Techniki biologii molekularnej

Badanie cząsteczek DNA

Ponieważ gen nie występuje w komórce jako odrębna jednostka, a stanowi część cząsteczki DNA, trudne jest jego wyizolowanie i scharakteryzowanie. Jest to możliwe dzięki nukleazom restrykcyjnym.

Nukleaza restrykcyjna – enzym bakteryjny, który katalizuje hydrolizę wiązań fosfodiestrowych w kwasach nukleinowych w miejscach określonych przez krótkie sekwencje nukleotydów.

Enzymy restrykcyjne rozcinają cząsteczki obcego DNA, natomiast komórkowy DNA danego organizmu nie ulega degradacji przez własne enzymy restrykcyjne – miejsca przez nie rozpoznawane są w tym DNA zmetylowane przez enzym modyfikujący – metylazę.

Określony enzym restrykcyjny zawsze rozcina daną cząsteczkę DNA w tym samym miejscu. Tak więc próbka DNA, pochodząca na przykład z tkanki ludzkiem, poddana działaniu określonej nukleazy restrykcyjnej zawsze daje ten sam zestaw fragmentów DNA.

Fragmenty uzyskane po cięciu DNA nukleazami restrykcyjnymi można rozdzielić za pomocą elektroforezy żelowej. Ponieważ DNA ma ujemny ładunek elektryczny, fragmenty nałożone na żel migrują do dodatnio naładowanej elektrody. Fragmenty rozdzielają się według długości – dłuższe migrują wolniej niż krótsze.

Przez porównanie długości fragmentów DNA, powstających w rezultacie trawienia określonej cząsteczki DNA za pomocą różnych kombinacji nukleaz restrykcyjnych, można skonstruować fizyczną mapę tej cząsteczki, ujawniającą rozmieszczenie poszczególnych miejsc restrykcyjnych → mapy restrykcyjne.

Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP; restriction fragment lenght polymorphism)

Opiera się na zasadzie, że niektóre miejsca restrykcyjne w generowanym DNA są polimorficzne – występują jako dwa allele:

• mający prawidłową sekwencję dla miejsca restrykcyjnego i w związku z tym cięty podczas trawienia enzymem restrykcyjnym,

• z taką zmianą, że miejsce restrykcyjne nie jest rozpoznawane.

Różnice sekwencji, określone jako polimorfizm sekwencji, wynikają z różnego rodzaju mutacji punktowych, delecji, insercji i przemieszczeń odcinków DNA. Ponieważ znaczna część DNA w genomie eukariotycznym to sekwencja niekodująca, polimorfizm sekwencji najczęściej nie wpływa na informację genetyczną. Różnice te można jednak wykorzystać jako „punkty orientacyjne” określonych miejsc genomu.

Nie wszystkie miejsca restrykcyjne są polimorficzne!!

W celu oznaczenia RFLP niezbędne jest określenie wielkości tylko jednego lub dwóch pojedynczych fragmentów restrykcyjnych na tle wielu innych fragmentów. Techniki umożliwiające wykrycie pojedynczych fragmentów:

• hybrydyzacja metodą Southerna,

• reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR).

Polimorfizm długości prostych sekwencji (SSLP; Simple sequences lenght polymorphism)

SSLP są szeregami powtórzeń sekwencji, przejawiającymi różnice długości; a więc różnymi allelami zawierającymi różną liczbę jednostek powtarzalnych. W odróżnieniu od RFLP, SSLP może być wieloallelowe, bo każdy SSLP może mieć wiele różnych wariantów długości.

Typy SSLP:

• minisatelity – zmienna liczba powtórzeń tandemowych (VNTR; variable number of tandem repeats), z których jednostka powtarzalna ma kilkadziesiąt nt długości,

• mikrosatelity – proste powtórzenia tandemowe (STR; simple tandem repeats), w których powtórzeniami są jednostki 2-, 3- lub 4-nukleotydowe (10-30 kopii).

Polimorfizmy punktowe (SNP; single nucleotide polymorphism)

SNP stanowią bardzo licznie występujące w genomie pojedyncze mutacje punktowe. Zaletą SNP jest ich olbrzymia liczba i możliwość oznaczania metodami nie wymagającymi elektroforezy na żelu. Wykrywanie jest szybkie, opiera się na hybrydyzacji z oligonukleotydami.

Wykorzystując hybrydyzację można uzyskać następujące informacje dotyczące wyizolowanego fragmentu DNA (genu):

• z jakiego chromosomu pochodzi,

• gdzie jest zlokalizowany w chromosomie,

• w jakich komórkach organizm ulega transkrypcji,

• czy inne organizmy zawierają podobne geny,

• czy dana cząsteczka zawiera mutację.

Hybrydyzacja może zachodzić między dowolnymi pojedynczymi łańcuchami kwasów nukleinowych:

• DNA/DNA,

• RNA/RNA,

• RNA/DNA,

pod warunkiem, że zawierają one komplementarne sekwencje nukleotydów.

Aby uzyskać określoną sekwencję nukleotydową wśród innych sekwencji, należy najpierw przygotować fragment kwasu nukleinowego, zwany sondą. Sondą DNA może być krótki jednoniciowy oligonukleotyd DNA, zwykle o długości 10-1000 nt. Sondę stosuje się w reakcji hybrydyzacji do wykrywania cząsteczek kwasów nukleinowych, zawierających sekwencje komplementarne do sekwencji sondy.

