BIOLOGIA MOLERULARNA, WYKŁAD 10, 8.12.06

siRNA( small interfering RNA) małe interferujące RNA

• odkryte ok. 10 lat temu, Nobel 2006

• powstają z długich dwuniciowych RNA pochodzenia endogennego bądź egzogennego (podstawowe kryterium rozróżniania tych RNA od innych małych RNA, które mogą pochodzić z jednoniciowych prekursorów)

• długie dsRNA są przecinane przez RNazę z klasy RNaz III o nazwie Dicer, której homologi występują praktycznie u wszystkich eukariontów od drożdży, przez rośliny do zwierząt i człowieka, więc jest to zjawisko uniwersalne o kolosalnym znaczeniu biologicznym

• są to zwykle 22 (lub dwudziestokilku) nukleotydowe dwuniciowe cząsteczki charakteryzujące się że na 3' końcach mają niesparowane dwunukleotydowe wolne fragmenty nici a każda nić posiada na 5' końcu fosforan a na 3' końcu grupę OH

• tak powstałe małe RNA łącza się z kompleksem nukleazowym zwanym RISC (RNA induced silencing complex), którego funkcja polega na aktywowaniu tego dwuniciowego krótkiego fragmentu, przez usunięcie jednego z łańcuchów duplexu siRNA , usunięcie to jest katalizowane przez helikazę RNA- jeden ze składników tego kompleksu

• kompleks RISC z jednoniciowym fragmentem jest formą aktywną, który następnie odnajduje i przecina mRNA komplementarny do małego siRNA

Rys.

Ogólny prekursor małych RNA- długi dwuniciowy RNA (long double strand RNA), jest przecinany przez RNazę klasy III DICER na krótkie fragmenty - dwudziestokilku nukleotydowe siRNA z charakterystycznymi wolnym dwunukleotowymi fragmentami na 3'

końcu, te dwuniciowe fragmenty asocjuja z kompleksem RISC, który dzięki helikazowej aktywności usuwa jedną z nici RNA i w postaci aktywnej odnajduje mRNA komplementarny do tej nici, odnalezienie to jest możliwe dzięki jednemu białku kompleksu z rodziny Argonaute, które pośredniczy w wytwarzaniu dupleksów RNA-DNA (także RNA-RNA)- więc mamy sytuację, gdzie RISC jest zasocjowany z komplementarnym do siebie fragmentem mRNA, po czym nukleazowa aktywność tego kompleksu powoduje przecinanie tego mRNA na drobne kawałki (w środku rozpoznawanej sekwencji), które nie mogą już służyć jako matryca w syntezie białek. Podstawową więc funkcją siRNA jest niszczenie mRNA.

Składniki kompleksu RISC

• Zawierają konserwowane białko z rodziny Argonaute, które pośredniczy w oddziaływaniu RNA-DNA lub RNA-RNA (czyli wszystko to oparte jest o komplementarność tego małego RNA do docelowej sekwencji w mRNA, nie dzieję się to w „próżni jądrowej” tylko dzięki pośredniczącym w tym białku o aktywności enzymatycznej- twórczość własna profesora:P)

Źródła małego RNA

• Naturalnie występujące siRNA powstają z:

• transpozonów (często mają one takie układy, że po transkrypcji następuję asocjacja, są to komplementarne fragmenty, które asocjują ze sobą w dwuniciowym RNA),

• wirusów, które wytwarzają dsRNA podczas replikacji - tzn. często dwuniciowy RNA jest pośrednikiem ich własnej replikacji

• inne rodzaje dwukierunkowo transkrybowanych powtarzających się sekwencji czyli transkrybowane nici w przeciwnych kierunkach (na jednej nici i na drugiej nici) jako dupleksy mogą także tworzyć dsRNA

czyli odkryto, że w genomach znajdują się substraty dla dwuniciowych RNA-wow

U niektórych organizmów (szczególnie u nicieni i grzybów) małe RNA, mogą być produkowane nie tylko z tych dwuniciowych fragmentów, ale jeszcze dodatkowo amplifikowane dzięki obecności enzymu RNA-zależnej RNApolimerazy (RDRP-RNAdependent RNApolymerase)

Jak to się odbywa?

