Replikacja DNA

Replikacja DNA polega na syntezie dwóch komplmentarnych dwuniciowych helis z jednej wyjściowej, przy czym obydwie nowe helisy mają sekwencję nukleotydową identyczną z helisą wyjściową. Jest procesem zapewniającym przekazywanie informacji genetycznej z komórek rodzicielskich do komórek potomnych.

UWAGA! Błędy powodujące powstanie mutacji pojawiają się w żywych organizmach średnio raz na 10^{9 –} 10¹⁰ prawidłowo włączonych nukleotydów.

Fazy replikacji DNA:

• inicjacja – obejmuje rozpoznanie miejsca (lub miejsc) w obrębie cząsteczki DNA, od którego replikacja się rozpoczyna,

• elongacja – obejmuje procesy związane z działaniem widełek replikacyjnych podczas kopiowania rodzicielskich łańcuchów polinukleotydowych,

• terminacja – jest procesem kończenia i ostatecznego kompletowania nowych łańcuchów DNA.

Do końca 3' rosnącego łańcucha DNA są dodawane preferencyjnie takie nukleotydy, których zasady mogą utworzyć komplementarną parę z zasadą zawartą w matrycy.

Jeśli oznaczymy obydwa łańcuchy DNA jako 5 i 5' to łańcuch 5 służy jako matryca do syntezy nowego łańcucha 5’, a 5’ jest matrycą dla syntezy nowego łańcucha 5. Otrzymuje się kolejne 2 cząsteczki DNA.

Aby pełnić funkcję matrycy helisa DNA musi zostać uprzednio rozpleciona. Proces replikacji zaczyna się od związania białek inicjujących, które zrywają wiązania wodorowe między zasadami (w normalnej temperaturze) i na pewnym odcinku oddzielają od siebie łańcuchy DNA.

Podstawowe reguły procesu replikacji DNA:

• replikacja jest semikonserwatywna,

• inicjacja replikacji zachodzi w ściśle określonych sekwencjach nukleotydów, zgromadzonych w specyficznych miejscach chromosomu, zwanych „origin”(ori),

• jednostką replikacji jest replikon,

• replikacja w ramach replikonu rozpoczyna się od jednego miejsca inicjacji i postępuje zwykle dwukierunkowo do miejsca terminacji,

• replikacja jest inicjowana przez krótkie odcinki RNA, służące jako startery dla polimerazy DNA,

• replikacja sterowana jest przez duże, wieloenzymatyczne kompleksy,

• terminacja replikacji może być zapisana w sekwencji genomu – sekwencje „terminus” (ter). Nie występują one u eukariotów, u których replikacja kończy się w momencie zetknięcia się widełek replikacyjnych podążających z przeciwnych kierunków.

Mechanizm semikonserwtywny

Każda z dwóch nici helisy DNA niesie tę samą informację – sekwencja ich zasad jest komplementarna. Podczas replikacji dwie nici rodzicielskie rozplatają się i każda działa jako matryca do prowadzenia syntezy nowej, komplementarnej nici potomnej. W efekcie powstają dwie identyczne, nowe cząsteczki DNA, z których każda zawiera jedną nić pierwotną i jedną nowo zsyntetyzowaną.

Inicjacja

Inicjacja zaczyna się zawsze w tym samym, ściśle określonym miejscu lub miejscach cząsteczki DNA (origin of replication). Kolisty genom bakteryjny zawiera tylko jedno miejsce inicjacji replikacji. Organizmy eukariotyczne mają wiele miejsc inicjacji aktywowanych jednocześnie. Miejsca inicjacji są bogate w pary AT, ponieważ ułatwia to ich otwieranie. Rozdzielające się w miejscu syntezy łańcuchy matrycowe tworzą tzw. „widełki replikacyjne”.

UWAGA!!! Nici matrycy czytane są w kierunku 3' ->5', podczas gdy nowe nici są syntetyzowane w kierunku 5' ->3'.

Synteza jednej nici DNA w widełkach replikacyjnych przebiega w kierunku 5' do 3' w sposób ciągły (nić wiodąca), a wydłużanie drugiej nici jest możliwe dzięki syntezie krótkich fragmentów Okazaki, również w kierunku 5' do 3', ale w odwrotna stronę niż ruch widełek replikacyjnych (nić opóźniona).

Bakteryjne fragmenty Okazaki mają długość 1000-2000 nukleotydów, natomiast w komórkach eukariotycznych nie przekraczają 200 nukleotydów. Sugeruje to, że u eukariota każdy odcinek Okazaki odpowiada replikacji fragmentu DNA obejmującego pojedynczy nukleosom. Fragmenty są łączone przez ligazę DNA.

