01.12.06r

Biologia molekularna wykład 9

Transkrypcja u eukariontów.

Krótki przegląd sekwencji DNA eukariontów:

1. Sekwencje kodujące u człowieka stanowią ok. 0,015 % wszystkich sekwencji. Reszta to sekwencje powtarzalne (repetity) i sekwencje międzygenowe (intergenic). W genomie obok sekwencji kodujących (zawierających otwarte ramki odczytu dla białek) i sekwencji kodujących pewne fragmenty RNA o znaczeniu funkcjonalnym (rRNA, tRNA, małe RNA) stoją związane z nimi sekwencje regulatorowe(nie kodują niczego, ale mają kluczowe znaczenie w regulacji): promotory, enhancery (wzmacniacze) i izolatory. Sekwencje wielokopijne, np. geny RNA- powtarzające się, kodujące sekwencje.

2. Sekwencje powtarzalne (repetytywne) -wyróżniamy dwie grupy:

• średnio powtarzalne sekwencje- dwie klasy:

• retrotranspozonowe sekwencje, mobilne elementy genetyczne (autonomiczne i nieautonomiczne), przykładem u człowieka jest sekwencja Alu (występuje tysiącach kopii, rozrzucona pomiędzy genami w różnych miejscach, jest pochodną rozmaitych wydarzeń historycznych w genomie, a także efektem „samolubności genomu”, tzn. takie sekwencje lubią się samopowielać i rozprzestrzeniać po genomie)

• powtórzenia występujące obok siebie (tandemowo)- rozmaite klasy: mikrosatelity, minisatelity,

• wysoko powtarzalne sekwencje- nagromadzenia setek, tysięcy, a nawet miliona kopii krótkich fragmentów charakterystycznych sekwencji, np. DNA satelitarny, centromerowy. W jaki sposób odkryto satelitarne DNA? Otóż fragmentowane DNA wirowano w gradientach chlorku cezu (rozdziela DNA wedle gęstości). Sam chlorek cezu układa się po ultrawirowaniu w naturalny gradient (od najmniej gęstego do najbardziej gęstego na dole próbowki). Gradient ten stabilizuje się po kilkunastu godzinach wirowania i substancje naniesione na ten gradient dążą do osiągnięcia półki ze swoja gęstością. Okazało się, że po naniesieniu DNA otrzymujemy jakiś główny pik DNA i pik DNA satelitarnego o innej gęstości (gęstość DNA wynika z proporcji A=T do G≡C). DNA satelitarny jest bardzo jednorodny i ma charakterystyczną proporcję A=T do G≡C, która odbiega od średniej proporcji, dlatego wydziela się jako odrębny pik.

Arabidopsis thaliana

Można zauważyć, że geny (sekwencje kodujące) są rozmieszczone dość równomiernie w ramionach chromosomów (z wyjątkiem telomerów, gdzie ich nie ma i rejonu centromerowego i przycentromerowego, gdzie też jest ich mało albo brak). Transkrypty (w średniej populacji komórek) są rozrzucone w ramionach chromosomów, praktycznie ich nie ma w dużym obszarze wokół centromeru (i to się powtarza w praktycznie każdym chromosomie).W transpozonach sytuacja jest odwrotna: tam, gdzie jest dużo genów transkrybowanych mamy niską gęstość transpozonów, tam gdzie ich nie ma- gęstość transpozonów wzrasta silnie (i to równe powtarza się w każdym chromosomie). W regionie centromerowym bardzo duże stężenie transpozonów.

