Real time PCR (PCR w czasie rzeczywistym)
Real time PCR jest metodą PCR, którą można oznaczać ilość DNA lub RNA w badanej próbie przy pomocy produktów powstających w wyniku ich syntezy na matrycy oznaczanego DNA lub RNA. Metoda oparta jest na wykrywaniu i ilościowym oznaczaniu fluorescencyjnego znacznika. Poziom emisji fluorescencyjnej jest wprost proporcjonalny do ilości powstającego produktu PCR. Poprzez mierzenie poziomu emisji fluorescencji w każdym cyklu PCR możliwe jest monitorowanie reakcji PCR.
Ilościowe oznaczanie amplifikowanej sekwencji wykonuje się za pomocą: (1) wprowadzenia do DNA barwników fluorescencyjnych,
(2) „boji molekularnych” (molecular beacon) – sond z markerami fluorescencyjnymi.
Metoda nie wymaga rozdziału elektroforetycznego produktów PCR. Charakteryzuje się daleko posuniętą automatyzacją i niewielką pracochłonnością.
Nieswoista detekcja SYBR Green
W czasie annealingu cząsteczki barwnika fluorescencyjnego (SYBR Green) przyłączają się do dwuniciowego fragmentu starter-matryca i emitują promieniowanie. W czasie polimeryzacji coraz więcej cząsteczek fluorochromu przyłącza się do dwuniciowego DNA, a zwiększająca się fluorescencja może być monitorowana w realnym czasie.
Molecular beacons – „boje molekularne”
Sonda molekularna posiada na końcu 5’ i 3’ komplementarne sekwencje utrzymujące ją w strukturze szpilki do włosów. W formie niehybrydyzowanej barwniki reporterowy i wygaszający, umieszczone na końcach 5’ i 3’, znajdują się blisko siebie i fluorescencja jest tłumiona. W formie zhybrydyzowanej, wskutek rozdzielenia barwników, dochodzi do wzrostu fluorescencji.
Podczas annealingu, gdy temperatura się obniża, „boje” przyczepiają się do matrycowego DNA i generują fluorescencję.
Gdy temperatura się podwyższa i rozpoczyna się polimeryzacja, „boje” się odłączają i fluorescencja zanika.
Pomiar w czasie rzeczywistym
Po każdym cyklu qrtPCR (quantitative real time PCR – ilościowa amplifikacja DNA = PCR) mierzony jest względny poziom fluorescencji w określonym zakresie widma, odpowiadającym wybranemu fluorochromowi, a wartości nanoszone są na wykres. Jeśli reakcja wykonana jest prawidłowo, wykresy przedstawiają równoległe krzywe sigmoidalne o identycznym nachyleniu. Na ich podstawie można porównać ekspresję badanego genu (np. w różnych tkankach, albo po zadziałaniu stresu) i wyliczyć liczbę kopii genu.
Reakcja łańcuchowa polimerazy poprzedzona procesem odwrotnej transkryptazy RT-PCR
Metoda stosunkowo prosta i powszechnie stosowana do szukania tran skryptów w totalnym RNA Pierwszy etap polega na syntezie cDNA komplementarnego do mRNA, katalizowanej przez odwrotną transkryptazę. Następnie na matrycy cDNA powielany jest odcinek DNA, którego końce są komplementarne do sekwencji starterów. Reakcja przebiega jak w typowym PCR, a jej produkt poddawany jest elektroforezie na żelu agarozowym i wizualizowany w ultrafiolecie. Reakcja może być też monitorowana w czasie rzeczywistym → real time RT-PCR.
Wybrane metody wykorzystujące PCR:
RAPD,
AFLP,
SSCP,
SSR i ISSR,
IRAP i REMAP.
Technika losowo wzmocnionego polimorficznego DNA (RAPD; random amplifies polymorphic DNA)
Jest to metoda otrzymywania markerów molekularnych z wykorzystaniem PCR. Pozwala na szybkie wykrycie różnic w sekwencji DNA na obszarze całego genomu. Po wyizolowaniu, całkowite DNA badanego osobnika stanowi matrycę amplifikacji. W kolejnych cyklach PCR, 9- lub 10-nukleotydowe startery o dowolnie wybranej sekwencji przyłączają się do genomowego DNA.
Do namnożenia fragmentów dochodzi w miejscach, gdzie sekwencja cząsteczki startera pozwala na jego przyłączenie do komplementarnych nici DNA. Kilkadziesiąt cykli reakcji amplifikacji prowadzi do namnożenia kilku lub kilkunastu fragmentów DNA, z których każdy posiada określoną długość. Produkty reakcji poddaje się elektroforezie na żelu agarozowym.
Polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów (AFLP; amplified fragments lenght polymorphism)
Metoda umożliwiająca fingerprinting DNA; łączy zalety PCR i RFLP. W pierwszym etapie trawi się oczyszczone DNA dwoma enzymami restrykcyjnymi. Jeden z enzymów, rozpoznający sekwencje sześcionukleotydowe, przycina dwuniciowy DNA znacznie rzadziej niż drugi enzym, właściwy dla sekwencji czteronukleotydowych. Do tak otrzymanych fragmentów restrykcyjnych, przyłącza się z obu stron krótkie adaptery. Dwa startery, służące do preamplifikacji mają sekwencję komplementarną do części adaptorowej i miejsca restrykcyjnego oraz jeden selekcyjny nukleotyd na końcu 3’. Zadaniem nukleotydów selekcyjnych jest ograniczenie liczby amplifikowanych fragmentów.
Po wstępnej amplifikacji, w mieszaninie reakcyjnej znajdują się liczne fragmenty DNA, które po rozcieńczeniu stanowią matrycę do właściwej, selektywnej amplifikacji. Do tej reakcji używa się starterów różniących się od tych z pierwszej fazy obecnością dwóch dodatkowych nukleotydów selekcyjnych na końcach 3’. Starter wiążący się z miejscem restrykcyjnym pierwszego enzymu jest wyznakowany izotopem 32P. Powielone fragmenty zostają rozdzielone w sekwencyjnym, denaturującym żelu poliakrylamidowym. Autoradiogram składa się na ogół z 50-100 prążków.
Ze względu na dużą rozdzielczość i wiarygodność AFLP jest wykorzystywany do identyfikacji odmian hodowlanych.
Polimorfizm konformacji jednoniciowych DNA (SSCP; single stand conformation polymorphism)
Technika umożliwiająca wykrywanie punktowych mutacji DNA. Materiałem wyjściowym są produkty PCR, które przed elektroforezą na żelu poliakrylamidowym denaturuje się termicznie w buforze obciążającym z dodatkiem czynnika denaturującego (formamidu, mocznika lub wodorotlenku sodowego). Jednoniciowa cząsteczka DNA tworzy wewnętrzne sparowania, przez co przyjmuje określoną konformację przestrzenną, zależną od sekwencji nukleotydów.
Fragment z mutacją tworzy odmienny od prawidłowych wzór prążków SSCP, ponieważ tworzy inne konformery, migrujące ze zmienioną szybkością. Do detekcji konformerów wykorzystuje się najczęściej reakcję srebrzenia, radioizotopy lub znaczniki fluorescencyjne, rzadziej bromek etydyny (reakcja barwienia ze
Metoda wykorzystywana do wykrywania chorób dziedzicznych.
Markery SSR i ISSR
SSR (simple sequence repeats) – proste sekwencje powtarzalne, amplifikowane sekwencje mikrosatelitarne (→ TR, SSLP).
Etapy:
przeszukiwanie biblioteki genomowej DNA przy użyciu sond zawierających sekwencję mikrosatelitarną,
sekwencjonowanie klonu wyznakowanego przez sondę w celu identyfikacji sekwencji flankujących mikrosatelitę,
zaprojektowanie pary specyficznych starterów o długości ok. 20nt komplementarnych do końców mikrosatelity,
reakcja PCR,
rozdzielenie produktów na żelu poliakrylamidowym i wybarwienie azotanem srebra lub barwnikami fluorescencyjnymi.
Kodominacja i wysoki stopień polimorfizmu pozwalają na identyfikację wielu alleli u poszczególnych loci SSR. Markery SSR są także opracowywane in silico na podstawie analizy sekwencji DNA zawartych w bazach danych.
ISSR (inter simple sequence repeat) – polimorfizm odcinków DNA pomiędzy mikrosatelitami.
Metoda generowania złożonych obrazów prążkowych. Stosowany jest jeden starter o długości 17-18nt, na który składa się sekwencja powtórzona i 1-2 nukleotydy selekcyjne na końcu 3’ (warunkują przyłączanie startera do miejsca styku mikrosatelity z unika torowym DNA). Alternatywnie starter może być zakotwiczony na końcu 5’ za pomocą 2-3 nukleotydów. Po reakcji PCR liczne produkty amplifikacji rozdziela się na żelu.