Taki dwuniciowy prekursor jest klasycznie przecinany przez Dicer na małe dwuniciowe fragmenty, które są następnie aktywowane przez RISC i służyć tutaj mogą do zniszczenia docelowego mRNA (czyli ukierunkowanej degradacji), inne natomiast fragmenty tego małego RNA mogą asocjować powtórnie z matrycą- w tym wypadku jednoniciowym RNA- i być transkrybowane przez RNAzależną polimerazę RNA (RDRP) z powrotem w długie fragmenty, które są znowu prekursorem dla Dicera. W ten sposób ilość tego RNA utrzymuje się na stałym poziomie (a nawet potrafi się zwiększać), dostarczając substratu do niszczenia mRNA.(!!! Ta amplifikacja nie występuje u wszystkich eukariontów. U Drosophila i ssaków interferencje RNA indukowane przez dsRNA zwykle zanikają po kilku podziałach !!!)

microRNA miRNA

• Mamy również do czynienia z drugim rodzajem małych RNA, które w końcowej postaci są nie do odróżnienia od siRNA , ale powstają z innego prekursora

• Okazało się, że u ssaków nicieni i owadów, także u roślin, wykryto setki małych RNA o różnych sekwencjach, które nazwano microRNA (nierozróżnialne od siRNA, 22 nukleotydy, charakterystyczne5' 3' końce, czyli zwieszające się fragmenty i odpowiedni fosforan i grupę OH)

• Wspólną cechą miRNA jest to, że sekwencje z których pochodzą są odnajdywane w bardzo charakterystycznych strukturach, które ogólnie są inne niż dwuniciowe RNA tzn- mają dwuniciowy trzonek i maja charakterystyczne pętelki, czyli tworzą spinki do włosów, zwykle nazywa się to stem-loop ( trzonek pętla), końcowe prekursory liczą zwykle około 70 nukleotydów (dwuniciowy trzonek i jednoniciowa pętelka), nie mają idealnej komplementacji w trzonkach. Powstają z długich pierwotnych transkryptów tzw. premiRNA, które w jądrze są przecinane do charakterystycznych szpilek o długości 70 nukleotydów, które są następnie eksportowane do cytoplazmy, gdzie Dicer wytwarza z nich miRNA (czyli najpierw powstaje premiRNA, a potem miRNA).

Rys.

Pokazano miRNA i siRNA.

siRNA - ich bezpośrednim prekursorem jest długi dwuniciowy RNA,( powstają z różnych trankryptów, transpozonów, replikacji wirusów, odwróconych powtórzeń), są eksportowane do cytoplazmy, mogą również pochodzić z zewnątrz (jako wirus lub poprzez transformowanie komórki konstruktem dwuniciowym -jak to można zrobić C. elegans albo poprzez wprowadzanie prekursora DNA który będzie takie dwuniciowe RNA syntetyzował )

miRNA - bezpośredni prekursor wychodzący z jądra: stem-loop (trzonek i zamykająca go jednoniciowa pętelka) powstają na DNA w różnych miejscach tzn. są na DNA takie sekwencje, które po transkrypcji będą dawały tego typu strukturę-zwykle dużo dłuższą. Struktury te są przecinane w jądrze do wielkości charakterystycznej.(Mówiąc inaczej: w DNA są sekwencje, które po transkrypcji będą miały dwie komplementarnie składające się nici i niekomplementarny fragment, który zakańcza strukturę pętelką. Możemy powiedzieć, że sekwencje wyewoluowały do tworzenia takiej struktury). Następnie, po wyeksportowaniu do cytoplazmy ta pętelka jest odcinana przez Dicer.

W obu przypadkach Dicer jest źródłem małych RNA, które wchodzą wspólnej puli i mogą być wykorzystywane do różnych celów

Oczywiście można wprowadzić gotową pulę siRNA wewnątrz liposomów (taką drogę stosuje się w terapii).

