Zróżnicowanie budowy i funkcji RNA

RNA kodujący

RNA informacyjny, mRNA (messenger RNA), które są transkryptami genów kodujących białka, a więc ulegają translacji do białek w drugim etapie ekspresji genomu; określane jako transkryptom. Cząsteczki mRNA są nietrwałe i ulegają degradacji wkrótce po syntezie.

RNA niekodujący:

• RNA rybosomowy, rRNA (ribosomal RNA) – stanowi ponad 80% całego RNA w aktywnie dzielących się bakteriach; jest składnikiem rybosomów,

• RNA transportujący, tRNA (transfer RNA) – małe cząsteczki, które biorą udział w syntezie białka dostarczając aminokwasy do rybosomu i zapewniając ich łączenie się w kolejności zapisanej w sekwencji nukleotydowej mRNA.

Regulacje translacji na poziomie RNA:

• działanie niekodujących RNA,

• modyfikacje pre-RNA do form, które podlegają translacji,

• kontrola degradacji mRNA,

• kontrola translacji mRNA przez białka regulatorowe,

• przyłączanie antysensownego RNA do mRNA w celu zablokowania translacji,

• preferencyjna translacja określonych klas mRNA poprzez zmiany rybosomów.

Małe niekodujące cząsteczki RNA

Spełniają istotną rolę w regulacji ekspresji genów. Łącząc się wiązaniami wodorowymi z komplementarnymi odcinkami mRNA modulują pozytywnie lub negatywnie, procesy transkrypcji lub translacji i wpływają na stabilność mRNA. Niektóre poprzez oddziaływanie z białkami decydują o ich aktywności. Małe tmRNA (pełnią funkcje tRNA i mRNA) kontrolują jakość powstających polipeptydów.

Wiele RNA jest syntetyzowanych wyjściowo jako RNA prekursorowy (pierwotny transkrypt), czyli pre-RNA, który podlega dojrzewaniu.

Typy dojrzewania:

• modyfikacje końców, zachodzące w czasie syntezy mRNA. Do końca 5’ mRNA jest dołączany pojedynczy, nietypowy nukleotyd, zwany czapeczką, a do końca 3’ – łańcuch poli(A),

• składanie polegające na usuwaniu intronów z pre-RNA poprzez reakcje cięcia i łączenia,

• cięcie pre-RNA i pre-tRNA na kawałki,

• modyfikowanie chemiczne – cząstki rRNA i tRNA powstają poprzez dołączenie do specyficznych nukleotydów nowych grup chemicznych. Modyfikacje chemiczne mRNA (redagowanie RNA) występują tylko u kilku grup eukariotów.

Synteza bakteryjnych mRNA

Cząsteczki bakteryjnego mRNA nie podlegają dojrzewaniu – pierwotny transkrypt syntetyzowany przez polimerazę RNA jest od razu dojrzałym mRNA i zwykle jeszcze przed zakończeniem transkrypcji rozpoczyna się jego translacja.

Synteza i dojrzewanie eukariotycznych mRNA

Eukariotyczne mRNA podlegają dojrzewaniu już w czasie trwania ich syntezy.

Etapy dojrzewania:

• dodawanie czapeczki,

• poliadenylacja,

• składanie,

• redagowanie.

Tworzenie się czapeczki

Proces tworzenia się czapeczki jest kilkuetapowy i rozpoczyna się natychmiast po wydostaniu się końca 5’ pre-mRNA z kompleksu transkrypcyjnego polimerazy RNA II. Synteza czapeczek dotyczy mRNA i niektórych snRNA.

Czapeczka bierze udział w transkrypcji mRNA. Zwiększa stabilność cząsteczek mRNA chroniąc końce 5’ przed fosfatazami i nukleazami. Transkrypty polimeraz RNA II i III nie mają czapeczek.