Rodziny genowe:

• mocno rozproszone, gdzie są liczne powtórzenia genów, np. geny α- i β- globiny u kręgowców (składa się z genu, sekwencji promotorowej, regulatorowej- enhancera), geny, w różnych wersjach porozrzucane są po chromosomie na dość dużej odległości (gen β- globiny- chromosom 16 gen α- globiny na chromosomie 11, odległość 60 tys. bp). Globiny te wchodzą w skład hemoglobin jako część białkowa. W rozwoju (hemoglobina płodowa, dziecięca i osób dorosłych) proporcja globin się zmienia (znaczenie fizjologiczne). W genomie jest to odbite z występowaniem rodziny genowej globin, jest tam miejsce, które nazywa się locus wspólnie kontrolowanym genu i który podlega wspólnej regulacji sekwencji znajdującej się na początku locus control region (LCR), którego funkcje są bardzo skomplikowane;/ (działa nadrzędnie w stosunku do tego locus jako sekwencja regulatorowa rozproszonej rodziny genowej)

• zwarte rodziny genowe (geny rozłożone tandemowo, położone jeden obok drugiego), np. w jednym z chromosomów Dorsophila- geny kodujące histony (cały komplet jest zawarty w jednej jednostce wielogenowej- a, b, c, d, e kodują histony: H1, H4, H2a, H2b, H3 czyli właściwie komplet tego co jest potrzebne do zbudowania nukleosomu)- takie jednostki są wielokrotnie powtórzone obok siebie (takie ułożenie jest związane z funkcją tych genów- białka występują stechiometrycznie w nukleosomie i takie ułożenie jest korzystne dla transkrypcji- można ją wykonywać pod stałą kontrolą).

Geny kodujące białka

U eukariontów geny w większości nieciągłe (egzony i introny)- odkrycie sprzed dwudziestu paru lat nagroda nobla Phillip Allen Sharp Richard Roberts (1993). Eukarionty różnia się pod względem % intronów w genomie: drożdże 5% , u roślin i zwierząt 80-90% i więcej (różnorodna wielkość często związana z wielkością genomu), np. gen dystrofiny człowieka (mutacja w nim powoduje dystrofię mięśniową Duchenn'a): ogromny, 75 intronów (2,5 mln bp, największy znany gen), egzony stanowią w nim tylko 0,5% (11tys. bp); długość intronów waha się od kilkudziesięciu bp (wirus SV 40) aż do ponad 200tys. w dystrofinie. Najbardziej prawdopodobny sens istnienia intronów zawarty jest w koncepcji Waltera Gilberta (amerykański biochemik, w 1980r. dostał nagrodę Nobla z jedną z metod sekwencjonowania DNA):

• geny podzielone wyewoluowały, jest to świat bardzo starej organizacji funkcjonalnej genomu, w którym kluczowym elementem były fragmenty DNA kodujące moduły strukturalne w białkach (kilkaset rodzajów fałdów spotykane w różnych białkach, z punktu widzenia kombinatoryki tych fałdów w białkach byłoby korzystne ewolucyjnie gdyby one były przedzielone jakimiś fragmentami, które wspomagają rekombinację- wtedy mogą się mieszać w trakcie rekombinacji); obecność takich przerw sprawia, że rekombinacja rzadziej trafia w jakieś kluczowe miejsce kodujące ten fałd, a częściej pomiędzy; w związku z tym te fałdy mogą się przerekombinowywać, dzięki czemu mogą powstawać nowe skuteczne kombinacje motywów w białkach; taka organizacja genów umożliwia dodatkowo splicing alternatywny

• inne badania, które szczegółowo analizowały pokrewieństwa sekwencyjne szczególnie rejonów bliskich intronom nie potwierdzają tej tezy

Transkrypcja u eukariontów

Transrypt to kopia nici matrycowej DNA, czyli o sekwencji identycznej jak sekwencja nici kodującej. Podstawowe elementy systemu transkrypcji:

• polimerazy RNA, czyli enzymy, które przepisują DNA,

• czynniki transkrypcyjne

• sekwencje regulatorowe w DNA, nazywane sekwecjami cis

Topologia w komórce- jądro komórkowe. Dopiero gotowy transkrypt jest eksportowany przez pory jądrowe na zewnątrz (również regulowany proces), wewnątrz cytoplazmy służy jako matryca (także poddawany regulacji).

Bakteryjna polimeraza RNA- kompleks złożony z 4 podjednostek: α, β, β', σ (sigma) o masie ok. 500kDa. α, β, β' stanowią aktywną część enzymatyczną (rdzeń polimerazy), natomiast czynnik σ słuzy do wiązania RNA polimerazy do promotora (bez niego enzym ma słabe powinowactwo do RNA).

