji

aktywny stan chromatyny

• Dopiero w takiej sytuacji mogą przyłączyć się czynniki transkrypcyjne, polimerazy RNA itd.

Ciągle aktywna chromatyna zawierająca geny warunkujące podstawowe funkcje komórki (housekeeping gene) np. enzymy metabolizmu podstawowego

1. Chromatyna aktywna transkrypcyjnie:

• Rozluźnienie nie jest bezwzględnie skorelowane w czasie z transkrypcją, lecz ją poprzedza, a często pozostaje także po zakończeniu transkrypcji

• Rejon rozluźnienia rozciąga się zwykle poza obszar genu

1. Modyfikacja białek i DNA w chromatynie aktywnej transkrypcyjnie

• Zmiany w oddziaływaniu białek z DNA (słabsze oddziaływanie histonu H1 lub jego brak)

• Swoiste lub swoiście zmodyfikowane białka (acetylacja histonów H3 i H4, duże ilości białek HMG 14 i 17, ubikwitynowanie formy histonów H2A i H2B)

Zmiany związane z rozluźnieniem włókna chromatynowego.

• Metylacja cytozyny – wyspy CpG (mniejszy stopien metyzacji DNA w rejonach aktywnych transkrypcjnie)

• Metyzacja może zmieniac: powinowactwo DNA do czynników transkrypcyjnych, ułożenie nukleosomów w danym rejonie, oddziaływanie histonu H1 z DNA)

• Wzór metyzacji zmienia się podczas różnicowania komórek

Metyzacja sekwencji CpG w rejonie promotorów tych genów – unieczynnienie tych genów

Rozluźnienie struktury chromatyny nie jest warunkiem wystarczającym do rozpoczęcia transkrypcji; umożliwia ono drugi etap aktywacji – rozpoznanie przez czynniki transkrypcyjne miejsc wiązania

1. Miejsca nadwrażliwe na nukleazy

„otwarte okna chromatyny”

• Część genomu bardziej wrażliwa na nukleazy niż chromatyna aktywna transkrypcyjnie (x10)

• Miejsca rozmieszczone swoiście w stosunku do sekwencji nukleotydów

• Nie występują w nich nukleosomy

• Swobodnie dostępne dla czynników białkowych

1. Miejsca nadwrażliwe na nukleazy:

W miejscach tych zlokalizowane są:

• Sekwencje promotorowe

• Enhancery

• Silencery

• Miejsca inicjacji replikacji

• Miejsca germinacji transkrypcji

• Miejsca swoistego wiązania topoizomeraz

• Centromery

1. Miejsca nadwrażliwe na nukleazy:

• Wielkośc od ok. 200 do 1000 pz

• Trwały element chromatyny (miejsca konstytutywne) lub indukowane, np. pod wpływem hormonu

1. Nietypowa konformacja DNA w chromatynie aktywnej transkrypcyjnie

• Z-DNA

• Trójniciowy DNA

• Forma krzyżowa DNA

Formy te utrudniają, albo wykluczają umieszczenie nukleosomu w tym miejscu, w którym zostały wytworzone.

1. Transkrypcja

• Wiązanie polimerazy RNA z DNA czynniki białkowe, czynniki transkrypcyjne, które umożliwiają polimerazie wiązanie z DNA i rozpoczęcie transkrypcji

• Regulacja działania genu: obecność i i interakcje czynników transkrypcyjnych(c.t)

• Obecność i aktywność c.t zależna od: stanu fizjologicznego komórki, od jej przeszłości, otoczenia itd.!!!!!!

1. Geny kodujące białka są transkrybowane przez polimeraze II

Czynniki TFII (A,B,D,E,F) – wiele z tych czynników współdziała jeszcze z dodatkowymi białkami

1. PROMOTOR – przylegający do miejsca startu transkrypcji obszar regulatorowy, wiązący różne czynniki transkrypcyjne

Na transkrypcje wpływają również inne obszary – sekwencje wzmacniające (enhancery)

1. Regulacja działania genu: przyłączenie się do jej obszarów regulatorowych odpowiednich białek(to czy dane białko się przyłączy zależy od:

- ich obecności w danej tkance

- obecności aktywatorów i inhibitorów, które wpływają na działanie tych czynników)

17) sekwencje wzmacniające transkrypcje (enhancer) wiążą czynniki transkrypcyjne, wpływają na ekspresje niezależnie od swojego położenia i orientacji względem genu (enhancer może leżeć pare tysięcy pz za genem lub w obrębie genu – w jego intronie)

• Sekwencje osłabiające transkrypcje – silencer

18. Czynniki transkrypcyjne:

• Są to białka o roznej budowie

• Białka te zawierają 2 odrebne domeny:

1. Wiążąca się z DNA

2. Obszar lub domena aktywująca, służy do interakcji z innymi elementami aparatu transkrypcyjnego (np. polimerazą)

Czynniki transkrypcyjne klasyfikuje się na podstawie budowy domeny wiążącej

18. Poziom transkrypcji

Białka regulatorowe

• Czynniki transkrypcyjne

• Białka o strukturze: heliks-skręt-heliks, heliks-pętla-heliks, białka zawierające tzw. Palce cynkowe, białka zawierające tzw. Suwaki leucytowe

18. Regulacja post transkrypcyjna:

• Wycinanie intronów i składanie egzonów – splicing

• Redagowanie RNA

• Modyfikacja stabilności mRNA

• Magazynowanie mRNA

18. Alternatywny splicing - ?

19. Usuwanie intronów – dla niektórych transkryptów istnieje możliwość wytworzenia kilku rodzajów mRNA

20. Alternatywne składanie:

• Z tego samego Horna powstają różne mRNA

18. Introny występują:

• W genach kodujących białka, genach kodujących tRNA oraz rRNA

• W genach jądrowych oraz organellach

18. Zapis w mRNA może się różnic od zapisu w DNA:

• Pre-mRNA ulega obróbkom potranskrypcyjnych: cięcie, składanie genowe, modyfikacje końców 5’ i 3’

• Sekwencje kodujące mogą również ulegać zmianom zmieniającym sens transkryptów!!!

• Proces redagowania mRNA, „editing” (dodatkowe ramki odczytu powstałe w wyniku insercji lub modyfikacji zasad w DNA – geny milczące)

18. Przykład redagowania transkryptów genów jądrowych:

• Gen kodujący apolipoproteine B u ssaków, gen koduje 2 polipetydy

• Dłuższy 512 kDa występuje w wątrobie

• Krótszy wielkości 242kDa w jelicie

18. Bardzo rozbudowany system redagowania transkryptów genów mitochondrialnych u pierwotniaków Trypanosoma i Leishmania

19. Regulacja przez wybór miejsca terminacji transkrypcji:

• Przed rozpoczęciem składania dodawana jest „czapeczka” (7-metyloguanozyna) na końcu 5’ oraz ogon poliA na końcu 3’

• Niektóre geny mające wiecej niż jedno miejsce poliadenylacji, wybór miejsca może determinować rodzaj powstającego tran skryptu (np. geny kodujące cieżki łańcuch immunoglobuliny:

• Przeciwciało rozpuszalne

• Przeciwciało związane z błoną)

18. Regulacja eksportu RNA do cytoplazmy:

• Dla niektórych genów nieposiadających intronów warunkiem prawidłowe eksportu z jądra jest interakcja z kompleksem przeprowadzającym poliadenylacje 3’ końca lub sarna i odpowiednimi enzymami

18. Regulacja stabilności mRNA:

• W zależności jak długo dany mRNA może być matrycą dla syntezy białek tak długo utrzyma się efekt „włączenia danego genu.

• Okres połtrwania mRNA od kilku minut do kilmku dni

• Na stabilność mRNA ma wpływ”

• Duża ilość sekwencji AU na końcu 3’

• Obecnośc białek będących produktami translacji mRNA (np. mRNA beta-tubuliny ulega degradacji obecności beta-tubuliny)

• Oddziaływanie z cytoszkieletam

18. DNA p16 Homo sapiens – bardzo długie

mRNA p16 Homo sapiens – srednio długie

białko p16 Homo sapiens - krótkie

18. Translacja – biosynteza białek

• Informacja zaszyfrowana w łańcuchu mRNA jet tłumaczona na sekwencje aminokwasów w białku

• AUG (metionina) – sygnał rozpoczęcia syntezy

• UAG, UUA, UGA (amber, ochre, opal) – sygnały germinacji

• Nie wszystkie białka zawierają na początku metionine !!!!

18. Regulacja translacji:

• U Eukariota regulacja odbywa się poprzez działanie białek wpływających na translację

Czynnik elf – 2

Czynnik elf – 4E

Degradacja białek – białko ubikwityna

18. Modyfikacje potranslacyjne:

• Prowadzą do zmiany aktywności wielu białek

• Hydroksylacja; glikacja białek; fosforylacja grup -OH SER, TREO, TYR; usuniecie N-końca formylo-metioniny

18. Białka towarzyszące – cha perony:

• Białka opiekuńcze

• Komórkowe przyzwoitki

• Wiążąc się z innymi białkami kierują je do odpowiedniej przemiany, jak:

• Pofaldowanie łańczucha

• Oligomeryzacja

• Transport do innego przedziału komórkowego

• Degradacja

36)chaperony:

• ATP-azami

• Kompleks ATP-chaperon – powinowactwo do peptydów niefałdowanych

• Przeciwdziałają agregacji białek charakterystycznej dla takich schorzeń jak choroba Alzheimera, Creutzfeida-Jacoba

37. Unc-45:

• Prawidowe składanie białek towarzyszących ; miesnie szkieletowe a także miesien sercowy

37. Wiele z białek towarzyszących należy do tzw. Grupy białek szoku cieplnego (NSP)

38. Białka szoku cieplnego:

• Produkowane w wyniku odpowiedzi na:

• Nieznacznie podwyższoną temperature

• Infekcję wirusową

• Stres oksydacyjny

• Zatrucie metalami ciężkimi

• Zatrucie alkoholami

• Inhibitory przemian energetycznych

• Zwiększają szanse przeżycia komórki w warunkach szoku

• W warunkach niestresowych biora udział w regulacji podstawowych funkcji życiowych komórki (housekeeping)

• Uczestniczą w odpowiedzi układu odpornościowego wymierzonej naprzeciw nowotworom i patogenom

37. HSP60 – struktura otwartej klatki

38. HSP100:

• Tworzy wielopodjednostkową obręcz

• Zajmuje się rozwijaniem białek

37. HSP70:

• Pomaga nowym łańcuchom aminokwasowym w przyjmowaniu dojrzałej konformacji

• Ułatwia zgromadzenie składników kompleksów białkowych , chroni białka przed uszkodzeniem wysokich temperaturach

• Indukuje odporność przeciwrakową

• Odgrywa rolę w rozpoznawaniu komórek nowotworowych i zakażonych wirusem

• Szczepionka zawierająca kompleks HSP – peptyd stymulujący układ odpornościowy do ataku na komórki zawierające określone antygeny związane z nowotworem :

• Czerniak, rak nerki

• Choroby zakaźne: opryszczka narządów płciowych, gruźlica

• Stymulujący wpływ na proces transformacji nowotworowej i proliferacji nowotworu

• Wysoki poziom ekspresji w niektórych nowotworach(rak piersi) – niekorzystne rokowanie

37. Prof. Maciej Żylicz:

• Białka opiekuńcze:

• regulują funkcjonowanie wielu podstawowych procesów komórkowych

• ochraniają inne białka

• dysocjują kompleksy białkowe

• niezbędne do działania białka p50

• 1999 – nagroda Fundacji na rzecz nauki polskiej

37. Regulacja ekspresji genów:

• Regulacja bezpośrednia przez czynniki importowane do komórki

Czynniki sygnałowe:

• Białka(laktoferyna)

• Mniejsze molekuły(np. atomy metali lub cząsteczki hormonów steroidowych)

• Czynniki wpływające na różne białka, które wpływają na właściwe białka regulatorowe

Hormony steroidowe łączą się w cytoplazmie z białkowymi receptorami steroidów (2 grupy)

Kompleksy wędrują do jądra gdzie łączą się z DNA w rejonach przed sekwencją kodującą, co powoduje zmiany ekspresji genu

Kompleksy białko-steroid przyczepiaja się do ściśle określonych sekwencji DNA – elementy odpowiedzi humoralnej HRE

HRE regulują ekspresje składujących genów oraz inne miejsca kontroli transkrypcji

4 klasy HRE: GRE, BRE, TRE, DRE

Hormony ster. decydują o aktywacji genów regulatorowych przez receptory h. steroidowych

Hormon indukuje niewielkie zmiany w kinetyce wiązania i powinowactwie receptora do HRE

Wiązanie hormonu wywołuje zmiane allosteryczną receptora

Receptory jądrowe h. ster. – białka trans regulatorowe transkrypcji

• Regulacja pośrednia poprzez receptory powierzchniowe komórki:

• Czynniki sygnałowe zewnątrzkomórkowe łączą się z receptorami komórkowymi i uaktywniają je

• Części wewnątrzkomórkowe receptorów doprowadzają do aktywizacji ściśle określonego białka poprzez np. jego fosforylacje

• Szlaki typu MAP(mitogen activated protein) lub SAP (stress activated protein)

• Reagują na wiele sygnałów m. In. Na mitogeny (subst. Stymulujące podziały komórkowe)

• Zasada działania – kaskadowe przekazywanie sygnału

• Początkowo sygnał włącza białko na powierzchni komórki, potem przekazywany jest w dół szlaku sygnałowego(downstream), czasem aż do białek regulatorowych łączących się z DNA

37. Kwasy nukleinowe obiektem terapeutycznym oraz żrodłem „leków” nowej generacji

1. Wpływ na ekspresje genu poprzez oddziaływanie na procesy transkrypcji:

• Inhibicja procesu transkrypcji przez peptydy zawierające „palce cynkowe”

• Chemioterapeutyki specyficznie oddziałujące na proces transkrypcji genów

• Strategie z zastosowaniem oligonukleotydów tworzących struktury tripleksu z DNA

2) Strategie z zastosowaniem oligonukleotydów antysensownych

46) interferencja RNA – próba stworzenia „instrumentu”, którego od dawna poszukiwali genetycy kliniczni, którym będzie mozna wyłączać geny powodujące chorobę

47) Introny – „śmieciowy DNA” – jego część niezbędna do regulacji ekspresji genów (wytwarzają różne przekaźniki komórkowe w postaci wyspecjalizowanych form RNA – mikrona; działają jak przełączniki, które włączają lub wyłączają aktywność genu)