Etapy:

• dołączenie dodatkowej guanozyny (G) do końca 5’ RNA przeprowadzane przez transferazę guanylilową,

• przekształcanie nowopowstałej końcowej guanozyny w 7-metyloguanozynę przez przyłączenie grupy metylowej do azotu 7 w łańcuchu purynowym (katalizowane przez metylotransferazę guaninową) -> czapeczka typu 0 (u drożdży),

• u wyższych eukariotów zachodzą dodatkowe modyfikacje:

  • druga metylacja zastępuje wodór w grupie 2’ –OH drugiego nukleotydu w transkrypcie -> czapeczka typu 1,

  • jeżeli drugim nukleotydem jest adenozyna, grupa metylowa może być dodana do azotu 6 puryny,

  • może zajść metylacja 2’ –OH trzeciego nukleotydu -> czapeczka typu 2.

Poliadenylacja

Poliadenylacja połączona jest z terminacją transkrypcji. Nukleotydy A są dodawane (w liczbie do 250) do transkryptu przez polimerazę poli(A) niezależną od matrycy. Miejscem działania tej polimerazy nie jest koniec 3’ transkryptu, lecz miejsce wewnętrzne, które zostaje przecięte z wytworzeniem nowego końca 3’, do którego dodawany jest łańcuch poli(A). System poliadenylacji jest specyficzny dla polimerazy RNA II.

U ssaków w poliadenylacji bierze udział sekwencja sygnałowa 5’-AAUAAA-3’, która znajduje się między 10 a 30 nukleotydem przed miejscem poliadenylacji. Przed nią często znajdują się nukleotydy 5’-CA-3’. W odlegości 10-20 nukleotydów od niego jest region bogaty w GU. Są to miejsca wiązania się wieloskładnikowych kompleksów białkowych, niezbędnych do zajścia poliadenylacji.

Sekwencja typowego miejsca adenylacji

Ogon poli(A) zabezpiecza cząsteczki RNA przed strawieniem przez nukleazy. Długość życia cząsteczki mRNA zależy częściowo od szybkości degradacji jej ogona poli(A).

Składanie – splicing RNA

Aby transkrypt mógł funkcjonować jako dojrzały mRNA introny muszą zostać wycięte, a eksony połączone w poprzecznym porządku. W większości intronów pre-mRNA pierwszymi dwoma nukleotydami są 5’-GU-3’, a dwoma ostatnimi 5’-AG-3’ -> introny GU-AG.

Etapy wycinania intronów

• cięcie po stronie 5’ intronu zapoczątkowuje grupa hydroksylowa przyłączona do węgla 2’ nukleotydu adenozynowego w obrębie sekwencji intronu. Intron zwija się w pętlę, tworząc strukturę lassa (koniec 5’ odciętego intronu zostaje kowalencyjnie połączony z nukleotydem adenylowym),

• cięcie po stronie 3’ intronu – wolna grupa 3’ –OH poprzedzającego eksonu atakuje wiązanie fosfodiestrowe w miejscu 3’ (na początku sekwencji drugiego eksonu) – uwolniony intron ulega degradacji, a eksony łączą się poprzez ligację

Ze względu na znaczną odległość między miejscami wycinania intronu i podobieństwo wszystkich miejsc wycinania, może nastąpić:

• pominięcie eksonu,

• wybranie kryptycznego miejsca wycinania (miejsca w obrębie eksonu lub intronu, które wykazuje podobieństwo sekwencji do motywów najwyższej zgodności dla właściwych miejsc wycinania),

Synteza i dojrzewanie RNA niekodujących

Bakterie syntetyzują trzy rodzaje rRNA: 5S, 16S, 23S. Trzy geny tych rRNA są połączone w jednostkę transkrypcyjną. Aby uwolnić dojrzałe rRNA prekursorowa cząsteczka RNA musi zostać pocięta.

U eukariotów istnieją cztery rodzaje rRNA: 5S, 5,8S, 18S, 28S.

5S RNA podlega transkrypcji przez polimerazę RNA III i nie dojrzewa. Pozostałe trzy rRNA powstają w wyniku transkrypcji przez polimerazę RNA I z jednej jednostki transkrypcyjnej i podlegają dojrzewaniu przez cięcie i przycinanie końców.

Zarówno u bakterii jak i u eukariotów geny tRNA występują pojedynczo jako wielogenowa jednostka transkrypcyjna (u bakterii także w obrębie jednostki transkrypcyjnej rRNA). Pre-tRNA podlegają obróbce przez serię rybonukleaz.