Synteza DNA polega na ataku nuklofilowym grupy 3’-hydroksylowej z końca wydłużanej nici na grupę 5’- α-fosforanową kolejnego dNTP i utworzeniu wiązania kowalencyjnego. Jednocześnie uwalniana jest grupa pirofosforanowa (Ppi).

Białka uczestniczące w ruchu widełek replikacyjnych:

• helikazy – przesuwają się wzdłuż cząsteczki DNA tuż przed widełkami, rozplątując podwójną helisę,

• primazy – enzymy odpowiedzialne za syntezę starterów,

• SSB – (single-strand binding protein) – białko wiążące jednoniciowy DNA, zapobiega odtworzeniu podwójnej helisy przez jednoniciowe odcinki DNA po przejściu helikazy,

• polimerazy DNA:

  • E. coli: pol DNAIII – odpowiada za syntezę nici DNA,

  • E. coli: pol DNA I – usuwa startery i wypełnia brakujące fragmenty nici DNA,

  • ssaki:

    • α – synteza starterów,

    • β – naprawa DNA,

    • δ – synteza nici wiodącej,

    • ε – synteza nici opóźnionej.

• topoizomerazy – znoszą naprężenie torsyjne, powstające na skutek rozkręcania DNA przez helikazę. Topoizomeraza I przecina jedną nić DNA, umożliwiając jej obrót wokół drugiej nici; topoizomeraza II przecina obie nici tworząc „bramkę”, przez którą zostaje przesunięty cały sąsiedni fragment podwójnej helisy.

Helikaza + primaza = prymosom (syntezuje startery RNA i rozmieszcza je na nici opóźnionej),

Prymosom + polimeraza DNA III = replisom (kompleks zawierający w sobie wiekszości funkcji enzymatycznych związanych z replikacją).

Replikon – każdy odcinek DNA, który replikuje się jako pojedyncza jednostka. Zawiera miejsce inicjacji replikacji oraz wszystkie sekwencje fizycznie do niego przylegające, które są pod kontrolą i replikują się razem z nim.

W bakteriach replikon obejmuje cały chromosom – pojedyncze miejsca inicjacji; kontroluje replikację całego genomu. W chromosomach organizmów eukariotycznych, jako że replikacja rozpoczyna się jednocześnie w wielu miejscach inicjacji rozmieszczonych wzdłuż chromosomowego DNA, istnieje wiele replikonów w każdym chromosomie.

Synteza DNA zaczyna się od budowania krótkich odcinków RNA o wolnych grupach końcowych 3'-OH (starterów), do których polimerazy DNA dołączają kolejne trifosfonukleotydy.

Synteza startera na nici prowadzącej zachodzi tylko jeden raz – replikacja raz rozpoczęta może być kontynuowana bez przerwy aż do końca matrycy. Na nici opóźnionej synteza starterów musi być procesem powtarzalnym, zachodzącym przy każdej inicjacji nowego fragmentu Okazaki.

Przed połączeniem fragmentów Okazaki w jedną ciągłą nić startery są wycinane i usuwane, a powstałe przerwy uzupełniane.

Terminacja

Bakterie wykształciły system zabezpieczający widełki replikacyjne przed przekroczeniem obszaru terminacji przez specyficzne sekwencje terminatorowe. E. coli posiada siedem sekwencji terminatorowych, rozpoznawanych przez białko wiążące się z tymi sekwencjami, Tus. Tus pozwala na przejście widełek replikacynych tylko w jednym kierunku, natomiast zatrzymuje widełki posuwające się w kierunku przeciwnym.

W komórkach eukariotycznych nie znaleziono sekwencji terminatorowych, ani białek o budowie zbliżonej do Tus. Prawdopodobnie widełki eukariotyczne mogą się spotykać w miejscach przypadkowych, a terminacja zachodzi wskutek łączenia się końców nowo syntetyzowanych łańcuchów polipeptydowych.

Przyczyny powodujące skracanie zakończeń dwuniciowych linearnych cząsteczek DNA podczas replikacji:

• zakończenie nici opóźnionej od strony 3' nie może być kopiowane w procesie replikacji, ponieważ ostatni fragment Okazaki nie może być zainicjowany w warunkach, gdy miejsce budowy stratera musiałoby się znajdować poza końcem matrycowego DNA (startery są syntezowane na matrycy nici opóźnionej w pozycjach odległych o ok. 200 nukleotydów),

• nawet jeśli ostatni fragment Okazaki zostanie jednak zbudowany na końcu 3' matrycy nici opóźnionej, to i tak skracanie cząsteczki będzie postępowało, chociaż z mniejsza szybkością. Końcowy starterowy odcinek RNA nie może byc przekształcony w DNA za pomocą standardowego procesu usuwania starterów (brak końcowej wolnej grupy 3’-OH).