RNAi (interference)

• Małe RNA- od 20 do dwudziestu liku nukleotydów(20 do 30 praktycznie)

• Zjawisko powstało ( w zamierzchłych czasach) prawdopodobnie jako mechanizm obrony przeciwko wirusom (wyobraźcie sobie sytuacje pierwotnych komórek, które były pod stałym naporem rozmaitych mobilnych fragmentów DNA o dużej autonomii, czyli takich prawirusów, które dość intensywnie kolonizowały te komórki, w związku z czym te komórki (by zachować autonomię pod naporem kolonistów niosących informacje) musiały wytworzyć jakieś mechanizmy broniące ich przed inwazją- wydaje się, że RNAi został to tego wykorzystany; to jest jedna historyczna przyczyna. Jak to zwykle w ewolucji bywa rozmaite wynalazki koadaptowane są do innych rzeczy- są wykorzystywane przez komórki do utrzymania heterochromatyny na centromerach i obszarach zawierających wielokrotne powtórzenia

• Odmianą RNAi używaną do rozmaitych celów przez wszystkie znane eukarionty komórkowe jest mi RNA. Przy okazji pierwotnej funkcji (niszczenia wirusów), szybko okazało się, że wybiórcze niszczenie jest bardzo korzystnym mechanizmem, który można wykorzystać do innych rzeczy.

Mamy dwa modele zjawiska RNAi

PTGS Post transciptional gen silencing		TGS Przed albo w trakcie
pre-miRNA	Prekursor ds. RNA	dsRNA
↓		↓
miRNA	21-24 nt małe RNA	siRNA
↓		↓
RISC RNA induced silencing complex cięcie mRNA komplementarnego inhibicja translacji ma miejsce gdy komplementarność małego RNA fragmentu i odpowiadającemu mu mRNA nie jest 100% wtedy kompleks nie jest w stanie przecinać mRNA z którym zasocjował, ale jest wystarczająco silnie związany, aby uniemożliwić wiązanie się takiego mRNA do rybosomu i translacji (efekt jak przy cięciu-nie powstaje białko) F biologiczne ->regulacja ekspresji genów 30% ludzkich genów		RITS (RNA induced transcriptionsl silencing) blokowanie dostępu sekwencji DNA dla aparatu transkrypcyjnego tworzenia heterochromatyny Metylacja histonu H3 K9 Utrzymywanie globalnej architektury chromosomów Integralność centromerów (kluczowe dla podziałów) Kontrolowanie transpozonów (transkrybowane łatwo się przemieszczają, głównie metylacja, która idzie przez RNAi) Regulacja ekspresji genów

!!siRNA też uczestniczy w PTGS(o tym później)!!!!

Odkryta bardzo ważna droga regulacji ekspresji genów

Dlaczego istnieje możliwość regulacji w ten sposób, a nie wcześniej?

→wiemy o bardzo złożonych mechanizmach na poziomie inicjacji transkrypcji, splicingu, eksportu, różnych faz dojrzewania mRNA. Dlaczego już po tych wszystkich skomplikowanych procesach, przez które RNA przeszedł ( od regulacji inicjacji transkrypcji, przez capping, splicing, eksport) może być jeszcze zniszczony w cytoplazmie? Po prostu tak już jest: jest to cecha systemów biologicznych, iż nie ma właściwie etapu, gdzie nie ma jakiegoś systemu regulacji. Można też szukać ekonomiki tego procesu: w bardzo wielu przypadkach regulacją na poziomie inicjacji transkrypcji nie da się wszystkiego załatwić, potrzebny jest mRNA do wielu rzeczy, ale nagle w określonej grupie komórek (w trakcie na przykład różnicowania tkanki) ten mRNA musi być selektywnie znoszony i do tego właśnie służy system. Okazało się, iż te miRNA są intensywnie wykorzystywane przy końcowych etapach dojrzewania zarodka ( np. przy formowaniu się palców czy innych struktur, które wymagają selektywnego hamowania czy wyłączania komórek -wtedy włączany jest właśnie ten system)- co oczywiście oznacza, że regulacja jest przesunięta na jeszcze wcześniejszy etap-musi być cos co uruchamia miRNA.

Podział na miRNA i siRNA ułatwia uporządkowanie wiedzy na temat RNAi, ale w naturze nie do końca jest tak, że wszystko jest tak idealnie poklasyfikowane, przykład pracy Szymona Swieżawski (obecnie na post docu w Norwich) o zaangażowaniu małego RNA proces kwitnienia roślin.