Cztery typy polimeraz eukariotycznych:

1. mitochondrialna polimeraza RNA, u roślin także chloroplastowa

Jądrowe polimerazy:

2. RNA polimeraza I- produkuje rybosomalny RNA, zlokalizowana jest w jąderku (tu grupują się sekwencje rybosomalnego RNA), ma budowę podjednostkową, niewrażliwa na α-amanitynę (występuje w muchomorach)

3. RNA polimeraza II- transkrybuje geny kodujące białka, niektóre małe RNA (w tym te wchodzące w skład slicozomu- aparatu do wycinania intronów), hn RNA (high nuclear RNA); RNA polimeraza II transkrybuje czasem obie nici (matrycową i kodującą) na tej samej jednostce traskrypcyjnej (nić kodująca jest transkrybowana w drugą stronę z dużą częstością); transkrybuje ogromne fragmenty międzygenowego DNA; zlokalizowana jest w nukleoplaźmie poza jąderkiem, ma budowę podjednostkową, jest bardzo wrażliwa na α-amanitynę (najwrażliwsza z polimeraz eukariotycznych)

4. RNA polimeraza III- transkrybuje małe RNA niekodujące białka: kilkadziesiąt rodzajów tRNA, 5sRNA (najmniejszy RNA rybosomu), zlokalizowana w nukleoplaźmie poza jąderkiem, o podjednostkowej budowie, umiarkowanie wrażliwa na α-amanitynę

Więcej o Pol II:

Kompleks białkowy o masie ponad 500 kDa, ma dwie duże podjednostki i ok. 10 małych. Największą z nich jest homologiczna do β' podjednostki prokariotycznej, kolejna do podjednostki β. Do związania się z DNA nie wystarczy jeden czynnik (tak jak u bakterii)- potrzeba wielu czynników nienależących do kompleksu polimerazy.

Krótko o bakteryjnej polimeryzacji:

RNA polimeraza (rdzeń) w obecności czynnika σ rozpoznaje promotor, dzięki czemu jest w stanie rozplatać nici DNA przed promotorem i dokonywać transkrypcji (wtedy σ się odłącza i może przyłączyć się do innej cząsteczki). U prokariontów rejon przyłączania się σ to dwie charakterystyczne sekwencje w położeniu: -10bp (kasetę TATA) i -35bp. Sekwencje te są wyróżniane, gdyż przed większością genów są podobne (ale niekoniecznie identyczną). Sekwencja consensus- najbardziej typowa i najczęściej spotykana przed większością genów. Zmienność TATA: czasami zamiast T jest A, C zamiast T, G zamiast A.

A teraz promotory polimeraz Eucariota:

• Pol II: rejon promotora jest zwykle dłuższy niż u Procariota (ok. 300bp), kaseta TATA położona 30bp przed miejscem startu transkrypcji (-30bp); jest obszar bardziej odległy tego promotora i są obszary umieszczone w znacznej odległości od genu (kilkuset do kilkudziesięciu tys. bp), które noszą nazwę enhancerów (wzmacniacze, mogą być up-stream czyli od strony 3' i down-stream czyli 5' - nie ma znaczenia, z której strony genu są umieszczone). Czyli jednostka regulatorowa jest bardziej obszerna niż u prokariontów (sięga wielu tys. bp)

• Pol I: dwuskładnikowy promotor: -45bp do +20 (zachodzi na sekwencję genu), -107 do - 180

• Pol III: dwa typy promotorów:

• promotor wewnętrzny- jest fragmentem genu (+1005bp do +80bp), polimeraza przyłącza się właśnie do niego i transkrybuje 5sRNA

• promotor zewnętrzny- bardziej przypomina klasyczny promotor (sekw TATA) i jest używany do transkrypcji innych RNA (snRNA)