Sondy hybrydyzacyjne mogą być znakowane:

• izotopowo (np. ³²P),

• fluorescencyjnie (np. digoksygeniną, fluoresceiną),

• za pomocą kompleksu biotyna-awidyna sprzęgniętego z enzymem katalizującym reakcję barwną lub z fluorochromem.

Metoda Southerna

Procedurę laboratoryjnę, za pomocą której można wykryć sekwencje komplementarne do stosowanej sondy, nazywamy hybrydyzacją Southerna (Southern blotting).

Etapy:

• mieszaninę dwuniciowych fragmentów DNA uzyskanych w wyniku trawienia DNA nukleazami restrykcyjnymi rozdziela się stosując elektroforezę,

• do żelu umieszczonego w zasadowym buforze (denaturacja DNA) przykłada się arkusz nitrocelulozy lub nylonu i przenosi się rozdzielone fragmenty DNA na arkusz,

• arkusz ze związanymi jednoniciowymi fragmentami DNA oddziela się od żelu,

• umieszcza się go w zamkniętym worku plastikowym wraz z buforem zawierającym promieniotwórczo znakowaną sondę DNA,

• arkusz płucze się i wykonuje autoradiografię.

Metoda hybrydyzacji northern

Northern blottin – metoda podobna do Southern blotting, ale stosowana jest do wykrywania specyficznych sekwencji RNA. Elektroforezie na żelu poddaje się cząsteczki mRNA, a jako sondy zwykle stosuje się jednoniciowe cząsteczki DNA.

Technologie przeszukiwania DNA wykorzystujące hybrydyzację:

• „chip” DNA – jest to silikonowa płytka, o powierzchni 2cm² lub mniejszej, niosąca wiele różnych gęsto poukładanych oligonukleotydów. Testowany DNA znakuje się znacznikiem fluorescencyjnym i pipetuje na powierzchnię płytki. Hybrydyzację wykrywa się oglądając „chip” pod mikroskopem fluorescencyjnym,

• Dynamiczna hybrydyzacja specyficzna dla allelu (DASH; dynamic allele-specific hybridization) – hybrydyzacja zachodzi w roztworze i wykrywana jest dzięki znacznikowi fluorescencyjnemu, wiążącemu się wyłącznie z dwuniciowym DNA. Rozróżnienie między allelami osiąga się podnosząc temperaturę po hybrydyzacji – hybrydy, w których nie wszystkie zasady tworzą pary, są mniej stabilne niż pełne hybrydy.

Biblioteki cDNA

cDNA – DNA komplementarny (complementary)

W wielu zastosowaniach technologii DNA korzystne jest uzyskiwanie klonu, który zawiera tylko kodujące sekwencje jakiegoś genu (bez intronów). Do tego celu wykorzystuje się biblioteki cDNA. Aby przygotować bibliotekę cDNA należy wyekstrahować z komórek całkowity mRNA i przygotować jego kopie za pomocą odwrotnej transkryptazy.

Klony cDNA zawierają nieprzerwane sekwencje kodujące, ale tylko tych genów, które ulegają transkrypcji na mRNA w tkance, z której pochodzi RNA – dla każdego rodzaju tkanki uzyskuje się inną bibliotekę cDNA. Biblioteki cDNA konstruuje się, aby uzyskać obraz zmian ekspresji genów w komórkach podczas różnych etapów ich rozwoju lub różnicowania się, albo w różnych warunkach doświadczenia.

Metoda łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR; polymerase chain reaction)

Metoda PCR służy do amplifikacji (namnożenia) określonych sekwencji DNA. Polega na wydłużaniu dwóch oligonukleotydowych starterów (primerów), komplementarnych do sekwencji leżących na końcach docelowego odcinka DNA. Startery są wydłużane w kierunku do siebie, za pomocą termo stabilnej polimerazy DNA (Taq).

Następujące po sobie etapy „przylepiania” starterów do jednoniciowego DNA, syntezy DNA w kierunku od końca 5’ do 3’ i denaturacji utworzonych dwuniciowych cząsteczek DNA, powtórzone wielokrotnie, prowadzą do zsyntetyzowania znacznych ilości DNA, na którego końcach leżą sekwencje odpowiadające użytym starterom.

Komponenty reakcji łańcuchowej polimerazy:

• polimeraza DNA (najczęściej termostabilna polimeraza Taq, izolowana z Thermus aquaticus),

• trifosforany wszystkich czterech deoksyrybonukleotydów (dNTP),

• bufor zawierający Mg²⁺,

• dwa oligonukleotydowe odcinki starterowe (primery; 15-40nt) o podobnej zawartości G+C i o niewielkiej wzajemnej komplementarności (szczególnie w rejonie 3’),

• docelowy odcinek DNA (matryca).

Cykl reakcji obejmuje etapy:

• denaturacji dwuniciowego DNA w 95°C,

• przyłączania (hybrydyzacja) starterów w 55-65°C (annealing),

• polimeryzacji (elongacji) DNA w 72°C.

Jeden cykl trwa ok. 5 minut. Zwykle przeprowadza się 20-30 cykli.