Wyciszanie genów za pośrednictwem za pośredni mi RNA

Kwitnienie jest ściśle regulowane-wybór właściwego czasu kwitnienia jest kluczowy dla szlaku reprodukcyjnego roślin, ewolucja wyprowadził wiele ścieżek regulujących ten proces

Czynniki mówiące roślinie o tym czy już kwitnąć

• Zewnętrze: fotoperiod, temperatura, pora roku, i jeszcze jeden czynnik?

• Wewnętrzne: gibereliny- hormony szczególnie związane z indukcją kwitnienia

• Autonomiczna ścieżka- systemy genetyczne informują w jakiej fazie rozwoju się znajdują w danym momencie

FLC (flowering locus C) jest centralnym regulatorem kwitnienia (inhibitor przejścia od fazy wegetatywnej do fazy generatywnej) w późno kwitnących ekotypach Arabidopsis

• Układ zahamowany, stała supresja spowodowana genem FLC- roślina rozwija liście (ciągle tylko liście, liście) w rozecie i nie kwitnie….

• Jeśli FLC zahamowany- inhibitor znika, już przy kilku liściach pojawi się pęd kwiatowy i roślina kwitnie

• FLC jest długim genem z szeregiem intronów i eksonów

• Miarą czasu kwitnienia jest liczba liści w rozecie

• Eksperyment, w którym badano poziom FLC w ekotypach kwitnących wcześnie lub późno

→ mRNA FLC jest podwyższony u ekotypów kwitnących później ( im późniejsze

kwitnienie tym więcej liści w rozecie)

FLC podlega supresji przez ścieżkę autonomiczną (złożony system wzajemnych interakcji genowych, które ostatecznie mówią roślinie, że czas już się przygotować do kwitnienia, wtedy ta ścieżka uruchamia dwa białka, które razem hamują transkrypcję FLC i kwitnienie może ruszyć). Wiadomo jednak, iż nie jest to jedyny system kontaktu rośliny z systemem FLC.

Szymon zadał pytania: Czy RNAi jest zaangażowany w regulację FLC?

Czy istnieją małe RNA do locus FLC ?

Szymon wyizolował RNA, puścił na żel i hybrydyzował z różnymi locus FLC szukając czy w krótkich RNA znajdzie jakąś komplementarną sekwencje

Okazało się. iż istnieją małe RNA o sekwencji homologicznej do rejonu 3'FLC ( już po ostatnim kodonie ORFu)-sonda odnajduje fragment wielkości 27 nukleotydów, które specyficznie gromadzą się w łuszczynkach Arabidopsis. Istnieje też klasa 30 nukleotydowego RNA wykrywana tą samą sondą.

Czyli w roślinach istnieją małe RNA komplementarne to tego rejonu?

W genetyce roślin(i nie tylko) rozpowszechnione jest podejście, że dane zjawisko dobrze jest analizować w różnych tłach genetycznych (kolekcje mutantów z wyłączonymi genami rozmaitych szlaków) Szymon wybrał mutanta ścieżki polimerazy IV, która jest kluczowym enzymem w powstawaniu małych RNA (NRPD1a i NRPD1b)

Różne geny są związane z indukcją małych RNA u roślin. Okazało się iż w tych mutantach ścieżki Pol IV (w odróżnieniu np. od Ago1-skałdnik kompleksu RISC) niższy jest poziom małych RNA-27 nukleotydowego, co wskazuje iż RNA powstaje w tym szlaku

Zaleta Arabidopsis -dużo informacji o genomie, dostępne są informacje o profilu transkrypcyjnym obu nici na całej długości genomu

3' koniec FLC jest związany z transkrypcją w orientacji sens i antysens

• Sens: transkrypcja idzie zgodna mniej więcej z lokalizacją eksonów- gdzie eksony, tam podwyższona transkrypcja, cały 3' koniec jest mocno transkrybowany ( występuje w dużej ilości w cytoplazmie w postaci RNA)

• Na nici antysens w tych rejonach jest również podwyższona transkrypcja

• Mały RNA powstaje dokładnie z tego obszaru ok. 30 nukleotydów sekwencji nici sens

• Więc duniciowy musi powstawać tych dwóch transkryptów, ten dwuniciowy RNA musi być cięty przez Dicer, musi być później aktywowany i jest prawdopodobnie amplifikowany przez RNAzalezną RNApolimerazę

A co z funkcją biologiczną?