We wszystkich eukariotycznych polimerazach mamy do czynienia z ogólnymi czynnikami trankrypcyjnymi (general transcription factors). Stanowią one wraz z polimerazą podstawowy aparat transkrypcyjny. Wiążą się do sekwencji w obrębie bliskiego promotora i dalej do miejsca startu transkrypcji. Kolejnym elementem kompleksu transkrypcyjnego są aktywatory- są to czynniki transkrypcyne, które bezpośrednio oddziałują z DNA, rozpoznają sekwencje i specyficznie się do niej wiążą, albo w obrębie dalszego promotora (do 300bp, ale nie tak blisko jak TATA), albo w obrębie enhancera. Kolejnymi elementami są koaktywatory i korepresory- białka, które nie oddziałują bezpośrednio z DNA, natomiast pośredniczą w oddziaływaniu między czynnikami transkrypcyjnymi (związanymi z dalszymi promotorami, albo enhancerami a podstawowym aparatem trankrypcyjnym). Porównanie prokarotycznego i eukariotycznego systemu transkrypcyjnego:

• w prokariotycznym systemie nie ma na DNA zbyt wiele elementów, które bezpośrednio kontrolowałyby promotor lub gen (są w pewnej odległości sekwencje, które działają poprzez aktywatory, ale ich jest mało)

• u eukariontów system jest bardzo rozbudowany: duży obszar podstawowego kompleksu transkrypcyjnego, który oddziałuje z rozmaitymi dodatkowymi czynnikami transkrypcynymi związanymi w innych miejscach DNA (a te w sposób bezpośredni lub pośredni poprzez aktywatory i korepresory wpływają na transkrypcję)

wniosek: system regulacji genów u eukriontów jest bardzo skomplikowany, co ma odbicie w zarówno w strukturze sekwencji cis regulatorowych, jak i w różnorodności białek biorących udział w regulacji przebiegu transkrypcji.

W genach eukariotycznych przed kasetą TATA jest odcinek ok. 300bp (rejon właściwego promotora- bliższego), w którym występuje szereg charakterystycznych motywów sekwencyjnych. Są to motywy rozpoznawane przez czynniki transkrypcyjne. Motywy sekwencyjne są dość krótkie (7-15bp), mogą na siebie zachodzić, w związku z czym na odcinku 300bp jest bardzo dużo. To jest własnie klasyczny układ cis regulacji genu. Występowanie przełączników (tzw. switcher) kontrolujących stan transkrypcji. Znamy już kilkadziesiąt charakterystycznych motywów, wiemy jakie czynniki transkrypcyjne z nimi oddziałują. Zakłada się, że motywów transkrypcyjnych w genomie może być kilka tysięcy (nie ma idealnych algorytmów do wyszukiwania tych motywów, są dobre, ale one nie wystarczają). Od profilu motywów zależy to, co się dzieje z genem (ma to kluczowe znaczenie w regulacji- w tym jest zakodowana informacja rozwojowa). Międzygenowa sieć logiczna, która stoi za powstaniem i rozwojem organizmu to efekt kodowania cis sekwencji
i interakcji wzajemnych między elementami trans (czynniki transkrypcyjne) a siecią cis,
np. u jeżowca rozszyfrowano szereg podstawowych schematów interakcji cis elementów, które dają pewne typy budowy ciała. To jaka kombinacja czynników transkrypcyjnych przyłączy się do DNA decyduje o tym co się dzieje z genem. Zależy to od:

• obecności czynników w cytoplazmie

• stechiometrii i konkurencji czynników transkrypcyjnych

Czynniki transkrypcyjne- białka monomeryczne lub dimeryczne, które wykazują zdolność do wiązania z DNA i oddziaływań z czymś poza DNA (aparatem transksypcyjnym, koaktywatorami i korepresorami). Budowa dwudomenowa:

• domena wiążąca się z DNA- DBD (DNA binding domain)

• domena aktywująca- AD (activation domain)

Jest kilka klas czynników pod względem struktury przestrzennej (głownie chodzi o motywy w nich występujące), np.:

• AP1- ma dwa białka oddziałujących ze sobą za pomocą suwaka leucynowego (układ dwóch helis białkowych, w którym leucyny sterczą w periodycznym ułożeniu w taki sposób, że z drugim takim ułożeniem mogą tworzyć oddziaływania i w związku z tym powstaje coś, co wygląda jak zamek błyskawiczny- stąd nazwa); wykrycie motywu suwaka jest silną wskazówką do tego, że jest to czynnik transkrypcyjny

• motyw palców cynkowych- domena wiążąca DNA, bardzo wiele czynników go posiada, wykryty przez Knuga???? w czynniku TF3c- obsługuje polimerazę III, ma
  7 palców cynkowych, do wystąpienia tego motywu potrzebna jest charakterystyczna konfiguracja aminokwasów: Cys-Cys-His-His, które stanowią „niszę”, w której pasuje atom cynku -tworzy wiązania koordynacyjne z aminokwasami, dzięki czemu ma sztywną strukturę i bez problemu wnika w helisę DNA. Pozostałe aminokwasy
  (w motywie palców cynkowych) decydują o specyficzności wiązania do DNA.

• motyw helix- turn- helix (helisa- skręt- helisa), np. w represorze faga λ motyw ten daje taką helisę, która sferycznie dobrze pasuje do różnych DNA i może umożliwić specyficzne interakcje konkretnych aminokwasów z podstawnikami zasad w DNA,
  co powoduje związanie się czynnika. Sama interakcja z DNA jest możliwa wtedy, gdy odpowiednie powierzchnie DNA są w ogóle dostępne, np. jeśli miejsce wiązania czynnika jest dostępne co skok (wielokrotność 10 nukleotydów, sekwencja umożliwiająca wiązanie jest na zewnątrz) - tak jest właśnie w tym czynniku-
  a sekwencja wiążąca w jakiś sposób znajdzie się po drugiej stronie (np. na skutek oddziaływań z nukleosomem) to wiązanie czynnika jest uniemożliwione.

Inicjacja transkrypcji przez Pol II:

Proces sekwencyjny, rozpoczyna się wiązaniem czynnika TF2D do sekwencji TATA, następnie przyłącza się główny kompleks polimerazy i pozostałe główne czynniki: TF2A, B, E, F, H. Jednak taki kompleks ma niewielką aktywność transksypcyjną. Czynnik TF2D składa się z: TBP (ang. TATA-binding protein, pojedyncze białko)-białka rozpoznającego
i wiążącego sekwencję TATA, oraz podjednostek związanych z TBP- TAFs
(ang. TBP-associated factors, stanowią podłoże dalszej aktywności systemu). Aby polimeraza zaczęła transkrybować potrzebne jest dodatkowe działanie aktywujące, dostarczane przez czynniki transkrypcyjne, wiążące się z cis sekwencjami w dalszym promotorze, bądź enhancerze.

Dwudomenowa struktura prowadzi nas do objaśnienia bardzo skutecznego systemu badania interakcji białkowych - drożdżowego systemu dwuhybrydowego. Jeżeli czynnik transkrypcyjny (w tym przypadku GAL4) rozdzielimy na dwie części (domenę wiążącą od domeny aktywującej) to okazuje się, że te domeny nie musza być połączone, żeby działać. Jeśli do jednej i do drugiej części przyłączą się jakieś białka i eksprymują się w komórkach drożdży, w których istnieje gen reporterowy kontrolowany przez czynnik GAL4, to jeśli te dwa przyłączone białka oddziałują ze sobą, to nastąpi aktywacja tego genu reporterowego. Możliwość działania na odległość (enhancery) związana jest z elastycznością DNA. DNA w strukturze m.in. chromosomów ma bardzo elastyczną geometrię (może się „zaginać”). Zatem enhancer do którego będzie przyłączone jakieś inne białko może znaleźć się w takiej odległości od promotora, że to oddziaływanie będzie miało miejsce i będzie wpływać na transkrypcję.