Sekwencja tRNA u E. coli dzięki komplementarnym parom zasad w pierwotnym transkrypcie przybiera strukturę „liścia koniczyny”, a z każdej strony tworzy się dodatkowa struktura „spinki do włosów”. Dojrzewanie rozpoczyna się cięciem dokonywanym przez RNazy E i F tuż przed spinką do włosów na końcu 3’, a RNaza P dokonuje cięcia na początku liścia koniczyny przy końcu 5’. RNaza D usuwa następnie dalsze nukleotydy na końcu 3’, a nukleotydylotransferaza tRNA dodaje sekwencję 5’-CCA-3’.

Alternatywne dojrzewanie mRNA

Dojrzewanie alternatywne to przekształcanie pre-mRNA w więcej niż jeden rodzaj dojrzałego mRNA.

Może ono zachodzić w wyniku:

• kontrolowania transkrypcji przez kilka promotorów, wymuszających alternatywny przebieg splicingu,

• obecność więcej niż jednego miejsca poli(A),

• pozostawiania określonych intronów,

• pozostawiania lub usuwania określonych eksonów.

Dojrzewanie pre-RNA przez modyfikację chemiczną

Ostatnim typem obróbki, któremu podlega pre-RNA jest modyfikacja chemiczna nukleotydów w obrębie transkryptu. Znanych jest ponad 50 różnych modyfikacji. W tRNA zmianom podlega co dziesiąty nukleotyd. Modyfikacje te pośredniczą w rozpoznawaniu poszczególnych tRNA przez enzymy, które dołączają do nich aminokwasy i zwiększają zasięg oddziaływań między tRNA i kodonami w czasie translacji.

Przykłady modyfikacji chemicznych w rRNA i tRNA:

• metylacja – dodanie jednej lub więcej grup –CH₃ do zasady lub cukru,

• deaminacja – usunięcie grupy aminowej –NH₂ z zasady,

• podstawienie siarki – zastąpienie tlenu przez siarkę,

• izomeryzacja zasady – zmiana pozycji atomów w pierścieniu wchodzącym w skład zasady,

• nasycenie wiązania podwójnego – przemiana wiązania podwójnego w pojedyncze,

• zamiana nukleotydu – zamiana istniejącego nukleotydu na inny.

Modyfikacje chemiczne nukleotydów rRNA i tRNA jako sekwencji niekodujących, wpływają jedynie na właściwości strukturalne cząsteczek. W przypadku mRNA modyfikacje takie stwarzają możliwość zmiany właściwości kodujących transkryptu, prowadząc do zmiany sekwencji aminokwasowej zakodowanego białka.

Degradacja mRNA

Degradacja mRNA jest ważnym sposobem regulowania ekspresji genomu. Tempo degradacji można oszacować oznaczając okres półtrwania mRNA w komórce:

• bakterie – kilka minut,

• drożdże – 10-20 minut,

• ssaki – kilka godzin.

U bakterii mRNA jest degradowany przez kompleks multienzymatyczny zwany degradosomem. Zawiera on endonukleazy, które dokonują cięć wewnątrz cząsteczki i egzonukleazy, które usuwają kolejno nukleotydy z końców 3’ i 5’.

• endonukleaza – enzym rozrywający wiązania fosfodiestrowe w cząsteczce kwasu nukleinowego,

• egzonukleaza –enzym usuwający nukleotydy z końców cząsteczki kwasu nukleinowego.

U eukariotów (drożdży) istnieją dwa szlaki degradacji mRNA:

• szlak zależy od deadenylacji, który włącza się poprzez usunięcie łańcucha poli(A), po czym następuje odcięcie czapeczki i szybkie trawienie egzonukleolityczne od końca 5’ mRNA,

• szlak niezależny od deadenylacji, indukowany przez obecność w mRNA kodonu terminacji, który uniemożliwia prawidłową translację. Służy przede wszystkim do degradacji cząstek mRNA, które zostały zmienione w wyniku mutacji lub nieprawidłowego składania.

Odpowiednie szlaki u wyższych eukariotów są słabiej poznane.