• W celu jej badania użyto w popularną w genetyce Arabidopsis metodę analizy mutantów inercyjnych (o wielkości nawet do kilkunastu tysięcy nukleotydów)-można wybrać mutanta praktycznie z każdą mutacją

• Udało się znaleźć 3 mutanty- przed rejonem, w rejonie 3'FLC i tuż za nim

• Mutanty T-DNA w rejonie 3'-FLC

• Efekt insercji na kwitnienie-obecny tylko w rejonie 3' FLC( skąd powstają małe RNA- zakłócenie poziom

• Insercja w rejon 3'FLCzaburza negatywną regulację FLC

Model RNAi

Okazało się iż w regulacji transkrypcji specyficznych genów mogą brać nie tylko miRNA, które niszczą transkrypty, ale również siRNA, bo ten badany fragment był typowym siRNA, nie ma on prekursorów w genomie - powstawał z rejonu do którego działał. Mogą one kontrolować nie tylko integralność chromosomów, transpozony, ale również ekspresję poszczególnych genów poprzez mechanizm TGS, czyli wyciszania transkrypcyjnego

Więc -> Regulacja FLC przez RNAi

Jak sprawdzić że to rzeczywiście działa na chromatynę?

ChIP chromatin immunoprecipitation

(!!!uwaga należy Chip-microarray- system do badania transkrypcji genów, na płytce umieszcza się sekwencji lub oligonukleotydy reprezentujące genom, do tego hybrydyzuje się pulę mRNA i uzyskuje się profil transkrypcyjny )

->Główne metoda stosowna wykazywania działania regulatorowego w odniesieniu do konkretnego rejonu chromatyny. Jak to działa?

Chromatyna ma poziom nukleosomu struktur wyższego rzędu aż po chromosomy metafazalne, cechuje się występowaniem w dwóch stanach

• Euchromatyny- rozluźniony, związany zwykle z aktywną transkrypcją

• Heterochromatyny-skondensowany związany z wyciszeniem transkrypcji

Znacznik heterochromatyny

(di)metylacja lizyny9 histonu H3 na N- końcu (H3K9me2) (<- używamy przeciwciał, które specyficznie rozpoznają tę modyfikację(rozpoznają tylko modyfikowaną lizynę))

ChIP

• Chromatynę(wyizolowaną) fragmentujemy na mniejsze kawałki (np. ultradźwiękami)

• dodajemy przeciwciała (specyficzne do dwumetylowanej lizyny9 H3)

• precypitujemy to co się połączyło z przeciwciałem na chromatynę (niezasocjowana chromatyna pozostanie w roztworze, ta z przeciwciałem zostanie zwirowana i będziemy ją mieli w osadzie)

• (wydobywany osad) oczyszczamy DNA osadu

• (mamy różne fragmenty które były zasocjowane z nukleosomami modyfikowanymi na lizynie 9

• PCR wybranych fragmentów (jeśli dana sekwencja była w heterochromatynie to ją znajdujemy, jeśli była we frakcji euchromatynowej to jej nie odnajdziemy)

Szymon: zrobił immunoprecypitację tym przeciwciałem do H3K9me2, sprawdzał jakie sekwencje się tam znajdują, okazało się, że w kontrolnym teście do sekwencji transpozonowej, odnalazł w tym immynoprecypitowanym DNA sekwencję transpozonową w różnych organach, w łuszczynkach i całych siewkach, liściach, zgodnie z oczekiwaniem bo transpozony są w heterochromatynie i mają H3K9dimetylowane, natomiast rejon 3'FLC końca tego kompleksu do którego małe RNA jest robione odnalazł tylko w łuszczynce zgodnie z tym gdzie odnajduje mały RNA, oznacza to, że ta sekwencja z której mały RNA ”się robi” jest w stanie heterochromatyny. Wykazano, że to jest bardzo wybiórcze (sprawdzając samo locus używając różnych primerów do różnych fragmentów) tylko ten fragment z którego jest robione małe RNA znajduje się w stanie heterochromatyny

RNAi służy wyciszaniu tego FLC poprzez heterochromatynizajcę jego rejonu 3'

Przykład transgresji genetycznych?