(dla mnie to trochę niezrozumiałe, dlatego zamieszczam wersje z neta)

Drożdżowy system dwuhybrydowy (ang. Yeast Two Hybrid) służy do badania oddziaływań między dwoma potencjalnymi partnerami białkowymi. W technice tej wykorzystuje się fakt, że wiele eukariotycznych czynników transkrypcyjnych zawiera dwie funkcjonalnie niezależne domeny. Jedna z nich wiąże się z DNA (BD, ang. Binding Domain), druga natomiast aktywuje transkrypcję danego genu (AD, ang. Activation Domain). Obie te domeny są zatem niezbędne aby nastąpiła transkrypcja określonego genu.

W drożdżowym systemie dwuhybrydowym każda z tych domen zostaje połączona z jednym z potencjalnych i będących przedmiotem badań, partnerów białkowych. W efekcie powstają dwa tzw. białka fuzyjne: jedno z nich związane z domeną wiążącą się z DNA (BD), drugie zaś z domeną aktywującą transkrypcję (AD). Geny kodujące oba te fuzyjne białka znajdują się na dwóch różnych plazmidach. Plazmidy te wprowadza się do komórek drożdży, zatem oba białka podlegają ekspresji w tej samej komórce. Jeżeli badane białka oddziałują ze sobą, obie domeny: aktywująca transkrypcję (AD) i wiążąca się z DNA (BD), zbliżają się do siebie na tyle blisko, by móc aktywować transkrypcję konkretnego genu, np. genów reporterowych: gen kodujący β-galaktozydazę (lac-Z) lub HIS3.

Izolatory- elementy regulatorowe, sekwencje rozdzielające geny, które nie pozwalają na związanie się enhancera do promotora nieodpowiedniego genu (helisa DNA może się wykręcać i w związku z tym istnieje niebezpieczeństwo, że enhancer zbliży się do niewłaściwego genu), ich funkcją jest wiązanie kompleksu białkowego, który uniemożliwia nieodpowiednie zaginanie helisy DNA.

Obecnie znamy kilkadziesiąt białek wchodzących w skład rozszerzonego kompleksu transkrypcyjnego, zapewniającego aktywną transkrypcję genu na matrycach nukleosomowych (część czynników transkrypcyjnych pełni istotną funkcję w odniesieniu do nukleosomów, np. czynnik GCN5- pierwszy odkryty czynnik, okazał się acetylotrasferazą histonową- przenosi grupy acetylowe na histony). Część koaktywatorów służy do zdejmowania nukleosomów lub zmiany konformacji tychże. Zestaw obsługujący transkrypcje liczy jakieś 150 białek (Pol II).

Dalsze losy transkryptu:

1. Na 5' końcu transkrypt jest modyfikowany, poprzez przyłączenie guanozyny do pierwszego nukleotydu (zwykle G lub A) charakterystycznym wiązaniem- między 5' końcem a 5' guanozyny, w związku z czym ma on inną odporność na rozmaite nukleazy (zabezpieczenie przed przecięciem), etc. Reakcja przyłączenia guanozyny jest katalizowana przez odpowiedni enzym, a sama guanozyna metylowana w pozycji 7 (czasami metyzacji ulegają również zasady przylegające bezpośrednio do guanozyny). Jest to tzw. czapeczka (ang. caping). Osłonięcie 5' końca:

• ma za zadanie stabilizować mRNA

• ma związek z transportem mRNA - są białka wiążące się do tego końca, które mają istotne znaczenie w wydostawaniu się mRNA do cytoplazmy