Polimorfizm odcinków DNA pomiędzy retrotranspozonami
Niektóre retrotranspozony mają na końcach długie terminalne powtórzenia (LTR; long terminal repeats). W metodzie IRAP (inter-retrotranspozons amplified polymoprhism), polimorfizm odcinków DNA pomiędzy transpozonami, specyficzny starter przyłącza się do LTR końcem 3’ na zewnątrz. Do amplifikacji metodą PCR dochodzi wtedy, gdy długość sekwencji flankowanych transpozonami nie przekracza 3kpz. Produkty rozdziela się na żelu.
Retrotranspozony mogą też występować w niewielkich odległościach od mikrosatelitów. Polimorfizm odcinków DNA pomiędzy retrotranspozonem a mikrosatelitą (REMAP; retrotransposon-mikrosatelite amplified polymorphism) można identyfikować przez amplifikacje DNA z wykorzystaniem startera specyficznego dla LTR i startera mikrosatelitarnego, zakotwiczonego na końcu 3’ lub 5’. Kończy się elektroforezą na żelu, w celu rozdzielenia produktów amplifikacji.
Wieloprążkowe układy markerów IRAP i REMAP pozwalają na profilowanie DNA – mogą być wykorzystywane do identyfikacji odmian i linii.
Mikromacierze DNA (microarrays)
Mikromacierze DNA wykorzystują tę samą zasadę, jaka jest wykorzystywana w northern blotting, ale na zacznie większą skalę i stosując inną technikę. Technika ta pozwala jednocześnie analizować ekspresję wszystkich genów funkcjonujących w danej komórce, czyli jej transkryptomu.
Schemat doświadczenia jest tu odwrócony w stosunku do northern blotting – fragmenty DNA odpowiadające poszczególnym genom i będące sondami są unieruchomione w określonych miejscach na stałym podłożu, a znakowane są pochodzące z próby cząsteczki RNA lub DNA, które znajdują się w fazie ciekłej.
Mikromacierz DNA jest stałą, szklaną powierzchnią, na której unieruchomiona jest duża liczba cząsteczek komplementarnego DNA (cDNA) reprezentujących totalny RNA z określonej komórki lub tkanki.
Sonda cDNA (mikropłytka)
Cząsteczki cDNA otrzymuje się przez odwrotną transkrypcję wykazującego ekspresję mRNA, za pomocą odwrotnej transkryptazy, dzięki czemu tworzą się cząsteczki dwuniciowe, które reprezentują całkowitą populację wykazującego ekspresję mRNA w bardziej stabilnej strukturze dupleksu DNA.
Następnie to cDNA jest namnażane poprzez wklonowanie go do wektora lambda, który infekuje komórki bakterii.
Kiedy cDNA zostaje ponownie wyizolowany z komórek bakterii, może być zsekwencjonowany i następnie „wydrukowany” na szklanej płytce jako sonda. Sondy są drukowane przy użyciu robota.
Elementy macierzy
Sondy są umieszczane przez robota jako siatka macierzy na standardowym podstawkowym szkiełku mikroskopowym. Jedna sonda zajmuje powierzchnię około 200 mikronów. Oznacza to, że na standardowym szkiełku można umieścić 25 tysięcy elementów. Szkiełko po rozmieszczeniu sond jest pokrywane warstwą ochronną (najczęściej polilizyną), w celu unieruchomienia DNA.
Wyznakowanie badanej próby
Cząstki mRNA są izolowane z badanej tkanki/tkanek. Mogą być one izolowane w funkcji czasu lub określonych czynników doświadczenia.
mRNA kontrolne i badane są oddzielnie wyznakowywane fluorescencyjnie poprzez odwrotną transkrypcję w obecności dwóch różnych fluorochromów (Cy3 i Cy5, sprzężone z dUTP).
Hybrydyzacja
Te dwie populacje wyznakowanego mRNA są następnie poddawane procesowi hybrydyzacji do szkiełka zawierającego elementy cDNA. Hybrydyzacja odbywa się w wilgotnej komorze w temperaturze 60°C. Następnie szkiełko jest płukane w celu usunięcia nadmiaru i niezwiązanych fragmentów. Szkiełko jest gotowe do skanowania.
Pomiar intensywności sygnału z obrazu
Intensywność sygnału jest wyliczana przez komputer dla poszczególnych punktów po wyeliminowaniu tła.
Wartości intensywności zależą od ilości mRNA (wykazującego ekspresję genu) w określonych warunkach doświadczenia. Aby uzyskać wartości właściwe trzeba je porównać do intensywności sygnałów w kontroli. Uzyskuje się to obliczając współczynnik między tymi dwoma sygnałami. Współczynnik ten informuje o poziomie regulacji ekspresji genu.