Znaczenie biologiczne i definicja pamięci komórkowej(sytuacja czy zjawisko które jest związane z zachowaniem „tożsamości komórkowej”)

• Dotyczy organizmów wielokomórkowych

• W organizmie wielokomórkowym niezbędne jest zachowanie „tożsamości komórkowej” stanu ustalonego w trakcie rozwoju (komórki amplifikując się musza pamiętać czym są)

• Musi być w jakiś sposób zachowywane i powielane

• Tożsamość komórek sprowadza się do charakterystycznego profilu ekspresji genów (różne będą profile dla komórek wątroby czy nerwowej)

• Dzisiaj uważamy, że pamięć komórkowa jest machizmem epigenetycznym umożliwiającym ustalone dziedziczenie tożsamości tych komórek (czyli tego określonego profilu ekspresji genów) z tego się wywodzi określenie co to jest mechanizm epigenetyczny

• Ze względu na taki sam DNA zmienne profile ekspresji muszą wynikać takich zmian DNA czy około DNA funkcjonującym aparatem, który powoduje że sekwencja jest zachowana a zmieniony profil dziedziczy się

Epigenetyka-wpływanie n to się dzieje z DNA z profilem ekspresji w szczególności bez zmiany sekwencji

Dziedziczenie epigenetyczne -dziedziczenie modyfikacje funkcji genów niezwiązane ze zmianami w sekwencji DNA,

Podstawowe mechanizmy epigenetyczne:

1. Modyfikacje chromatyny

metylacje DNA( w jakimś sensie są elementem modyfikacji chromatyny, ale dotyczą samego DNA) na ogół dotyczą dinuklotydów CpG, dotyczy to głównie zwierząt, u roślin natomiast również innych kontekstów CNG(cytozyna i guanina przedzielone innym nukleotydem) należy zwrócić uwagę, iż ten układ tez będzie symetryczny) takie symetryczne układy są łatwe do odtwarzania, u roślin zdarzają się też metylacje w kontekście asymetrycznym (do nie ma niczego co by dawało symetrię- gdzie jest cytozyna, metylowana zasada i jakiś nukleotyd- tzn. chodzi o układ CNN)

zdjęcie rentgenowskie heterochromatyny-widać wystające końce histonów rdzeniowych, acetylacja lizyny ( w histonie)—reakcje odwracalne

2. Modyfikacje histonów

N końce mogą być modyfikowane na różne sposoby postranslacyjnie( czyli histony są syntetyzowane w cytoplazmie, łączą się później w nukleosomy, tworzą strukturę włókna nuklosomowego i następują ich modyfikacje):

• Acetylacja lizyny( enzym acetylotransferaza histonowa HAT histone acethyltrasferase dołącza grupę acetylowi go γgrupy aminowej lizyny, powstaje Lacetylolizyna, która ewidentnie różni się od prekursora) modyfikacja zmienia ładunek z dodatniego na neutralny, co ma duże znaczenie dla chromatyny, jest to reakcja odwracalna (istnieje enzym, który deacetyluje->deacetylaza histonowa HDAC)

• Fosforylacja seryny

• Metylacja lizyny( może być mono-, di-, trimetylacja) i argininy( też może być acetylowana)

• H3 H4 H2aH2b w tych ogonach tez jest dużo możliwości rożnych modyfikacji

• Ubikwityn(yl)acja lizyny( oznacza skierowanie białka do degradacjo do proteosomu -taka jest funkcja w cytoplazmie, w jądrze są inne)

,

Potranslacyjne modyfikacje histonów w nukleosomie (przestrzenie wyobraźmy sobie DNA nawinięty na strukturę) ogony tworzą dodatkową ”planetoidalną” sferę wokół słońca, która może podlegać modyfikacjom, jest dostępna dla różnych enzymów modyfikujących.

Takie oznaczenie tych ogonów w bardzo istotny sposób naznacza strukturę we włóknie nukleosomowym (czyli może być ono silnie zróżnicowane przez modyfikacje tych ogonów)

Z tego wszystkie wyłania się swoisty obraz „kodu” który może być wprowadzony do chromatyny poprzez specyficzne wybiórcze modyfikowanie reszt histonów.