2. Splicing- wycinanie intronów, związane z bardzo konserwowaną granicą między intronem a egzonem, miejsca połaczenia egzon- intron są bardzo sekwencyjnie konserwatywne, wyróżniamy tam miejsce donorowe i miejsce akceptorowe oraz miejsce rozgałęzienia (bliżej miejsca akceptorowego,), one wszystkie maja charakterystyczne układy sekwencji szczególnie bliżej intronu. System splicingu działa na zasadzie interakcji kilku małych RNA asocjowanych z małymi białkami (U1, U2, U4, U5, U6), które w sekwencyjnym układzie działają w następujący sposób: staking rozpoczyna się oddziaływaniem kompleksu U1 snRNA z miejscem donorowym. Jednocześnie U2 snRNA oddziałuje z miejscem rozgałęzienia (jest to możliwe, gdyż w snRNA są sekwencje komplementarne do tych granic). Przyłączone kompleksy umożliwiają dołączenie kolejnych kompleksów snRNA z małymi białkami (U4, U6 i U5), które razem tworzą kompleks przybliżający końce egzonów i wypętlający intron. W miejscu rozgałęzienia jest adenina, której wolna grupa -OH jest wykorzystywana do ataku nukleofilowego, który pozwala rozciąć wiązanie przez splicozom. Efektem jest tworzenie tzw. lassa, które jednocześnie wytwarza wolną grupę -OH na miejscu przeciętym donorowym, co w kolejnej reakcji powoduje przecięcie następnego miejsca styku intronu z egzonem i spojenie, dzięki wolnej grupie -OH, egzonu z egzonem (dokładnie w miejscu, w którym zachowana jest ramka odczytu, dokładność do 1 zasady). Efektem jest wyrzucenie na zewnątrz niepotrzebnego już lassa i spojenia egzonów (powstaje dojrzały mRNA). Zwykle wycięty intron ulega degradacji, ale okazało się, że niektóre z nich zawierają istotne funkcjonalne sekwencje, np. u niektórych eukariontów część białek rybosomalnych jest kodowana w intronach, często zawierają sekwencje regulatorowe.

W zależności od typu białek (U1, U2, itd.) komórka może regulować, które z intronów mają być wycięte i które egzony są z sobą łączone. Może wyciąć cały obszar intronu i egzonu, np. może wyciąć intron 2 i intron 5, wyrzucić całość i połączyć egzon 1 i egzon 5. to jest właśnie splicing alternatywny (zróżnicowana kombinacja egzonów). Proces jest sterowany przez szereg białek splicozomowych, ale: informacja o tych białkach musi być zakodowana w DNA, zatem musi być jakiś system przełączników (cis elementów), które decydują o zestawie białek splicozomowych w danym momencie, w danej komórce. Jest to powszechne zjawisko, u człowieka 60-80% genów jest składanych w ten sposób.

Jak to obserwujemy???

Różnej długości transkrypty danego genu występują w mózgu, wątrobie, w liściach, korzeniach, kwiatach świadczą o zupełnie innym splicowaniu. Czyli ten sam gen może służyć do kodowania niejednego białka. Splicing i metylacja guanozyny (tworzenie czapeczki) odbywa się równocześnie, jeszcze w trakcie transkrypcji.

3. Poliadenylacja 3' końca- ma miejsce pod koniec transkrypcji, kiedy polimeraza przejdzie pewien punkt za końcem ramki odczytu i w pewnym momencie istnieje sekwencja consensusu (u zwierząt jest dość wyraźna, u roślin nie ma tak wyraźnej tej sekwencji, mimo to poliadenylacja następuje), która transportowana jest przez inny kompleks poliadenylujący, który ja przecina i enzymatycznie dołącza adeniny. Poliadenylowany 3' koniec charakteryzuje większość genów eukariotycznych. Wyjątki, np.: histony zwierzęce nie mają adenylowanego końca 3', natomiast mają konserwowaną sekwencję, która tworzy pętelkę RNA, która jest rozpoznawana przez białka (inne niż w przypadku poliadenylacji) tworzące tzw. spinkę (ang.herping)- to powoduje, że sposób degradacji tego końca mRNA jest inny niż w przypadku poliadenylowanych mRNA. Jednym
   z istotnych elementów regulacji, który wychodzi poza jądro jest stabilność mRNA. Zapewnia ją czapeczka na 5' końcu i (w większym stopniu) modyfikowany koniec 3'. Nietypowy 3' koniec histonów syntetyzowanych w trakcie replikacji DNA służy do wspólnego sterowania degradacją niepotrzebnego mRNA w cytoplazmie (w momencie ustania replikacji DNA powinna ustać translacja histonu).

Jeśli chcecie poczytać więcej, zajrzyjcie: http://zguw.ibb.waw.pl/~knbm/bmwi/podrek/gen_eu/gen_eu4.html

1

---