Można strukturalną podobnie do siebie chromatynę odróżnić za pomocą modyfikacji

Organizacja DNA w jądrze

Determinanty aktywnej i wyciszanej chromatyny

• euchromatyna-

• acetylowane histony (mają tendencje do oddziaływania z charakterystycznymi domenami białkowymi np. tzw bromodomeną- istotna domena między innymi acetylaz histonowych, czyli nie tylko zacetylowanie, ale i przyciąganie dodatkowych acetylaz, które mogą wzmagać acetylację,

• heterochromatyna-

• deacetylacja histonów,

• metylacja(szczególnie lizyny 9 w histonie H3, ale nie lizyny 4 w histonie H3 , która jest przeciwieństwem metylacji K9, jest raczej związana z aktywną postacią chromatyny) enzymy HMT histone methyl transferase, zmetylowane histony ściągają białka z chromodomeną Hp1 (heterochromatine protein1, pierwszy raz wykryte u Drosophili, powszechne) która rozpoznaję metylowane histony, i potem pośredniczy w wytwarzaniu silnie skondensowanych struktur),

• te znaczniki są dziedziczone( przekazywane stany acetylacji z pokolenia na pokolenie)

Przeciwstawne funkcje modyfikacji histonów

• Aktywna transkrypcyjnie chromatyna wysoko acetylowane H3 i H4 metylowana lizyna 4 histonu H3

• Brak aktywność-brak acetylacji histonów (czyli znak+ na N-końcu-lizyny) i metylacja lizyny 9 H3

• Znaczników jest więcej ale te są najbardziej istotne

3. Metylacja DNA

zamienia cytozynę w 5metylocytozynę (nie zmienia zdolności komplementacji, ale bardzo zmienia jej zewnętrzną strukturę, która oddziałuje z białkami)

Istnieją białka, które specyficznie rozpoznają te metylowane fragmenty chromatyny (skrót MDB methylDNA binding protein) białek te mogą indukować asocjację z innymi znacznikami, m.in. z chromodomenowymi białkami( heterochromatynizację)

U eukariontów metylacja nie jest uniwersalna:

• występuje u ssaków i roślin kwiatowych

• Zmienność gatunkowa, tkankowa, i w odniesieniu do lokalizacji na chromosomach

• Rozpoznawana przez rodzinę białek zawierających domenę wiążąca się do metylo CpG (metyl binding domain MBD)

• Zaciąga kompleksy białkowe indukujące lokalne zmiany w strukturze chromosomów i generalnie wyłącza ekspresję genów poprzez indukcję heterochromatynizacji

Przykłady ewolucyjnego efektu epimutacji (zmiany we wzorze metalacji DNA)

• Przyczyny istnienia dwóch odmian: Lwiej paszczy (wyżlin)- 2 odmiany o symetrii grzbieto-brzusznej i promienistej

• Pierwszą odmianę kwiatu o symetrii promienistej (działki kielicha płatki korony i wewnętrzne organy są ułożone promieniście) odkrył Linneusz ponad 200 lat temu, jest to stabilna odmiana.

• Pod koniec lat 90tych okazało się, iż przyczyną istnienia dwóch odmianie nie jest zmiana w sekwencji DNA, tylko zmiana epigenetyczna: Lcyc kontroluje symetrię grzbieto-brzuszną kwiatu, u mutanta nieaktywny z powodu silnej dziedzicznej metylacji (ten sam gen, ale promotor zmetylowany, zheterochromatynizowany i gen jest nieaktywny) ->jeśli w tej formie obniży się stopień metylacji DNA( np. poprzez zastosowanie inhibitorów itp. kwiat wraca do symetrii grzbieto-brzusznej)

Przebudowa chromatyny zależna od ATP

• zmiany dotyczące danych nukleosomów, takich jak przesuwanie na nici DNA, zmiana konformacji, a nawet zrzucanie z jednaj nici i przesyłanie na drugą nić DNA

• Silnie sprzężone z modyfikacjami histonów i metyzacją DNA

• Katalizowane przez kompleksy remodelujące chromatynę (chromatine remodelling complex) -one dokonują tych zmian, istnieje ich klika klas tych kompleksów (ich nazwy pochodzące z obserwacji np. switch zmiana typu koniugacyjnego u drożdzy)

• Ich centralną podjednostką jest DNAzależna ATPaza i zasocjowane z nią inne podjednostki białkowe (część rdzeniowa kluczowa dla działania kompleksu, część z nich to są dodatkowe nadające status cząsteczkom(jaki?...) i dzięki aktywności tej ATPazy, która jest w wstanie -przy pomocy hydrolizy ATP- zmieniać, dokonywać tej przebudowy

• jest ich znanych 5 typów

• przykładowy kompleks ATPazy ma bromodomenę, która rozpoznaje acetylowane histony, a inny ma chromodomenę, która rozpoznaje metylowane histony co wskazuje na związek przebudowy chromatyny z modyfikacjami histonów

Procesywność- czyli samonapędzanie się procesów

Architektura chromatyny w jądrze-hetero i euchromatyna

Ze stanami chromatyny są silnie związane znaczniki epigenetyczne

• Aktywna euchromatyna wysoki poziom acetylacji H3 i H4 i acetylowana lizyna 4, prawie brak metylacji DNA, silne zaangażowanie kompleksy remodelujące

• Heterochromatyna silnie modyfikacja lizyny9 H3, zmetylowane DNA, deacetylowane histony, silnie zaangażowane kompleksy remodelujące

Małe RNA( siRNA) rozpoznające docelowe sekwencje

TGS-

• zaczyna się od rozpoznania sekwencji która ma być zmieniona

• RITS wiąże się z transkryptem, który powstaje na locus, które ma ulec wyciszeniu

• „Ściągane” są metylotransferazy DNA (etylujące DNA), co umożliwia rozpoznanie tego fragmentu przez deacetylazy histonowe, które deacetylują ten rejon, następnie następuje metylacja lizyny 9 H3 - nie wiadomo jednak co jest pierwsze: matylacja DNA czy modyfikacja histonów?

• wciąganie białek Hp1 i heterochromatynizacja

Zakłócenie mechanizmów epigenetycznych ma poważne konsekwencje

Swi/SNF ( u drożdży, Drosophili, człowieka i u Arabidopsis)

[Atbrm?( ATPaza)-tak się nazywa u Drosophili]-

• 4 składniki rdzeniowe: 2 różne białka swi3, 2 białka swp73, SNF5

• SNF5 u ludzi najsilniejszy znany represor nowotwór epigenetycznych, wystarczy jedna mutacja w tym genie (i nie potrzeba nic więcej!) do powstania nowotworu (szczególnie dziecięce nowotwory) -tak silnie jest zaburzona epigenetyka-[chromatynową regulację aktywności genów]

• !!w normalnej etiogenezie muszą występować kolejne mutacje ( 1,2,3,4,5- dopiero wszystkie mutacje dają nowotwór -cześć osób może mieć 1 mutacje, cześć drugą, cześć czwartą i nic się nie dzieje)

• Świadczy to o wadze systemu remodellingu dla utrzymywania pod kontrolą tego co się dzieje w komórce

Rośliny -

• 4 różne klasy swi-Ab ( to jest wyjątek u człowieka są 2 podobne) mogą tworzyć homodimery- kombinatoryczne możliwości(?)

• ATPaza, SNF5

• Swi3a, swi3b, swi3c, swi3d, (a i b mogą tworzyć homodimery)

• Mutacje (duże inserty inaktywujące gen) w każdym genie swi-

• mutacja swi3a-embrioletalność-kilkanaście komórek, heterozygoty nie rozwijają się

• swi3b embrioletalność gametofitoletalność (gamety się nie rozwijają)

• swi3c-małe rośliny, defekty w kwiatach, skrócone korzenie, nie jest embrioletalność

• swi3d- mikroskopijna roślina, bardzo zaburzona, potomstwa nie wyda

• kluczowa rola tych genów w rozwoju

Mapa interakcji dla białek swi3c

Drożdżowy system dwuhybydowy wykorzystany dla szukania partnerów białek swi3c-oddziałują z systemem proteolizy, deacetylacji histonów i innymi systemami, czyli układ remodelingu chromatyny powiązany z dziesiątkami innych białek, głównie dlatego, że jest egzekutorem sygnałów, które dochodzą do chromatyny, jądra z różnych ścieżek sygnałowych.

11

---